一株北里乳杆菌新菌株及其用途
【专利摘要】本发明公开了一株北里乳杆菌新菌株及其用途。所述的北里乳杆菌新菌株，命名为HVRIC97-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号是CGMCC No.9440，保藏日期为2014年7月11日。研究表明该菌株具有耐酸、耐胆盐特性，同时还具有独特的吸附病毒、抗病毒感染(如新城疫病毒)以及抗病原沙门菌、抗病原大肠杆菌及抗金黄色葡萄球菌感染的特性。本发明公开的一株北里乳杆菌新菌株可用作益生菌株用于食品、饲料和药物的添加剂，添加于食品、饲料或药物实现其对动物的益生和保健作用等。CGMCC No944020140711
【专利说明】一株北里乳杆菌新菌株及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株北里乳杆菌新菌株，还涉及该北里乳杆菌新菌株在抗菌及抗病毒 中的用途，本发明属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 北里乳杆菌（Lactobacillus kitasatonis)是乳杆菌属的重要成员之一，大多数 为任何动物的体表和内部黏膜表面的益生菌之一。益生性乳酸菌（LAB)是人和动物肠道、 呼吸道、生殖道及皮肤黏膜系统的正常菌群，许多研究成果发现乳酸菌和肠黏膜共同组成 保护屏障，防止病毒、细菌等的入侵，人类越来越清晰地认识到益生菌对人类和动物生命健 康的强大作用，大量现代免疫学研究结果已经证实益生菌（尤其是乳酸菌）对动物细胞免 疫、体液免疫及肠黏膜局部免疫的调节功能，以及对免疫系统发育和免疫稳态的必不缺少 的决定作用；具有抑制肿瘤和抗癌作用等，使益生乳酸菌近年来一度成为现代功能食品、动 物饲料添加剂、医学领域的研究热点之一，甚至成为现代固有免疫学领域的研究热点。
[0003] -系列研究表明，如果没有益生菌，人和动物的免疫系统绝不能发育成为正常的 免疫系统。益生乳酸菌不仅可以有效调节黏膜免疫系统，有效促进分泌型SlgA的分泌，乳 酸菌还可以调节黏膜的菌群分布，促使某些病原体发生凝聚，并阻止其粘附在黏膜上，以防 止其进一步的侵入，并且益生菌吸附在黏膜表面（包括肠黏膜和呼吸道黏膜），能够降解粘 性蛋白并利用这种内源性的营养可以基本保持数量稳定，这种粘附可以与黏膜免疫系统发 生相互作用，可以有效地刺激黏膜免疫系统，起到免疫调节作用，从而使黏膜免疫系统处于 合适的稳定的激活状态（免疫稳态），非常有利于抵御外来病毒或细菌的入侵。因此通过乳 酸菌的合理存在和适当刺激，可以提高黏膜免疫系统的防御功能，从而有效的阻止病毒的 吸附和侵入。
[0004] 众多的研究报道证实，存在于胃肠道黏膜、口腔呼吸道黏膜及生殖道表面的益生 菌作为一种活的常驻菌体对肠道黏膜及呼吸道黏膜具有双重的保护作用，一方面它可以在 黏膜表面内附着定植，维护胃肠道及呼吸道黏膜微生物菌群平衡；另一方面益生菌可直接 于宿主的免疫系统尤其是宿主的黏膜免疫系统发生相互作用诱发黏膜免疫；并能够刺激脾 脏、胸腺及法氏囊等免疫中枢器官的发育，还可以促进巨噬细胞活力或发挥佐剂作用；通过 影响黏膜系统细胞因子等合成和分泌，从而增强T、B细胞对抗原刺激的反应性能，有效发 挥特异性免疫增强作用；黏膜表面常驻益生菌可以活化黏膜内的相关淋巴组织，增加 SlgA 生物合成，提高消化道黏膜及呼吸道黏膜免疫功能，通过诱导淋巴细胞和巨噬细胞产生细 胞因子，发挥免疫调节作用，从而增强机体免疫功能。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种北里乳杆菌新菌株以及所述新菌株在抗菌及抗病毒 中的用途。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0007] 本发明菌株分离自黑龙江省临江县山村散养健壮成年公鸡的小肠肠道，经MRS接 种培养、分离纯化后分离获得的一株乳酸菌株，经鉴定其属于北里乳杆菌（Lactobacillus kitasatonis)，命名为 HVRIC97-1，分类命名为北里乳杆菌（Lactobacillus kitasatonis), 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1 号院中科院微生物研究所，其微生物保藏号是CGMCC No. 9440,保藏日期为2014年7月11 日。该菌株的微生物学特征是：①革兰氏染色典型阳性，菌体为中等偏大，形态规则的长杆 菌；需氧或兼性厌氧菌，在固体和液体MRS培养基上生长良好；②具有耐酸特性，可在pH4. 0 的MRS上生长；③具有耐胆盐特性，可在含30%的鸡胆汁MRS的培养液中存活并生长；④具 有独特的吸附病毒、抗病毒感染（如新城疫病毒）以及抗病原沙门菌、抗病原大肠杆菌及抗 金黄色葡萄球菌感染的特性；⑤该菌培养最适温度为37°C，MRS培养基上菌落为乳白色，边 缘整齐，表面光滑湿润，隆起，不透明的中等大小的菌落，有一种酸香的味道。
