专利名称：一种植物乳杆菌n13及其用途的制作方法
ー种植物乳杆菌NI 3及其用途
技术领域：
本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及ー种植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)N13,还涉及所述植物乳杆菌N13的用途。
背景技木肠侵袭性大肠杆菌(EnteroinvasiveEscherichia coli. , EIEC)是一组能侵入大肠上皮细胞，使宿主肠上皮细胞发生炎症或形成溃疡，引起痢疾样症状的大肠杆菌菌株。 EIEC致病毒力強，繁殖速度快，只要有10 100个EIEC细菌就可以引发疾病，它污染食品和水源，造成爆发流行，从而引起大規模性腹泻疾病。EIEC的毒力取决于侵入细胞的能力， 侵入过程包括原发和扩散两个过程。EIEC入侵肠道上皮细胞分为四个过程(I)EIEC通过 M细胞到达肠黏膜下层；(2)在巨噬细胞中复制；(3)侵入到结肠细胞的基底外侧；(4)侵入到结肠上皮细胞，并在其中繁殖，扩散，引发炎症和痢疾症状反应。治疗EIEC所引起的肠道疾病,通常的治疗方法是使用抗生素治疗。抗生素治疗方法具有以下作用1、能有效控制EIEC引起的临床和亚临床感染；2、抗生素可以抑制肠道细胞壁的增生，从而提高肠道细胞对营养成分的吸收；3、起着选择肠道微生物菌群的作用，主要是通过減少有害微生物对必须营养物质的消耗，増加有益细菌的大量繁殖；4、影响动物的某些生理代谢，从而影响动物的生长。抗生素治疗具有见效快，治疗时间短等优点，但是随着人类大量使用和滥用抗生素，同时也给环境和社会带来了一系列问题，这主要包括1、 抗生素能够导致肠道菌群失调，耐药性菌株增加，从而使得抗生素治疗愈发困难；2、长期使用抗生素造成机体免疫力下降；3、易感染情况增加，引起机体二重感染；4、抗生素等药物在畜产品和环境中的残留，威胁人类的身体健康。为了克服抗生素的副作用，越来越多的研究选用益生菌来治疗EIEC对机体的损害。Resta—Lenert 等人(Resta-Lenert, S. , &Barrett, K. E. (2006). Live probiotics protect intestinal epithelial cells irom the effects oi infection with enteroinvasive Escherichia coli (EIEC). Gut, 52,988-997.)利用活的 Streptococcus thermophilus和Lactobacillus acidophilus干预EIEC,发现联合使用这两种乳酸菌能够明显的降低EIEC对宿主的粘附和侵袭，并降低EIEC引起的宿主生理功能障碍；Medici等人(Medici, M. , Vinderola, C. G. , Weill, R. , &Perdigon, G. (2005). Effect of fermented milk containing probiotic bacteria in the prevention of an enteroinvasive Escherichia coli infection in mice. Journal of Dairy Research,72,243-249.)
