具有抗炎活性的乳杆菌分离株及其用途的制作方法

专利名称：具有抗炎活性的乳杆菌分离株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明是有关于两株具有抗炎活性以及有益的益生性质(beneficial probiotic properties)的乳杆菌分离株，也就是沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)GMNL-76以及罗 伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89，它们分别以保藏编号BCRC 910355与BCRC 910340被保藏于食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，以及以 保藏编号CCTCC M 207153与CCTCC M 2071M被保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。 这两株乳杆菌分离株及其继代培养后代可被用于制备各式的食品产品，以及用于制备用于 治疗和/或缓解与炎症有关联的疾病(诸如类风湿性关节炎)的药物组合物。
背景技术：
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性自身免疫疾病，它会造 成关节(例如手、足、腕、肘、膝以及踝关节)的肿胀、变形、疼痛、萎缩以及僵硬。长期的慢 性关节炎会逐渐侵蚀掉正常的关节骨细胞，导致关节变形以致最后丧失功能。此外，类风湿 性关节炎也会侵犯关节以外的部位，例如腺体(诸如唾液腺、泪腺以及淋巴腺等)、器官(诸 如肝脏、脾脏、心脏以及肺脏等)或系统(诸如循环系统以及神经系统)，进而造成类风湿性 血管炎、胸膜肺征候(pleuropulmonary manifestations)(包括间质纤维化、胸膜肺结节、 肺炎与动脉炎)以及费耳提氏综合征等。类风湿性关节炎的发病年龄主要是落在40至50岁之间，而女性的发病率是男性 的2至4倍。至今，类风湿性关节炎的确切致病原因仍是未知，但是，先前的研究显示遗传 倾向、环境诱发、自身免疫现象、慢性炎症、细胞运输以及治疗等都可能与类风湿性关节炎 的免疫发病机制有关联。类风湿性关节炎的主要病灶是滑膜组织。正常关节内的滑膜细胞不会超过3层， 但在关节炎患者的关节内则会出现明显的增生。类风湿性关节炎有可能是肇因于患者的免 疫细胞不正常地攻击自身的关节软骨与滑膜组织的II型胶原(collagen type II，CII)。类 风湿性关节炎患者可被检测出具有对II型胶原具特异性的自身抗体和/或类风湿因子。类 风湿因子是由IgG的Fc区域的糖基化缺陷而引发的自身抗体，其中以IgM最多见，而IgG、 IgA也有发现。类风湿因子在大约80%的类风湿性关节炎患者中可检测到，它与原始抗原 结合之后所形成的免疫复合物会沉积于滑膜、软骨或血管中而造成病变。已知细胞因子涉及到许多重要的生物学过程，包括炎症、组织修复、细胞生长、纤 维化、血管发生，以及免疫应答。因此，细胞因子在自身免疫疾病中扮演一个重要的角色。在 M. Feldmann et al. (1996)，Annu. Rev. Immunol.，14 :397-440 此篇回顾性论文 中，M. Feldmann等人借由分析类风湿性关节炎的滑膜组织中细胞因子的表达与调控来探讨 RA的发病机制，其中细胞因子被区分为下面四大类别(1)促炎细胞因子；(2)免疫调节性细胞因子；C3)趋化性细胞因子；以及(4)促有丝分裂细胞因子等。促炎细胞因子是一群由1型T辅助细胞(简称Thl细胞)所产生的能够调节 延迟型过敏反应的分子，包括白细胞介素-1 (IL-I)、干扰素-γ (IFN- y )、肿瘤坏死因 子-α (TNF-α)以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等。在风湿性疾病中所观 察到的软骨破坏已被普遍地认为是基质金属蛋白酶(MMP)的活性所造成，该基质金属蛋白 酶是由对促炎细胞因子(诸如IL-I或TNF-α )有反应并被活化的巨噬细胞与成纤维细胞 所产生。M. Feldmarm等人进一步提到将IL-I或TNF-α注射至经胶原免疫的小鼠或大鼠 体内，或将IFN-Y局部注射到经II型胶原免疫的小鼠的脚掌中，皆会加速关节炎的发生并 增高疾病的严重性(M. Feldmann et al. (1996)，同上述)。