副溶血性弧菌免疫pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测副溶血性弧菌的经过特异性抗体包被的PCR反应管及免疫PCR检测试剂盒。所述的PCR反应管上预包被了能特异性富集样品中副溶血性弧菌的单克隆抗体。本发明的检测试剂盒能够快速、准确、灵敏地从食品等样品中检测出副溶血性弧菌，其灵敏度可达到103～104cfu/ml，比常规PCR灵敏度提高10～100倍。本发明将免疫学和分子生物学方法有机结合于一体，可在一个PCR管中实现样品中副溶血性弧菌的富集和检测，操作简便，成本低廉，检测快速，结果准确。CGMCC No80032013.07.16CGMCC No90102014.04.10
【专利说明】副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和免疫学领域，具体涉及一种检测副溶血性弧菌的免疫PCR 检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 副溶血性弧菌（Bibrioparahemolyticus)又称为副溶血弧菌，属于弧菌属，是一 种常见的病原菌。副溶血性弧菌是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，主要的栖息地在海水中。如 果食用了遭此菌污染的海鲜，会引发食物中毒；临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样 便为主要症状。目前副溶血性弧菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操 作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。
[0003] 免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但是检测产品全 部依赖进口，我国目前尚无拥有完全自主知识产权，且可运用于检测实践的快速检测产品， 该专利以副溶血性弧菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及金黄色葡萄球菌快速检测产 品。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于检测副溶血性弧菌的PCR反应管。
[0005] 本发明的另一个目的是提供一种用于检测副溶血性弧菌的免疫PCR检测试剂盒。
[0006] 本发明的第一方面是提供了一种用于检测副溶血性弧菌的PCR反应管，所述的 PCR反应管包括：
[0007] 免疫PCR管；和
[0008] 包被于所述的免疫PCR管管体内壁的抗副溶血性弧菌单克隆抗体，所述的抗副溶 血性弧菌单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7,CGMCCNo. 8003或3G9F7D5C9,CGMCC No. 9010 产生。
[0009] 本发明的第二方面是提供了一种检测试剂盒，所述的试剂盒含有所述的PCR反应 管。
[0010] 在一优选例中，所述的试剂盒还含有容器a，所述的容器a中装有所述的PCR反应 管。
[0011] 在另一优选例中，所述的试剂盒还含有缓冲液、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20、引物、 阳性对照和阴性对照。
[0012] 在另一优选例中，所述的引物包括正向引物和反向引物。
[0013] 在另一优选例中，所述的阳性对照为灭活的副溶血性弧菌菌液，所述的阴性对照 为灭菌的3 %氯化钠碱性蛋白胨水。
[0014] 本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求 的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是本发明的试剂盒的使用流程和原理图。
[0016] 图2是副溶血性弧菌直接PCR梯度稀释检测限研究结果。
[0017] 其中，M:IOOObpDNAladder;N:阴性对照；1-8号泳道对应的细菌浓度为： I.14XIO8?I.14X10cfu/mL。
[0018] 图3是副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒检测出血性大肠杆菌梯度稀释检测限研 究结果。
[0019] 其中，M:IOOObpDNAladder;N:阴性对照；1-8号泳道对应的细菌浓度为： I.14XIO8?I.14X10cfu/mL。
[0020] 图4是检测试剂盒特异性的结果。
[0021] 其中，M:1000bpDNAladder;N:阴性对照；1-12号泳道为：副溶血性弧菌ATCC 82346,副溶血性弧菌ATCC82346,金黄色葡萄球菌ATCC27660,鼠氏伤寒沙门氏菌ATCC 22956,肠炎沙门氏菌ATCC13076,单增李斯特菌ATCC43251，小肠结肠炎耶尔森氏菌 ATCC23715,福氏志贺氏菌ATCC12022,宋内氏志贺氏菌ATCC25931，痢疾志贺氏菌ATCC 51329,乙型溶血性链球菌ATCC10373,阪崎肠杆菌ATCC29004。
[0022] 图5是模拟带菌蛤蜊样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果。
[0023] A⑴模拟带菌蛤蜊样品直接PCR检测限研究结果；
[0024]A(2)模拟带菌蛤蜊样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；
[0025] 其中，M:IOOObpDNAladder;N:阴性对照；1号泳道为蛤蜊样品（不加菌液）；2-8 号泳道对应的细菌浓度为：1. 14XIO2?I.14X108cfu/mL。
[0026] 图6是模拟带菌螃蟹样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果。
[0027]B⑴模拟带菌螃蟹样品直接PCR检测限研究结果；
[0028]B(2)模拟带菌螃蟹免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；
[0029] 其中，M:1000bpDNAladder;N:阴性对照；1号泳道为螃蟹（不加菌液）；2_8号 泳道对应的细菌浓度为：1. 14XIO2?I. 14X108cfu/mL。
[0030] 图7是模拟带菌香肠样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果；
[0031] C⑴模拟带菌香肠样品直接PCR检测限研究结果；
[0032]C(2)模拟带菌香肠样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；
[0033] 其中，M:IOOObpDNAladder;N:阴性对照；1号泳道为香肠样品（不加菌液）；2_8 号泳道对应的细菌浓度为：1. 14XIO2?I.14X108cfu/mL。
[0034] 图8是模拟带菌鱼肉样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果。
[0035]D⑴模拟带菌鱼肉样品直接PCR检测限研究结果；
[0036] D(2)模拟带菌鱼肉样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；
[0037] 其中，M:IOOObpDNAladder;N:阴性对照；1号泳道为鱼肉样品（不加菌液）；2_8 号泳道对应的鱼肉浓度为：1. 14XIO2?I.14X108cfu/mL。
【具体实施方式】
[0038] 本发明人的研究表明，以副溶血性弧菌作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯化 得到抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9,其抗体效价可达到1:100000,其 能够特异性、高效地与副溶血性弧菌结合，检测灵敏度达到105cfu/ml。与单增李斯特、猪霍 乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、大肠杆菌0157:H7、阪崎 肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等共计77种病原细菌均无交叉反应。
