应用于焦磷酸测序的化学修饰引物介导的方向特异性单链dna制备方法
【专利摘要】本发明涉及应用于焦磷酸测序的化学修饰引物介导的方向特异性单链DNA制备。具体地说在PCR时一条引物用普通合成的引物，而另一条引物用可以抗酶切的化学修饰引物，PCR扩增后再利用有5’→3’切割功能的外切酶处理双链DNA，将未修饰的DNA单链消化掉，制备方向特异的单链模板DNA。应用这种方法制备单链DNA可以直接用于作为焦磷酸测序的模板，大大降低了焦磷酸测序的成本，减少了测序模板制备的繁琐步骤。
【专利说明】应用于焦磷酸测序的化学修饰引物介导的方向特异性单链 DNA制备
【技术领域】
[0001] 本发明属分子生物学领域；更具体地，本发明涉及应用于焦磷酸测序的化学修饰 引物介导的方向特异性单链DNA制备。
【背景技术】
[0002] 焦磷酸测序是不同于Sanger法的一种新型测序技术，它以单链DNA为模板，在 DNA聚合酶存在的情况下加入与模板互补的引物和dNTP时发生延伸反应，释放出相应量的 焦磷酸，在一系列底物的作用下产生与模板碱基数相应强度的荧光信号最终用于检测。与 Sanger法相比焦磷酸测序可以快速生成序列数据，并且具有极高的准确度和可重复性。目 前焦磷酸测序技术已经广泛应用于SNP检测、微生物分型、基因甲基化检测等领域，并且还 应用到高通量DNA测序中，使测序技术发生了革命性变化。
[0003] 焦磷酸测序需要单链的测序模板。目前，单链模板的制备主要应用链亲和素微球 固相法。链亲和素微球固相法的原理是，首先利用生物素标记的引物对目的DNA片段进行 PCR扩增，然后将扩增片段固定于链亲和素包被微球上，非生物素标记的链以NaOH变性，对 DNA链进行洗脱和冲洗，去除其他所有反应组分后，加入测序引物并退火形成纯的单链DNA 模板，该过程的操作步骤繁琐且效率低，昂贵的生物素标记引物、链亲和素包被微球的使用 提高了检测成本，复杂的抽真空系统增加了仪器成本，而且单链制备过程也易引起样品交 叉污染，这些问题严重影响了焦磷酸测序的应用和普及。
[0004] 因此，本领域迫切需要改进焦磷酸测序技术，特别是开发获得单链模板的新方法， 以简化操作难度和降低制备成本。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种化学修饰引物介导的方向特异性单链DNA制备方法。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种用于焦磷酸测序的单链DNA制备方法，所述方法 包括以下步骤：
[0007] (1)引物设计：根据目标DNA模板设计一对PCR扩增引物，其中一条扩增引物为普 通引物；另一条扩增引物为5'末端化学修饰的引物，其不会被具有5' 一 3'外切酶活性的 酶酶切；
[0008] (2)PCR扩增及酶切：利用⑴的扩增引物对目标DNA模板进行PCR扩增，获得扩 增产物，该扩增产物中一条链存在5'末端修饰，而另一条链5'末端没有修饰；利用具有 5' 一 3'外切酶活性的酶对扩增产物进行酶切，5'末端没有修饰的链被酶切降解，从而获得 带有5'末端化学修饰的单链DNA产物；和
[0009] (3)获得的单链DNA产物直接用于焦磷酸测序或sanger测序。
[0010]在一个优选例中，所述的DNA模板包括：（重）亚硫酸氢盐处理的DNA或非（重） 亚硫酸氢盐处理的DNA。
[0011] 在另一优选例中，所述的DNA模板包括：基因组DNA或DNA片段。
[0012]在另一优选例中，所述的5'末端修饰是5'末端3个碱基进行的化学修饰为硫代 磷酸化修饰或其它能够阻断核酸外切酶的化学修饰。
[0013] 在另一优选例中，所述的5'末端修饰为PCR扩增引物对中的正向引物修饰，或为 PCR扩增引物对中的反向引物修饰。
[0014] 在另一优选例中，所述的具有5' 一 3'外切酶活性的酶：T7DNA外切酶或Lamda核 酸外切酶或其它能够被化学修饰阻断的核酸外切酶。
[0015] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1、本发明实施方案中所描述的实验流程图。
[0017] 图2、本发明实施例1中所描述的实验原理图。
[0018] 图3、本发明实施例1中所描述的17外切酶对不同硫代产物酶切电泳图。
[0019] 图4、本发明实施例2中进行链亲和素微球固相法焦磷酸测序结果（4-1)和硫代引 物法焦磷酸测序结果（4-2)。
【具体实施方式】
[0020] 本发明提供了一种获得单链DNA的新方法，利用核酸的化学修饰可以抗拒酶切的 特性，在PCR时只将其中的一条引物进行化学修饰，再用具有5' 一 3'外切酶活性的17外 切酶处理PCR产物，最终得到可以进行焦磷酸测序的单链DNA。本发明的方法避免了传统焦 磷酸测序中昂贵的生物素标记引物和链亲和素包被微球的使用，大大降低了焦磷酸测序的 成本，减少了测序模板制备的繁琐步骤，简洁快速、节省成本。
[0021] 如本文所用，所述的"化学修饰"是指能够使核酸抵抗5' 一 3'外切酶酶切的修饰。 较佳地，所述的修饰是"硫代磷酸化修饰"。
[0022] 如本文所用，所述的"普通引物"是指未经修饰的引物，其由常规的A、T、C或G构 成。
[0023] 如本文所用，所述的"5'末端修饰"是指修饰位点存在于引物的5'末端处，较佳地 是5'端第1个碱基起至少连续3个碱基进行硫代磷酸化修饰。
[0024] 如本文所用，所述的"DNA模板"是指包含所需获得的目的单链序列的基因组DNA 或DNA片段，其通常是双链的。其可以是（重）亚硫酸氢盐处理的DNA或非（重）亚硫酸 氢盐处理的DNA。