免疫调节性细胞因子(也被称为抗炎细胞因子)是一群由2型T辅助细胞(简称 Th2细胞)所产生的能够抑制炎症反应的分子，包括IL-4、IL-10、IL-13以及转化生长因 子-β (TGF-β)等。在 G.Garcia et al. (1999)，Journal of Autoimmunity, 13 :315-324 中，G.Garcia等人提到TGF_i3与IL-10这两种免疫调节性细胞因子不仅会抑制诱发MMP 的促炎细胞因子的生成，也会诱发MMP的天然抑制剂(也就是基质金属蛋白酶的组织抑制 剂TIMP)的生成。G. Garcia等人进一步提到IL_10被广为知晓除了会抑制从Th 1细胞 生成IFN-γ之外，还会抑制从其它的白细胞群生成各种不同的细胞因子。IL-10会抑制从 巨噬细胞生成IL-I、IL-6,TNF-a、IL-8以及G-C SF (粒细胞集落刺激因子)，并且会抑制 从多形核细胞生成IL-1、TNF、IL-8、巨噬细胞炎性蛋白质1 a (MIP1 a )以及巨噬细胞炎性 蛋白质1 β (ΜΙΡ1 β )，而这些细胞因子与趋化因子之中的大多数涉及到关节炎的病理过程 (G. Garcia et al. (1999)，同上述)。这些研究结果显示与Thl细胞有关的促炎细胞因子(诸如TNF- α与IFN- y )会 促进炎症而使得类风湿性关节炎的病况更为恶化，而与Th2细胞有关的免疫调节性细胞因 子(诸如IL-10与IL-4)除了可以抑制促炎细胞因子的生成之外，也可通过诱导TIMP的生 成来减少软骨破坏。目前尚无药物可有效地治愈类风湿性关节炎，因此临床上所使用的药物仅能着重 于防止关节与其它组织或器官的炎症与破坏、修复受损关节以减轻疼痛、以及维持关节的 功能并防止变形等。治疗的模式可区分为药物治疗、手术治疗、康复治疗、运动治疗以及饮 食控制等。药物治疗主要是针对炎症的症状进行治疗，而现今常用于治疗类风湿性关节炎 的药物可被归纳为下面五大类(谢调扬与陈培瑛0001)，“类风湿性关节炎的治疗”，药学 杂志，17 (4) :109-116)1.生物应答调节剂(BRM)例如依那西普(商品名称为Enbrel )与英利西单 抗(商品名称为Remicade )，它们是抗-TNF药剂，可借由特异性地结合至TNF-α来抑制 TNF-α的生物活性，进而减轻TNF-α所造成的炎症现象；2.非甾体抗炎药(NSAID)例如阿司匹林与布洛芬，此类药物具有消炎与止痛的 功效，因此可供用于缓解类风湿性关节炎患者长期或短期的疼痛与炎症；3.疾病改善型抗风湿药(DMARD)例如来氟米特(商品名称为Arava )、氨甲碟 呤、青霉胺、羟氯喹以及金化合物等，它们适用于对NSAID没有反应的类风湿性关节炎患 者。DMARD借由调节会引起类风湿性关节炎的异常免疫反应来延缓疾病过程，而使用此类药 物来进行治疗时必须有医师的监督以避免副作用的发生；
4.皮质类固醇此类药物对于治疗类风湿性关节炎十分有效，但是会产生许多副 作用。皮质类固醇通常是以口服或注射的剂型进行施用，但是经常注射皮质类固醇会伤害 软骨，因此注射次数以每年1至2次为限。目前，口服泼尼松是医师最常开立的处方笺；以 及5.其它例如透明质酸(诸如透明质酸钠(商品名称为Hyalgan ))及其衍生物 (诸如Hylan G-F 20 (商品名称为Synvisc ))。透明质酸是关节软骨与滑液的主要成份， 因此借由透明质酸的关节内注射可以达到刺激软骨细胞增生、保护与润滑关节，以及减轻 炎症的效用。有关用于治疗类风湿性关节炎的药物的选用，一般初期会以效力较弱、安全性较 高的NSAID作为第一线用药，若治疗效果不显著，再以效力较强的DMARD作为第二线用药。 当这两类药物均无法达到所期望的疗效时，则会考虑使用皮质类固醇或施行手术。虽然药 物具有减轻疼痛、僵硬感及炎症的功效，但长期服用可能会产生失眠、耳鸣、水肿、胃溃疡、 胃出血、胃穿孔(gastrobrosia)、皮肤敏感性、蛋白尿、糖尿病、高血压、骨质疏松症、白内 障、抵抗感染能力降低等副作用，同时在治疗的过程中需要定期地作血液生化、血清检查， 以确保治疗成效以及避免上述副作用的发生。迄今，尚未有一种可以有效地治疗或缓解类风湿性关节炎并且不会产生非所需的 副作用的药物。联合国粮食农业组织(FAO)以及世界卫生组织(WHO)将益生菌定义为活的 微生物，当它呈适当数量进行施用时，可赋予宿主一健康益处(Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food,Joint FA0/WH0 Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, April 30 and May 1,2002)。 