用含有干酪乳杆菌、德氏乳杆菌的发酵牛奶来治疗EIEC引起的感染，发现益生菌能够通过增强小鼠的肠道粘膜的免疫反应来避免EIEC的感染。这些研究表明根据细菌之间的拮抗作用，主要通过不同菌株之间的竞争性抑制作用，不仅能够控制EIEC对肠道上皮细胞的损害，还能够有益于肠道上皮细胞上细菌群落的正常分布，更加有效地发挥肠道的生理功能。 这些研究仅从所选乳酸菌菌株对EIEC的拮抗和治疗方面进行考虑，并未考察这些乳酸菌的益生菌特性。益生菌应该具有以下几个主要特性I.能够耐受胃肠道的极端环境；2.对机体肠道具有很好的粘附能力；3.能够调节机体肠道的生态平衡。本发明通过体外实验筛选出了不仅具有拮抗EIEC能力，而且还具有优良益生菌特性的乳酸菌，并考察乳酸菌对 EIEC粘附和侵袭结肠上皮细胞的抑制作用。与报道的治疗EIEC感染的乳酸菌相比，本发明的植物乳杆菌N13具有更好的耐胆盐能力和对结肠上皮细胞更高的粘附能力。鉴于益生菌对肠道病原菌具有显著的生物拮抗抑制作用和其独特的优点，因此筛选对肠侵袭性大肠杆菌具有抑制和拮抗作用的益生菌具有十分广阔的应用前景。为此，本发明人在总结现有技术的基础上进行了大量实验研究工作，完成了本发明。
发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NI3。本发明的另ー个目的是提供所述植物乳杆菌N13的用途。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13,该菌菌株已于2011 年11月29日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 5495。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NI3同时还保藏于江南大学食品微生物菌种保藏中心，保藏编号为CCFM 233。因此在本申请中，术语“CCFM 233”也指代植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13,两者为同一株菌株。所述的植物乳杆菌N13具有下述性质(I)对致病菌肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive Escherichia coli.，EIEC, ATCC 43893)具有显著的抑制作用；(2)具有耐酸性，在pH 2. 0的条件下可以生长；(3)具有耐胆盐能力，在1_3%。胆盐条件下能够生长；(4)对肠上皮细胞株HT-29细胞具有很高的粘附能力；(5)能够明显抑制EIEC对肠上皮细胞株HT-29细胞的粘附；(6)能够明显降低EIEC对肠上皮细胞株HT-29细胞的侵袭。本发明涉及所述的植物乳杆菌N13在制备酸豆乳、燕麦发酵饮料、发酵青贮饲料、 发酵蔬菜、乳酸菌乳饮料以及发酵乳制品中的用途。所述的含植物乳杆菌N13的酸豆乳是采用下述方法制备的按照软水与大豆的体积比2-4在温度75_85°C下用软水浸泡大豆l_2h，去除大豆皮，去掉浸泡水，再按照大豆与沸水的重量比I : 6-10加沸水磨浆，其浆料在温度80-85°C 的条件下保持10-15min，然后用150目筛网过滤，得到ー种豆乳；先往该豆乳中加入以豆乳重量计5% -10%的蔗糖，再使用均质机在压カ15-25MPa下进行均质，随后在温度95°C下进行杀菌处理lOmin，其温度降至36-38°C时，再按照以豆乳重量计0. 04-0. 05%的接种量接入商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌、商业干粉发酵剂嗜热链球菌和下述制备的植物乳杆菌 N13发酵剂，其重量比例为I : I : 1，在温度35-42°C下发酵6-8小时，然后在4°C冷藏保存即得到含植物乳杆菌N13活菌的酸豆乳；