[0025] 亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后测序（bisulfitesequencingPCR，BSP)方法是 检测基因中甲基化的经典方法，其原理为：用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理基因组DNA， 所有未发生甲基化的胞嘧啶（C)被转化为尿嘧啶（U)而发生甲基化的胞嘧啶则不变。因而， 经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理核酸后，甲基化的位点产生类似于一个C/T的多核苷 酸多态性（SNP)。基因组DNA经此处理后，扩增目的片段，此时尿嘧啶（U)全部转化为胸腺 嘧啶（T)，最后对PCR产物进行测序就可以判断是否发生甲基化。
[0026] 本发明的方法的创新性在于摈弃了目前单链模板的制备并被Qigen公司广泛采 用的链亲和素微球固相法。其操作步骤繁琐且效率低，昂贵的生物素标记引物、链亲和素包 被微球的使用提高了检测成本。
[0027] 基于本发明的新方法，本发明还涉及一种用于制备单链DNA的试剂盒，包含以下 组分：(a)根据DNA模板设计的一对PCR扩增引物，其中一条扩增引物为普通引物；另一 条扩增引物为5'末端修饰的引物，其不会被具有5' 一 3'外切酶活性的酶酶切；(b)具有 5' 一 3'外切酶活性的酶；较佳地为T7DNA外切酶。
[0028] 较佳地，所述的试剂盒中还包括：PCR反应缓冲液；酶切反应缓冲液；和/或测序 试剂等。更佳地还可包括说明应用上述试剂进行单链DNA制备及测序检测的使用说明书。
[0029] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0030] 实施例1、硫代引物PCR产物的酶切验证及原理说明
[0031] 为了验证硫代磷酸化修饰对PCR产物的保护效果，本发明人以重亚硫酸盐处理过 的基因组为模板，利用不同的PCR引物将硫代磷酸化修饰引入到PCR产物中去，最后制作出 末端具有不同硫代磷酸化修饰的PCR产物，如图2,包括四种：a.双端都没有硫代磷酸化修 饰，b.反向有硫代磷酸化修饰，c.正向有硫代磷酸化修饰，d.双端都有硫代磷酸化修饰。 图中N代表正常扩增产物而S代表硫代磷酸化修饰的扩增产物。
[0032] 重亚硫酸氢钠处理基因组DNA:
[0033] 使用Zymo-Research公司甲基化试剂盒处理基因组DNA，将1iig提取好的人类细 胞系293T基因组DNA加入130illCT转换试剂（CTConversionReagent)(含有重亚硫酸 氢钠）中，将瞬离后的样品放入PCR仪，设定反应程序如下：98°C，10min;64°C，2.5h;4°C， 00 O
[0034]将Zymo柱（Zymo-Spin(TM)ICColumn)放入收集管（CollectionTube)中， 加入600iUM-结合液（M-BindingBuffer)，然后加入反应后的样品，盖紧，颠倒混匀； 12,000rpm(〈10,000g)离心 30s;加入lOOu1M-清洗液（M-WashBufTer)，12,000rpm离心 30s;加入 200ii1M-脱磺化液（M-DesulphonationBuffer)，室温（20 ?30°C)静置 15 ? 20min，12,OOOrpm离心 30s;加入 200u1M-清洗液（M-WashBuffer)，12,OOOrpm离心 30s， 去除收集管中的废液；重复清洗一次；将柱子移入干净的1. 5mlEP管中，在柱子底部加入 10U1M-溶解液（M-ElutionBuffer)，12,OOOrpm离心 30s，洗脱液备用。
[0035] 应用的PCR引物如下：
[0036] 正向硫代引物F1:
【权利要求】
1. 一种用于焦磷酸测序的单链DNA制备方法，所述方法包括以下步骤： (1) 引物设计：根据目标DNA模板设计一对PCR扩增引物，其中一条扩增引物为普通引 物；另一条扩增引物为5'末端化学修饰的引物，其不会被具有5' 一 3'外切酶活性的酶酶 切； (2) PCR扩增及酶切：利用（1)的扩增引物对目标DNA模板进行PCR扩增，获得扩增产 物，该扩增产物中一条链存在5'末端修饰，而另一条链5'末端没有修饰；利用具有5'一 3' 外切酶活性的酶对扩增产物进行酶切，5'末端没有修饰的链被酶切降解，从而获得带有5' 末端化学修饰的单链DNA产物；和 (3) 获得的单链DNA产物直接用于焦磷酸测序或sanger测序。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DNA模板包括：（重）亚硫酸氢盐处 理的DNA或非（重）亚硫酸氢盐处理的DNA。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DNA模板包括：基因组DNA或DNA片 段。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5'末端修饰是5'末端3个碱基进行 的化学修饰为硫代磷酸化修饰或其它能够阻断核酸外切酶的化学修饰。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5'末端修饰为PCR扩增引物对中的 正向引物修饰，或为PCR扩增引物对中的反向引物修饰。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的具有5' 一 3'外切酶活性的酶：T7 DNA外切酶或Lamda核酸外切酶或其它能够被化学修饰阻断的核酸外切酶。
【文档编号】C12N15/10GK104342494SQ201410607086
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】于文强, 李晋, 李岩, 赵丽萍, 董世华 申请人:复旦大学