目前可作为益生菌使用的微生物有许多种类，例如乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属 (Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、酵母、链球菌属 (Streptococcus)等等，特别是前两个菌属的菌种。Eli Metchnikoff在1908年提出存在于胃肠道(GI tract)内的有害腐败菌 会被产酸的乳杆菌所抑制或拮抗(Eli Metchnikoff, 1908, The Prolongation Of Life, Ed. P. Chalmers Mitchell, G. P.Putnam' s Sons, The Knickerbocker Press, New York & London)。之后，有许多的研究以及临床试验也陆续证实乳杆菌与健康之间存在有重要的相关性。乳杆菌是一群革兰氏阳性的兼性厌氧菌，它们普遍存在于人类的胃肠道与阴道 内，它们能够发酵糖类并以乳酸为主要代谢产物。乳杆菌已被发现的功效包括(1)增进肠 道菌群的菌相平衡；(2)预防腹泻；(3)降低结肠癌的危险性；(4)刺激胃肠上皮粘膜系统 的正常发育与功能；(5)产生各种维生素与营养素；以及(6)预防与治疗阴道病。基于乳杆菌的有益益生性质，本领域技术人员致力于开发具有所期望的生 物活性的乳杆菌分离株。在此方面，可以参见，例如TW 588109揭示鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)T cell-1 及其用途。Tff 1241912 揭示 6 株具有降低与同 化胆固醇能力的新的耐酸与耐胆盐乳杆菌分离株，它们是加氏乳杆菌(LactcAacillus gasseri)B21Tl、B21T6、C21Tl、X21B7 与 B38T38 以及嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)B6T7。Tff 1283268公开了鼠李糖乳杆菌GM-020及其治疗肥胖的用途。Tff 1284149揭示副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-32及其治疗过敏相关疾病的用途。另外，TW200611973 揭示发酵乳杆菌(LactcAacillus fermentum) GM-090能有效刺激IFN-γ的分泌和/或治 疗过敏。此外，Jae-Seon So等人报导干酪乳杆菌(LactcAacillus casei)的口服施用 会抑制胶原诱发性关节炎(CIA)以及降低脚掌肿胀、淋巴细胞浸润和软骨组织的破坏。干 酪乳杆菌通过⑶4+T细胞降低II型胶原-反应性促炎分子(IL-1 β、IL-2、IL_6、IL-12、 IL-17、IFN-Y、TNF-a以及Cox-2)。施用干酪乳杆菌也降低NF-κ B向细胞核内的移位以 及CII-反应性Thl-型IgG同种型IgGh和IgG^，同时上调免疫性IL-IO水平(Jaeleon So et al. (2008)，Mol.Immunol.，45(9) :2690-2699 ；Epub 2008 Feb 19)。如果类风湿性关节炎可以通过服用乳杆菌分离株来达到治疗效果，应可为患者提 供一用药安全而且价格不贵的药品。为达到这个目的，申请人从本土的成人胃肠道标本中筛选出两株乳杆菌分离株， 它们在种系上(phylogenetically)是不同于各自所属菌种中已公开的菌株，而且具有能 够刺激产生大量的IL-IO以及较少量的IFN- Y和/或TNF- α的抗炎活性，因而被预期可 用于治疗与炎症有关联的疾病，包括但不限于，类风湿性关节炎。

发明内容
于是，在第一个方面，本发明提供一种具有抗炎活性的乳杆菌属菌种 (Lactobacillus sp.)的分离株，其中该分离株是(i) 一选自于下列的保藏菌株(a)沙克乳杆菌GMNL-76，其以保藏编号BCRC 910355被保藏于食品工业发展研究 所的生物资源保存及研究中心，以及以保藏编号CCTCC M 207153被保藏于中国典型培养物 保藏中心；以及(b)罗伊氏乳杆菌GMNL-89，其以保藏编号BCRC 910340被保藏于食品工业发展研 究所的生物资源保存及研究中心，以及以保藏编号C CTCC M 2071M被保藏于中国典型培 养物保藏中心；或(ii)在(i)项中的所述保藏菌株的继代培养后代。在第二个方面，本发明提供一种食品产品，其包含有一如上所述的乳杆菌属菌种 的分离株以及一可食性材料。在第三个方面，本发明提供一种可用于治疗和/或缓解与炎症有关联的疾病的药 物组合物，其包含有一如上所述的乳杆菌属菌种的分离株。在第四个方面，本发明提供一种用于治疗个体的与炎症有关联的疾病的方法，其 包括对需要该治疗的个体施用一如上所述的乳杆菌属菌种的分离株。