植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂是按照如下方法制备的植物乳杆菌N13以MRS 液体培养基体积计1-3%接种于MRS液体培养基中，在温度37°C下培养20-28h，使植物乳杆菌N13活菌数达到108Cfu/mL以上，然后其培养液在转速3800-4200r/min与温度2_6°C 的条件下离心8-12min，其离心沉淀物再用pH 7. 2的PBS缓冲液冲洗2_4次，然后把其菌体沉淀加到冻干保护剂中，调整细胞浓度至109cfu/mL，混合均匀后进行真空冷冻干燥，冻干后得到所述的植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂。所述的冻干保护剂组成是以重量计蔗糖 1.5%、脱脂乳14%、乳糖5%、甘油1%、淀粉3%和75. 5%水。所述的燕麦发酵饮料是采用下述方法制备的A)以燕麦为原料,将燕麦拣选、去杂、去除表皮并洗浄；B)向燕麦中加入以燕麦重量计100%的50_55°C水进行混合，然后加入到打浆机中打成浆液；C)步骤B)得到的浆液用磨浆机进行磨浆，再用150目的滤网过滤，得到ー种浆液；D)向步骤C)得到的浆液中添加以浆液重量计10-15%白砂糖和1000-1200%水， 在温度121°C下灭菌20min，冷却至36_38°C，得到燕麦发酵基料；E)植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计1_3%接种于MRS液体培养基中，在温度37°C下培养20-24h，离心分离，弃去发酵上清液，余下菌体沉淀物用无菌水重悬，使植物乳杆菌N13活菌浓度达到IO8CfuAiL以上，从而得到所述的植物乳杆菌N13液体发酵剂；F)按照以燕麦发酵基料的体积计6-10%接种量，把保加利亚乳杆菌液体发酵剂、嗜热链球菌液体发酵剂和上述步骤E)制备的植物乳杆菌N13液体发酵剂按照体积比 1:1: I接种于在步骤D)制备的燕麦发酵基料中，在发酵温度36-38°C下培养18-22h，使植物乳杆菌N13的浓度达到IO6CfuAiL以上，然后在温度3-4°C下冷藏保存即得到含植物乳杆菌NI3活菌的燕麦发酵饮料。所述的发酵蔬菜是采用下述方法制备的A)选用的蔬菜经清洗与浙干后,用0. 005-0. 01g/kg次氯酸钠溶液浸泡7_10分钟进行消毒，将所述的蔬菜去皮、切分，得到ー种预处理蔬菜；B)往步骤A)得到的预处理蔬菜中加入按照所述蔬菜重量计0.6-1.0%糖与 4. 0-6. 0%食盐，搅拌均匀，在室温预腌制20-28h，浙干水分，得到一种预腌制蔬菜；C)称取食用香辛料，使用以所述食用香辛料重量计8-10倍水在温度75_85°C下浸提2-4h，冷却后再添加以所述食用香辛料重量计7-9%白酒，混匀得到ー种香辛料汁；D)将植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计1_3%接种于MRS液体培养基中， 在温度37°C下培养20-28h，离心分离，弃去发酵上清液，余下沉淀物用无菌水重悬，使植物乳杆菌N13活菌浓度达到108cfu/mL以上,从而得到一种菌悬液；E)往步骤B)得到的预腌制蔬菜中添加以所述预腌制蔬菜重量计12-14%在步骤 C)得到的香辛料汁与1-5%在步骤D)得到的菌悬液，混匀，装罐，密封，在室温下发酵，直到其发酵液的PH值达3. 6-4. 0，这样得到所述的发酵蔬菜。其中，所述的蔬菜是ー种或多种选自卷心菜、胡萝卜、莴笋、甜椒、洋葱或芹菜的蔬菜。所述的香辛料是ー种或多种选自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。所述的发酵青贮饲料是采用下述方法制备的将玉米稻杆饲料原料揉切至I 4cm后待用；称取45_55kg玉米秸杆饲料原料，把0. 5-0. 7g上述制备的植物乳杆菌N13干粉制剂与200-240mL无菌水混合均匀后喷洒到所述的玉米秸杆饲料原料中，翻拌混和均匀后， 装入青贮饲料桶中压实密封，然后在常温条件下贮存9-12个月后即得到含植物乳杆菌N13 的玉米秸杆饲料。下面将更详细地描述本发明。本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13,该菌菌株已于2011 年11月29日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 5495。所述的植物乳杆菌N13是采用下述筛选方法获得的。该筛选方法步骤如下A、乳杆菌菌株的筛选。称取25g传统发酵食品、泡菜、腌肉、发酵面团或婴儿粪便样品，加到225mL无菌水中，混匀后在温度37°C下培养2h，然后取0. 5mL这种培养液加到4. 5mL无菌水中，得到的稀释培养液再在温度37°C下培养2h，这样得到的培养液重复进行上述稀释培养操作，使该样品浓度稀释至10_4，取稀释度分别为10—1 10_4的菌悬液各50 y L分别涂布于MRS固体培养基上，在温度37°C下厌氧培养46-50h后，挑选典型单菌落，采用平板划线法，得到纯乳酸菌菌株，具体情况见表I。