[0039] 在此基础上，本发明人进而将致病菌免疫富集技术和基因水平检测技术有效结 合，即先用本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体将待测样品中的病原菌特异性免疫富集， 然后再进行PCR扩增，从而提供了一种可快速、高效检测食源性副溶血性弧菌的检测试剂 盒。
[0040] 抗体
[0041] 本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体可以利用小鼠杂交瘤细胞系 3G9E9G3H7(CGMCCNo. 8003)或 3G9F7D5C9(CGMCCNo. 9010)分泌产生。本发明包括具有抗 副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7或3G9F7D5C9的相应氨基酸序列的单克隆抗体，以及 具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超 变区（互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物（即 免疫偶联物及融合表达产物），只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少 90%同源性，较佳地至少95%同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物 包括：药物、毒素、细胞因子（cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与抗副溶 血性弧菌单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与抗副溶血性弧菌单 克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
[0042] 对于本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法 测定。抗副溶血性弧菌单克隆抗体V链的超变区或互补决定区（complementarity determiningregion,⑶R)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本 发明包括那些具有带⑶R的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其⑶R与抗副溶血 性弧菌单克隆抗体⑶R具有90%以上（较佳地95%以上）的同源性。本发明不仅包括完 整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或（Fab')2片段；抗体重链；抗 体轻链。
[0043] 本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以 用常规技术，利用杂交瘤细胞系3G9E9G3H7(CGMCCNo. 8003)或3G9F7D5C9(CGMCCNo. 9010) 获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
[0044] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。[0045] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0046]目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中己知的各种现有的DNA分子（或如载 体）和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0047] 本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这 些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0048] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。
[0049] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如出血性大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法 处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电 穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可运用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规 机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
[0050] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导） 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0051] 在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如 果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这 些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析（凝胶过 滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法 的结合。
[0052] 本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9,其效价高（可以达 到1:100000)，能够特异性地、高效地检测副溶血性弧菌，与单增李斯特、猪霍乱沙门、鼠伤 寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、大肠杆菌0157:H7、阪崎肠杆菌、小肠 耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等共计77种病原细菌均无交叉反应，此为本发明 的最大创新点。
[0053] 检测试剂盒
[0054] 本发明人根据免疫PCR的原理，制备了一种可用于检测样品中副溶血性弧菌的试 剂盒，即先用本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7或3G9F7D5C9将待测样品中 的病原菌特异性地免疫富集，然后再进行PCR扩增，以提高检测的灵敏度和特异性。
[0055] 具体而言，本发明首先是提供了一种用于检测副溶血性弧菌的PCR反应管，它包 括免疫PCR管和包被于所述免疫PCR管管体内壁的抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7 或3G9F7D5C9,所述的抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9分别由小鼠杂交 瘤细胞系 3G9E9G3H7,CGMCCNo. 8003 或 3G9F7D5C9,CGMCCNo. 9010 分泌产生。
[0056] 在此基础上，本发明进而提供了一种副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒，它含有 上述用于检测副溶血性弧菌的PCR反应管；
[0057] 作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还装载有容器a，所述的容器a可以 是自封袋或者其他形式的容器，其中装有本发明的包被有抗副溶血性弧菌单克隆抗体 3G9E9G3H7 或 3G9F7D5C9 的PCR反应管。