下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其它目 的与特征，可借由参照下文的描述、所附的权利要求书和附图而变得更为明显，附图中图1显示患有胶原诱发性关节炎的大鼠在经连续喂食本发明的乳杆菌分离株 GMNL-76以及GMNL-89历时8周之后被收集血清并进行IL-10的ELISA试验的结果，其中不患有关节炎并被喂食以逆渗透水的大鼠以及患有关节炎但被喂食以逆渗透水的大鼠是分 别作为对照组以及安慰剂组；图2显示患有胶原诱发性关节炎的大鼠在经连续喂食本发明的乳杆菌分离株 GMNL-76以及GMNL-89历时8周之后被收集血清并进行IFN- γ的ELISA试验的结果，其中 不患有关节炎并被喂食以逆渗透水的大鼠以及患有关节炎但被喂食以逆渗透水的大鼠分 别是作为对照组以及安慰剂组；图3显示患有胶原诱发性关节炎的大鼠在经连续喂食本发明的乳杆菌分离株 GMNL-76以及GMNL-89历时8周之后被收集血清并进行TNF- α的ELISA试验的结果，其中 不患有关节炎并被喂食以逆渗透水的大鼠以及患有关节炎但被喂食以逆渗透水的大鼠是 分别作为对照组以及安慰剂组；图4显示本发明的乳杆菌分离株GMNL-76的16S rDNA核苷酸序列；图5显示分别以本发明的乳杆菌分离株GMNL-76以及2株以往的沙克乳杆菌BCRC 12933与BCRC 17500的基因组DNA作为模板并使用Lac P2引物进行随机扩增的多态性 DNA(RAPD)分析，继而以1.8%琼脂糖凝胶进行电泳后，于紫外光下观察所得到的照相结 果，其中在(A)区中，泳道Ml :DNA梯(100-3000bp)，泳道1 :GMNL_76 ；在(B)区中，泳道M2 DNA 梯(100-3000bp)，泳道 2 =BCRC 12933 ；以及在(C)区中，泳道 M3 :DNA 梯(100_3000bp)， 泳道 3 =BCRC 17500 ；图6显示本发明的乳杆菌分离株GMNL-89的16S rDNA核苷酸序列；以及图7显示分别以本发明的乳杆菌分离株GMNL-89以及5株以往的罗伊氏乳杆菌 BCRC 14625、BCRC 16090、BCRC 16091、BCRC 17476 与 BCRC 17478 的基因组 DNA 作为模板 并使用LacP2引物进行RAPD分析，继而以1. 8%琼脂糖凝胶来进行电泳后，于紫外光下观 察所得到的照相结果，其中在㈧区中，泳道Ml :DNA梯(100-3000bp)，泳道1 :GMNL_89 ； 在(B)区中，泳道 M2 :DNA 梯(100-3000bp)，泳道 2 =BCRC 14625 ；在(C)区中，泳道 M3 =DNA 梯(100-3000bp)，泳道 3 =BCRC 16090 ；在(D)区中，泳道 M4 :DNA 梯(100_3000bp)，泳道 4 BCRC 16091 ；在(E)区中，泳道 M5 :DNA 梯(100_3000bp)，泳道 5 =BCRC 17476 ；以及在(F) 区中，泳道 M6 :DNA 梯(100-3000bp)，泳道 6 :BCRC 17478。发明详细说明类风湿性关节炎是一种全身性的慢性疾病，但目前临床上所用的药物并无法有效 地治疗类风湿性关节炎，而且长期使用此类药物还会引起非所需的不利副作用。此外，先前的研究指出与Thl细胞有关的促炎细胞因子(诸如IFN-Y以及 TNF-α)会促进炎症而使得类风湿性关节炎的病况更为恶化，而与Th2细胞有关的免疫调 节性细胞因子(诸如IL-10与IL-4)可以抑制促炎细胞因子的生成以及可通过诱导TIMP 的生成来减少软骨破坏。因此，本发明人推论类风湿性关节炎的治疗也许可以借由调控免 疫调节性细胞因子以及促炎细胞因子的分泌量来达成。乳酸菌，特别是乳杆菌属的菌株，是为人所熟悉与广泛使用的益生性微生物，它们 已被证实具有许多有益于宿主健康的功效，例如增进肠道菌群的菌相平衡、预防腹泻、降 低结肠癌的危险性、刺激胃肠上皮粘膜系统的正常发育与功能、产生各种维生素与营养素 以及预防与治疗阴道病等。因此，申请人尝试从被视为是益生性微生物的乳酸菌当中找出具有有利的抗炎活性的乳杆菌分离株以用于治疗类风湿性关节炎。