B、分离菌株拮抗EIEC的试验将筛选得到的和其他来源的乳酸菌菌株(见表I)各自接种于MRS液体培养基中， 在温度37°C下进行厌氧培养24h，然后离心分离，得到的发酵上清液进行常规的拮抗EIEC 试验；将指不菌大肠杆菌 EIEC (Enteroinvasive Escherichia coli ATCC 43893,购自美国典型培养物保藏中心ATCC)活化后接种于LB液体培养基中，于温度37°C下培养24h，然后测定其培养液在600nm处的吸光度OD6tltl值，并用无菌LB液体培养基将其OD值调节至
0.66-0. 70，以pH 3. 2的MRS液体培养基作为阴性对照，320 u g/mL的庆大霉素作为阳性对照，重复实验3次，筛选具有拮抗EIEC能力的乳杆菌。其拮抗EIEC试验结果列于表2。表I :本发明使用的乳酸菌编号、菌株名称和来源
权利要求
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13,该菌菌株已于2011年11月29 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，其保藏号为CGMCC 5495。
2.根据权利要求I所述的植物乳杆菌N13，其特征在于它具有下述性质(1)对致病菌肠侵袭性大肠杆菌(EnteroinvasiveEscherichia coli. , EIEC, ATCC 43893)具有显著的抑制作用；(2)具有耐酸性，在pH2. O的条件下可以生长；(3)具有耐胆盐能力，在1_3%。胆盐条件下能够生长；(4)对肠上皮细胞株HT-29细胞具有很高的粘附能力；(5)能够明显抑制EIEC对肠上皮细胞株HT-29细胞的粘附；(6)能够明显降低EIEC对肠上皮细胞株HT-29细胞的侵袭。
3.根据权利要求I所述的植物乳杆菌N13在制备酸豆乳、燕麦发酵饮料、发酵青贮饲料、发酵蔬菜、乳酸菌乳饮料以及发酵乳制品中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的含植物乳杆菌N13的酸豆乳是采用下述方法制备的按照软水与大豆的体积比2-4在温度75-85°C下用软水浸泡大豆l_2h，去除大豆皮，去掉浸泡水，再按照大豆与沸水的重量比I : 6-10加沸水磨浆，其浆料在温度80-85°C的条件下保持10-15min，然后用150目筛网过滤，得到一种豆乳；先往该豆乳中加入以豆乳重量计 5%-10%的蔗糖，再使用均质机在压力15-25MPa下进行均质，随后在温度95°C下进行杀菌处理lOmin，其温度降至36-38°C时，再按照以豆乳重量计O. 04-0. 05%的接种量接入商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌、商业干粉发酵剂嗜热链球菌和下述制备的植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂，其重量比例为I : I : 1，在温度35-42°C下发酵6-8小时，然后在4°C冷藏保存即得到含植物乳杆菌N13活菌的酸豆乳；植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂是按照如下方法制备的植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计1-3%接种于MRS液体培养基中，在温度37°C下培养20-28h，使植物乳杆菌 N13活菌数达到108cfu/mL以上，然后其培养液在转速3800_4200r/min与温度2_6°C的条件下离心8-12min，其离心沉淀物再用pH 7. 2的PBS缓冲液冲洗2_4次，然后把其菌体沉淀加到冻干保护剂中，调整细胞浓度至109cfu/mL，混合均匀后进行真空冷冻干燥，冻干后得到所述的植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂；所述的冻干保护剂组成是以重量计蔗糖I. 5%, 脱脂乳14%、乳糖5%、甘油I %、淀粉3%和75. 5%水。