[0008] 因此，进一步的，本发明还提出了所述的北里乳酸杆菌新菌株在制备抗菌剂中的 用途。
[0009] 其中，优选的，所述的抗菌剂具有抗病原沙门菌、抗病原大肠杆菌及抗金黄色葡萄 球菌的作用。
[0010] 本发明还提出了所述的北里乳酸杆菌新菌株在制备抗病毒试剂中的用途。
[0011] 其中，优选的，所述的病毒为新城疫病毒。
[0012] 最后，本发明提出了所述的北里乳酸杆菌新菌株在制备调节动物肠道菌群或促进 动物生长的药物中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为本发明分离得到的一株北里乳杆菌新菌株的菌株外观特性；
[0014] 其中，菌株菌落特征如图1左图所示，G染色显微镜观察如图1右图所示；
[0015] 图 2 为北里乳酸杆菌新菌株 HVRIC97-1 (Lactobacillus kitasatonisC97_l)抗金 黄色葡萄球菌（ATCC25923)实验，中间孔为MRS培养基对照，四周6个孔为重复实验孔；
[0016] 图 3 为北里乳酸杆菌新菌株 HVRIC97-1 (Lactobacillus kitasatonisC97_l)抗鸡 白痢沙门氏菌（CVCC578)实验，中间孔为MRS培养基对照，四周6个孔为重复实验孔；
[0017] 图 4 为北里乳酸杆菌新菌株 HVRIC97-1 (Lactobacillus kitasatonisC97_l)抗大 肠杆菌（ATCC25922)实验，中间孔为MRS培养基对照，四周6个孔为重复实验孔；
[0018] 图 5 为北里乳酸杆菌新菌株 HVRIC97-1 (Lactobacillus kitasatonisC97_l)吸附 NDV病毒试验的上清检测结果；
[0019] 图 6 为北里乳酸杆菌新菌株 HVRIC97-1 (Lactobacillus kitasatonisC97_l)吸附 NDV病毒试验结果；
[0020] 图 7 为北里乳酸杆菌新菌株 HVRIC97-1 (Lactobacillus kitasatonis C97-1)体 外吸附病毒电镜实验结果。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0022] 实施例1本发明菌株的分离及鉴定
[0023] 1、菌株的分离和鉴定
[0024] 该菌株分离自黑龙江省临江县山村散养健壮成年公鸡的小肠肠道，在MRS培养基 上生长良好，经划线分离获得的一株乳酸菌株。其微生物学特征是：革兰氏染色典型阳性， 菌体为中等偏大，形态规则的长杆菌；需氧或兼性厌氧菌，在固体和液体MRS培养基上生长 良好，该菌培养最适温度为37°C，MRS培养基上菌落为乳白色，边缘整齐，表面光滑湿润，隆 起，不透明的中等大小的菌落，有一种酸香的味道。
[0025] 菌株菌落特征如图1左图所示，G染色显微镜观察如图1右图所示。该菌株的 16SrDNA的部分序列特征如SEQ ID NO. 1所示。
[0026] 本发明的一株北里乳酸杆菌新菌株（Lactobacillus kitasatonisC97_l)，命名为 HVRIC97-1，分类命名为北里乳杆菌（Lactobacillus kitasatonis)。其微生物保藏号是 CGMCC No. 9440,保藏日期为2014年7月11日。
[0027] 2、菌株的耐酸试验：
[0028] 将分离获得的菌株HVRIC97-1按MRS液体培养基体积的10 %的接种量分别接种 于pH值为3. 0、4. 0、5. 0、6. 5的MRS液体培养基中，每个酸度梯度设置3个平行对照，37 °C 静置培养，分别取培养30min、60min、90min、120min的菌液样品测定0D6(l(lnm值。试验表明 本发明菌株具有较强的抗酸能力，可在PH4. 0的MRS上生长。
[0029] 3、菌株的耐鸡胆汁试验：
[0030] 将分离菌株HVRIC97-1按MRS液体培养基体积的10%的接种量接种于含新鲜鸡胆 汁含量分别为 0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的]\--培养基中，每 个浓度设置3个平行试验，37°C静置培养，取培养30min、60min、90min、120min的菌液样品 测定〇D_nm值，结果表明该菌株能在含30%的鸡胆汁培养基中很好地生长，具有较强的抗 鸡胆汁能力。
[0031] 实施例2本发明分离得到的一株北里乳酸杆菌新菌株的抗菌特性
[0032] 实验方法：标准琼脂扩散法（与牛津杯相同）体外抗菌的筛选。100mm LB平板涂 布鸡白痢沙门氏菌或金黄色葡萄球菌或大肠杆菌IX IO6CFU, 6mm标准琼脂孔加入含有2? 3 X IO9CFUAiL北里乳酸杆菌新菌株HVRIC97-1的MRS菌液200 μ L，中间孔为MRS培养基对 照。24h测量抑菌圈直径。对照为pH值为4. 0酸性MRS培养液以排除酸性条件抑菌作用。