于是，申请人以来自台湾健康成人的胃肠道标本作为乳杆菌分离株的分离来源， 并将所得到的分离株分别与实验动物的单核细胞进行共培养以刺激单核细胞分泌细胞因 子，然后使用IL-10以及IFN-Y作为筛选标记，而筛选出能够刺激单核细胞分泌大量的 IL-10以及较少量的IFN- Y和/或TNF- α的两株乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89，它 们经特征鉴定被分别归属于沙克乳杆菌以及罗伊氏乳杆菌。沙克乳杆菌GMNL-76以及罗伊氏乳杆菌GMNL-89已分别于2007年6月14日以及 2006年11月14日以保藏编号BCRC 910355与BCRC 910340被保藏于台湾的食品工业发 展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物资源保 存及研究中心(Biosource Collection and Research Center, BCRC) (300 新竹市食品路 331号)。这两个分离株也依据布达佩斯条约的规定，于2007年11月19日分别以保藏编 号CCTCC M 207153与CCTCC M 2071 被保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉， 武汉大学，430072，中华人民共和国)。当本发明的沙克乳杆菌GMNL-76以及罗伊氏乳杆菌GMNL-89被喂食给患有胶原诱 发性关节炎的大鼠时，可观察到大鼠血清中的IL-10升高而IFN-Y与TNF-α降低，这显示 本发明的乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89能够使大鼠的关节炎症状况不再恶化。相比于以往菌株沙克乳杆菌BCRC 1四33与BCRC 17500以及罗伊氏乳杆菌BCRC 14625、BCRC 16090、BCRC 16091、BCRC 17476 与 BCRC 17478，沙克乳杆菌 GMNL-76 与罗伊 氏乳杆菌GMNL-89在活体外刺激单核细胞分泌IL-10的能力分别地要比它们各自所属菌种 的以往菌株更佳。基于上述的有利生物活性，本发明的两株乳杆菌分离株或它们的继代培养后代被 预期具有可用于治疗与炎症有关联的疾病的潜力。于是，本发明提供一种用于治疗与炎症 有关联的疾病的药物组合物，其包含有(i)至少一种选自于下列的保藏菌株(a)沙克乳杆菌GMNL-76，其以保藏编号BCRC 910355被保藏于食品工业发展研究 所的生物资源保存及研究中心，以及以保藏编号CCTCC M 207153被保藏于中国典型培养物 保藏中心；以及(b)罗伊氏乳杆菌GMNL-89，其以保藏编号BCRC 910340被保藏于食品工业发展研 究所的生物资源保存及研究中心，以及以保藏编号CCTCC M 2071M被保藏于中国典型培养 物保藏中心；或(ii)在(i)项中的该保藏菌株的继代培养后代。本发明也提供一种用于治疗个体的与炎症有关联的疾病的方法，其包括对需要该 治疗的个体施用如上所述的乳杆菌属分离株或其继代培养后代。依据本发明，所述与炎症有关联的疾病是选自于下列所构成的组类风湿性关节 炎、骨关节炎、幼年型类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、脊椎炎、银屑病关节炎、克罗恩病、 溃荡性结肠炎以及银屑病(Eveline Trachsel et al. (2007), Arthritis Research & Therapy,9(1) :R9，Published online 2007 January 29. doi :10. 1186/ar2115 ；Suchita Nadkarni et al. (2007), The Journal of Experimental Medicine, 204 :33-39 ；Richard 0 Williams et al. (2007), Current Opinion in Pharmacology，7 :412-417)。在本发明的一个优选实施方式中，所述与炎症有关联的疾病是类风湿性关节炎。依据本发明的药物组合物可利用本领域熟练技术人员所详知的技术，将上述的乳 杆菌分离株或其继代培养后代配制于一药学上可接受的载体中，然后制成适用于口服施用 的剂型。在本发明的一个优选实施方式中，所述药物组合物呈选自于下列一组中的剂型溶 液、悬浮液、乳剂、粉末、片剂、丸剂、糖浆、锭剂、含锭、咀嚼胶、胶囊、膏剂以及类似物。如本文中所用的，术语“药学上可接受的载体”意指一种当被施用时不会在被施用 个体内造成过敏性反应或其它非所需的效用的载体。