[0058] 此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的本发明的试剂盒中优选地 还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是免疫PCR检测试剂盒中常规使用的一些试 齐U，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如 (但不限于）：缓冲液（10XPCR8肛€61〇、(1阶1\了&9〇嫩聚合酶、(1(1!120(灭菌双蒸水）、引物 等常规PCR反应试剂。10XPCRBuffer、dNTP、TaqDNA聚合酶、CldH2O与常规的免疫PCR检 测试剂盒中的所用的试剂相同。同时，为了消除假阳性和假阴性，还可在PCR检测过程中设 置质控（对照），即在本发明的试剂盒中还包含有阴性对照和阳性对照等。较佳地，所述的 阳性对照溶液为灭活的副溶血性弧菌菌液，阴性对照溶液为灭菌的3%氯化钠碱性蛋白胨 水（APW)。如本领域技术人员所熟知，上述试剂和溶液可分别装载于EP管或试剂瓶中。
[0059] 此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方 法。
[0060] 本发明的有益效果：本发明的副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒集病原菌浓缩、 特异性抗体识别以及PCR扩增为一体，具有检测结果准确性高、特异性强、灵敏度高以及检 测快速、使用方便等优点，弥补了现有食源性致病菌检测技术费时耗力、灵敏度低的不足。
[0061] 本发明的副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒适用于菌株快速鉴定、食品中食源性 致病菌检测等诸多领域，尤其适用于样品中微量病原体的快速检测。可供质监部门、进出口 检疫部门等用于检测食样中的副溶血性弧菌。
[0062] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。
[0063] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0064] 实施例1.抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9的制备
[0065] 一、免疫原和阳性标准品的准备
[0066] 副溶血性弧菌（ATCCNo. 17802)接种于3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW)，37°C、 150r/min振荡培养17h，计数，加入0. 3%甲醛溶液室温灭活1天。用生理盐水调整副溶血 性弧菌（ATCCNo. 17802)浓度至5X109cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为IO8Cfu/ ml作为阳性对照标准品，3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW)为阴性对照标准品。
[0067] 二、单克隆抗体的制备
[0068] 1)实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
[0069] 2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0. 2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射 一次。
[0070] 3)米血：3次加强免疫后从尾部静脉米血，米用间接非竞争酶联免疫法测定抗血 清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
[0071] 4)细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下常规融 合，分别接种于96孔培养板，置于37°C、5%CO2培养箱培养。
[0072] 5)杂交瘤细胞筛选：采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞， 将其转移至24孔培养板。
[0073] 6)克隆培养及抗体制备：用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔 底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3 - 4次，直至阳性率达到 100 %。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2XIO6个 杂交瘤细胞，7?10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中 纯化抗体。
[0074] 三、单克隆抗体的效价测定
[0075] 副溶血性弧菌培养基如下：国标：GB/T4789. 7-2008
[0076] 3 %氯化钠碱性蛋白胨水（APW)
[0077] 成分：蛋白胨10. 0g，氯化钠30. 0g，蒸馏水1000.OmL
[0078] 制法：将上述成分混合，调节pH8. 5±0. 2,121°C高压灭菌lOmin。
[0079] 单克隆抗体效价测定的步骤如下：
[0080] (1)将饱和培养细菌抗原连同培养基在对应的孔中加入100μ1，4°C过夜（约包板 36h)。
[0081] (2)倒空液体并拍干残留液体，用250μ1洗涤液清洗3次。
[0082] (3)每个孔中加 100μ11%BSA，37°C封闭lh。
[0083] (4)倒空液体并拍干残留液体，用250μ1洗涤液清洗3次。
[0084] (5)每个孔中加100μ1血清，37°C孵育lh。
[0085] (6)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250μIPBST洗涤液洗涤3次。
[0086] (7)每个孔中50μ1的HRP标记的二抗（sigma)，室温孵育lh。
[0087] (8)用洗涤液浸泡5min，倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250μIPBST洗涤 液洗涤3次。
[0088] (9)每个孔中加100μ1底物，显色30min，加终止液100μ1并立即在OD45tl读数。
[0089] 表1.两株单克隆抗体效价测定结果（OD45tl)
[0090]
【权利要求】
1. 一种用于检测副溶血性弧菌的PCR反应管，其特征在于，所述的PCR反应管包括： 免疫PCR管；和 包被于所述的免疫PCR管管体内壁的抗副溶血性弧菌单克隆抗体，所述的抗副溶血 性弧菌单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7, CGMCC No. 8003或3G9F7D5C9, CGMCC No. 9010 产生。
2. -种检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有如权利要求1所述的PCR反应管。
3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有容器a，所述的容器 a中装有如权利要求1所述的PCR反应管。
4. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有缓冲液、dNTP、 TaqDNA聚合酶、ddH20、引物、阳性对照和阴性对照。
5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物包括正向引物和反向引物。
6. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为灭活的副溶血性弧菌 菌液，所述的阴性对照为灭菌的3 %氯化钠碱性蛋白胨水。
【文档编号】C12Q1/04GK104357565SQ201410610335
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】刘箐, 翟绪昭 申请人:上海理工大学