[0033] 实验结果：图2为北里乳酸杆菌新菌株HVRIC97-1抗金黄色葡萄球菌 (ATCC25923)实验结果，其中中间孔均为MRS pH4. 0培养基对照，四周6个重复实验孔 平均抑菌圈直径14±1毫米；图3为北里乳酸杆菌新菌株HVRIC97-1抗鸡白痢沙门氏菌 (CVCC578)实验结果，其中中间孔均为MRS pH4. 0培养基对照，四周6个重复实验孔平均抑 菌圈直径18±1毫米；图4为北里乳酸杆菌新菌株HVRIC97-1抗大肠杆菌（ATCC25922)实验 结果，其中中间孔均为MRS pH4. 0培养基对照，四周6个重复实验孔平均抑菌圈直径15±1 毫米。从上述实验结果可以看出本发明分离得到的北里乳酸杆菌新菌株HVRIC97-1具有独 特的抗病原沙门菌/抗病原大肠杆菌/抗金黄色葡萄球菌的特性。
[0034] 实施例3本发明分离得到的一株北里乳酸杆菌新菌株的吸附病毒特性
[0035] 吸附病毒试验：北里乳酸杆菌新菌株HVRIC97-1 (Lactobacillus kitasatonis C97-1)用MRS过夜培养，LAB含量为1-2X 108cfu/mL，NDV F48E9株病毒尿囊液离心取上 清，ELD50:108.87 l00μL，HA效价l:28,900 μLLAB培养物+100μLNDV，37°C，150rpm/分 互作，做4个平行作为实验组，15分钟取出2个离心取上清，立即进行HA效价检测；30分钟 取出另外2个，处理同上。同时设900 μ L不含有乳酸片球菌的MRS或PBS+100 μ L NDV作 为对照组，结果如图5所示，可见实验组上清病毒效价显著降低（HA效价），而MRS对照及 PBS对照组效价没有降低，说明北里乳酸杆菌新菌株HVRIC97-1具有吸附NDV的作用，从而 导致了上清中病毒减少，效价下降。表明北里乳酸杆菌新菌株HVRIC97-1具有吸附NDV病 毒的特性。
[0036] 离心所得菌体，PBS洗剂3次，洗脱表面蛋白进行Western-bloting验证，结果表 明：洗脱表面蛋白与病毒液Western-bloting结果完全符合，出现相同的蛋白条带，而空菌 对照没有出现任何特异的蛋白条带，说明该北里乳酸杆菌新菌株确实能够吸附NDV病毒。 结果如图6所示。
[0037] 实施例4电镜观察直接验证本发明分离得到的一株北里乳酸杆菌新菌株的吸附 病毒特性
[0038] 过夜培养北里乳酸杆菌新菌株HVRIC97-1，OD值^ 1的菌液500 μ L，离心去上清， PBS洗剂1次；加入500 μ LPBS，加入50 μ L NDV病毒液（新城疫F48E9病毒液（接种SPF 鸡胚收获尿囊液），病毒效价为108 86ELD50/100 μ L)，37°C 100转/分作用15分钟，离心去 上清，PBS洗剂3次，每次lmL，少量PBS重悬，磷钨酸负染，透射电镜观察，结果如图7所示。 从图7结果可以看出，本发明的北里乳酸杆菌新菌株HVRIC97-1表面吸附有典型的NDV病 毒粒子，而对照空菌上没有，表明了北里乳酸杆菌新菌株具有吸附NDV病毒的特性。
[0039] 实施例5菌株的体内益生作用试验
[0040] 试验材料：SPF鸡：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心
[0041] 将活化后的菌株，以平板菌落计数法进行菌落计数，60日龄SPF鸡每只鸡口服ImL 约含北里乳酸杆菌新菌株HVRIC97-1为6-8 X IO8CFU的菌液，隔天口服一次，共6周，并设 空白对照组。对照组，每日观察健康状况，每周称重。结果显示：SPF鸡体重增重效果显著， 平均每只增重30克至50克，鸡只健康，并且食欲良好，明显优于标准益生菌株干酪乳酸杆 菌L. casei393,说明该菌株具有促进SPF鸡生长的作用。
【权利要求】
1. 一株北里乳酸杆菌新菌株，命名为HVRIC97-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其微生 物保藏号是CGMCC No. 9440,保藏日期为2014年7月11日。
2. 权利要求1所述的北里乳酸杆菌新菌株在制备抗菌剂中的用途。
3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于所述的抗菌剂具有抗病原沙门菌、抗病原大 肠杆菌及抗金黄色葡萄球菌的作用。
4. 权利要求1所述的北里乳酸杆菌新菌株在制备抗病毒试剂中的用途。
5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的病毒为新城疫病毒。
6. 权利要求1所述的北里乳酸杆菌新菌株在制备调节动物肠道菌群或促进动物生长 的药物中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK104388344SQ201410617651
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】崔红玉, 王笑梅, 高宏雷, 高玉龙, 刘长军, 王永强 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所