依据本发明，所述药学上可接受的载 体可包含一或多种选自于下列的试剂溶剂、乳化剂、悬浮剂、分解剂、粘合剂、赋形剂、稳定 剂、螯合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、润滑剂以及类似物。此外，本发明的沙克乳杆菌GMNL-76以及罗伊氏乳杆菌GMNL-89也被发现具有耐 胆盐与耐胃酸特性，因而适用于作为一种胃肠道益生菌。例如，这种分离株或其继代培养后 代可用作食品添加剂，经现有的方法在原料制备时添加，或是不参与发酵而于发酵制作过 程之后添加，而与任一种可食性材料被配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。因此，本发明也提供一种食品产品，其包含有一如上所述的乳杆菌分离株或其或 其继代培养后代以及一种可食性材料。适用于本发明的可食性材料包括但不限于液体乳制品，例如乳、浓缩乳；发酵 乳，例如酸乳酪、酸乳、冷冻酸乳酪、乳酸菌发酵饮料；奶粉；冰淇淋；奶酪；干酪；豆浆；发 酵豆浆；蔬果汁；果汁；运动饮料；甜点；果冻；糖果；婴儿配方奶粉；保健食品；动物饲料； 膳食补充剂等等。此外，依据本发明的食品产品可被制备成其中含有可直接食用的冻干或喷雾干燥 菌体粉末的速溶冲泡食品的形式。有关食品产品的制备，可以参见，例如US 6，872，565B2、 US 7，244，424B2、US 7，270，994B2、US 7，172，777B2 以及 US 6，872，411B1。依据本发明的食品产品可进一步包含有至少一种益生性微生物。如本文中所用的 “益生性微生物”或“益生菌”等术语可被相互交换使用，且意指活的微生物的制备物，当被 人类或动物摄食之后，所述微生物可以保持并存活在胃肠道之中，而且能够提供疾病的预 防与治疗。适用于本发明的益生性微生物包括但不限于乳杆菌属菌种(LactcAacillus SP·)、双歧杆菌属菌种(Bifidobacterium sp·)、链球菌属菌种(Sti^ptococcus sp·)、酵 母，以及它们的组合。优选地，所述乳杆菌属菌种是选自于下列所构成的组嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、瑞 士 乳杆 菌(Lactobacillus helveticus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆 菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus ρIantarum)、唾液乳杆菌 (Lactobacillus salivarius)、双歧乳杆菌(Lactobacillus bifidus)、保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus bulgaricus)、高力口索乳杆菌(Lactobacillus caucasicus)、鼠李糖乳杆 菌(Lactobacillus rhamnosus)、力口氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri),以及它们的组合。优选地，所述双歧杆菌属菌种是选自于下列所构成的组两歧双歧杆菌 (Bifidobacterium bifidum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌 (Bifidobacterium infantis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、|L酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，以及它H 的组合。优选地，所述链球菌属菌种是选自于下列所构成的组嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、乳月旨链球菌 (Streptococcus cremoris)、双乙酉先链球菌(Streptococcus diacetylcatis),以及它们的组合。优选地，所述酵母是选自于下列所构成的组乳酒假丝酵母(Candida Kefyr)、弗 罗棱糖酵母(Saccharomyces florentinus)、酉良酒酵母(Saccharomyces cereviseae),以及 它们的组合。