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的燕麦发酵饮料是采用下述方法制备的A)以燕麦为原料，将燕麦拣选、去杂、去除表皮并洗净；B)向燕麦中加入以燕麦重量计100%的50-55°C水进行混合，然后加入到打浆机中打成浆液；C)步骤B)得到的浆液用磨浆机进行磨浆，再用150目的滤网过滤，得到一种浆液；D)向步骤C)得到的浆液中添加以浆液重量计10-15%白砂糖和1000-1200%水，在温度121°C下灭菌20min，冷却至36_38°C，得到燕麦发酵基料；E)植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计1-3%接种于MRS液体培养基中，在温度37°C下培养20-24h，离心分离，弃去发酵上清液，余下菌体沉淀物用无菌水重悬，使植物乳杆菌N13活菌数达到108cfu/mL以上，从而得到植物乳杆菌N13液体发酵剂；F)按照以燕麦发酵基料的体积计6-10%接种量，把保加利亚乳杆菌液体发酵剂、嗜热链球菌液体发酵剂和上述步骤E)制备的植物乳杆菌N13液体发酵剂按照体积比I : I : I 接种于在步骤D)制备的燕麦发酵基料中，在发酵温度36-38°C下培养18-22h，使植物乳杆菌N13的浓度达到106cfu/mL以上，然后在温度3_4°C下冷藏保存即得到含植物乳杆菌N13 活菌的燕麦发酵饮料。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的发酵蔬菜是采用下述方法制备的A)选用的蔬菜经清洗与浙干后，用O.005-0. 01g/kg次氯酸钠溶液浸泡7-10分钟进行消毒，将所述的蔬菜去皮、切分，得到一种预处理蔬菜；B)往步骤A)得到的预处理蔬菜中加入按照所述蔬菜重量计O.6-1. 0%糖与4. 0-6. 0% 食盐，搅拌均匀，在室温预腌制20-28h，浙干水分，得到一种预腌制蔬菜；C)称取食用香辛料，使用以所述食用香辛料重量计8-10倍水在温度75-85°C下浸提 2-4h，冷却后再添加以所述食用香辛料重量计7-9%白酒，混匀得到一种香辛料汁；D)将植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计1-3%接种于MRS液体培养基中，在温度37°C下培养20-28h，离心分离，弃去发酵上清液，余下沉淀物用无菌水重悬，使植物乳杆菌N13活菌浓度达到108cfu/mL以上，从而得到一种菌悬液；E)往步骤B)得到的预腌制蔬菜中添加以所述预腌制蔬菜重量计12-14%在步骤C)得到的香辛料汁与1-5%在步骤D)得到的菌悬液，混匀，装罐，密封，在室温下发酵，直到其发酵液的PH值达3. 6-4. 0，这样得到所述的发酵蔬菜。
7.根据权利要求3或6所述的用途，其特征在于所述的蔬菜是一种或多种选自卷心菜、 胡萝卜、莴笋、甜椒、洋葱或芹菜的蔬菜。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述的香辛料是一种或多种选自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。
9.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的发酵青贮饲料是采用下述方法制备的将玉米稻杆饲料原料揉切至I 4cm后待用；称取45-55kg玉米秸杆饲料原料，把O. 5-0. 7g根据权利要求4所述的植物乳杆菌N13 干粉制剂与200-240mL无菌水混合均匀后喷洒到所述的玉米秸杆饲料原料中，翻拌混和均匀后，装入青贮饲料桶中压实密封，然后在常温条件下贮存9-12个月后即得到含植物乳杆菌N13的玉米秸杆饲料。
全文摘要
本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13及其用途。本发明植物乳杆菌N13具有耐酸性、耐胆盐能力，对肠上皮细胞株HT-29细胞具有很高的粘附性，具有抑制EIEC生长、抑制EIEC对肠上皮细胞株HT-29细胞的粘附和侵袭的能力。用本发明植物乳杆菌N13制备的酸豆乳、发酵燕麦饮料、发酵蔬菜、发酵青贮饲料、乳酸菌乳饮料以及发酵乳具有非常好的应用前景。
文档编号C12R1/25GK102586155SQ20121005782
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者刘小鸣, 刘文玉, 宋元达, 张灏, 张秋香, 王刚, 田丰伟, 范大明, 赵建新, 陈卫, 陈海琴 申请人:江南大学