本发明将就下面实施例来作进一步说明，但应了解的是，该等实施例仅是用来作 为例示说明，而不应被解释为本发明的实施上的限制。实施例实施例1.具有抗炎活性的乳杆菌分离株的初步筛选实验材料与方法A.试验菌株的来源与制备申请人:于91年2月经由中国医药大学附设医院(台中市)取得众多健康成人的胃 肠道标本，并从这些标本中分离出4百余株的乳杆菌分离株。为寻找具有可用于治疗类风 湿性关节炎的潜力的益生菌，申请人对这些乳杆菌分离株进行抗炎活性分析，并使用IL-IO 作为筛选标记。将各试验菌株接种至Bacto乳杆菌MRS肉汤培养基(DIFC0，Cat. No. 0881)内，然 后于37°C下厌氧培养12至18小时。所形成的细菌培养物以4，OOOrpm离心15分钟，倒除 上清液，将沉淀物以IX磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤共计3次，然后悬浮于IX PBS中。所形 成的菌液以IX PBS调整浓度至1 5X IO9细胞/mL(以OD6tltl进行菌数计数，OD600 = 1. 00 =5. OX IO8细胞/mL) ·并以之作为原液进行10倍连续稀释，生成ΙΟ8、ΙΟ7、ΙΟ6、105、IO4、103、 IO2UO1细胞/mL的试验菌液供随后的实验用。B.小鼠脾脏单核细胞的制备以CO2处死6 8周龄的雌性BALB/c小鼠，取出脾脏并用经灭菌的玻棒研磨。将 研磨后的脾脏组织与 Ficoll-Paque PLUS(17-1441-03，Amersham Biosciences)以1 1 的体积比进行密度梯度离心(720gX 20min，在4°C下)。之后，移除红血球，将由此得到的小 鼠脾脏单核细胞以含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至4X IO6 细胞/mL备用。C.乳杆菌分离株刺激小鼠脾脏单核细胞分泌IL-10的评估向96孔的培养盘的各孔加入100 μ L的上述B中所制备的小鼠脾脏单核细胞样 品，并分成3组分别加入(1)试验组，20 μ L的上述A项中所制备的试验菌液(IXlO7细胞 /mL)；⑵正常对照组，20 μ L的含有10% FBS的RPMI 1640培养基；以及(3)阳性对照组， 20yL的脂多醣(LPS)(大肠杆菌(Escherichia coli)血清型055:B5，Sigma)。在培养箱 (37°C,5% CO2)中进行培养历时M小时之后，将各孔内的培养液进行离心，并从所收获的 上清液取出 100 μ L进行使用 Mouse IL-10 OptEIA Set (BD Biosciences, Cat. No. 555252) 的酵联免疫吸附测定(ELISA)。将各组的实验重复两次。
IL-10的浓度是借由将ELISA试验所测得的OD4tl5数值代入下列公式进行计算，并 以ELISA单位(％ )来表示ELISA 单位(% ) = [ (A-C) / (B-C) ] X 100其中A =乳杆菌分离株的OD4tl5数值B =阳性对照组的OD4tl5数值C =正常对照组的OD4tl5数值结果在所有的试验菌株当中，有46株会刺激小鼠脾脏单核细胞分泌较高数量的 IL-10，它们的实验结果示于表1中。表1.乳杆菌分离株刺激小鼠脾脏单核细胞分泌IL-10的功效评估
权利要求
1.一种具有抗炎活性的乳杆菌属菌种(LactcAacillus sp.)的分离株，其特征在于该乳杆菌属菌种的分离株是(i) 一种保藏菌株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL_89，其以保藏编号CCTCC M 207154被保 藏于中国典型培养物保藏中心；或( )在(i)项中的所述保藏菌株的继代培养后代。
2.一种可用于治疗和/或缓解与炎症有关联的疾病的药物组合物，其特征在于该药物组合物包含有(i) 一种保藏菌株罗伊氏乳杆菌GMNL-89，其以保藏编号CCTCC M 2071M被保藏于中国典型培养物保藏 中心；或( )在(i)项中的所述保藏菌株的继代培养后代。
3.如权利要求2的药物组合物，其特征在于所述疾病是类风湿性关节炎。
4.如权利要求2的药物组合物，其特征在于该药物组合物呈可供口服施用的剂型。
5.如权利要求4的药物组合物，其特征在于所述剂型选自下列所构成的组溶液、悬 浮液、乳剂、粉末、片剂、丸剂、糖浆、锭剂、含锭、咀嚼胶、膏剂以及胶囊。
6.根据权利要求1的乳杆菌属菌种的分离株，在制备用于治疗和/或缓解与炎症有关 联的疾病的药物组合物中的用途。
7.如权利要求6的用途，其特征在于所述疾病是类风湿性关节炎。
8.如权利要求6的用途，其特征在于所述药物组合物呈可供口服施用的剂型。
9.如权利要求8的用途，其特征在于该剂型选自于下列所构成的组溶液、悬浮液、乳剂、粉末、片剂、丸剂、糖浆、锭剂、含 锭、咀嚼胶、膏剂以及胶囊。
10.一种食品产品，其特征在于该食品产品包含有权利要求1的乳杆菌属菌种的分离 株以及一种可食性材料。
11.如权利要求10的食品产品，其特征在于该食品产品进一步包含有至少一种选自于下列一组中的益生性微生物乳杆菌属 胃禾中(Lactobacillus sp.)、双 1 木干胃M 禾中(Bifidobacterium sp. )> IjIit^M ^ft (Streptococcus sp.)、酵母，以及它们的组合。
12.如权利要求11的食品产品，其特征在于该乳杆菌属菌种选自于下列所构成的组嗜酸乳杆菌(LactcAaci llus acidophilus), 乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、瑞士 乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、短 乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) > ( ^ ff lif (Lactobacillus salivarius) > ) 1 ff lif (Lactobacillus bifidus)、保力口利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、高力口索乳杆菌 (Lactobacillus caucasicus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、力口氏乳杆菌 (Lactobacillus gasseri)，以及它们的组合。
13.如权利要求11的食品产品，其特征在于所述双歧杆菌属菌种选自下列所构成的组两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，以及它们的组合。
14.如权利要求11的食品产品，其特征在于所述链球菌属菌种选自下列所构成的组嗜热链球菌(Sti^ptococcus thermophilus)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、乳月旨链球菌(Streptococcus cremoris)、双乙酰链球菌(Sti^ptococcus diacetylcatis)，以及它们的组合。
15.如权利要求11的食品产品，其特征在于所述酵母是选自于下列所构成的群组乳酒假丝酵母(Candida Kefyr)、弗罗棱糖酵 母(Saccharomyces florentinus)、酉良酒酵母(Saccharomyces cereviseae),以及它们的组口 O
16.如权利要求10的食品产品，其特征在于所述可食性材料选自下列所构成的组液体乳制品、发酵乳、奶粉、冰淇淋、奶酪、干酪、 豆浆、发酵豆浆、蔬果汁、果汁、运动饮料、甜点、果冻、糖果、婴儿配方奶粉、保健食品、动物 饲料以及膳食补充剂。
17.如权利要求10的食品产品，其特征在于该食品产品被制成速溶冲泡食品的形式。
全文摘要
本发明揭示两株具有抗炎活性以及有益的益生性质的乳杆菌分离株，也就是沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)GMNL-76以及罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89，它们分别以保藏编号BCRC 910355与B CRC 910340被保藏于食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，以及以保藏编号CCTCC M 207153与CCTCC M 207154被保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。这两株乳杆菌分离株及其继代培养后代可被用于制备各式的食品产品，以及用于制备用于治疗和/或缓解与炎症有关联的疾病(诸如类风湿性关节炎)的药物组合物。
文档编号A61P19/02GK102115721SQ20101056758
公开日2011年7月6日 申请日期2008年5月8日 优先权日2008年5月8日
发明者俞笃文, 吕英震, 李浚笙, 谢丰钦, 陈靓珮, 黄璻尹 申请人:景岳生物科技股份有限公司