一种以乙酸为原料合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种以乙酸为原料合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用，本发明旨在通过对传统甲羟戊酸途径进行改造，通过表达外源的乙酰辅酶A合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶，最终在细胞体内建立一条可以利用乙酸为原料合成异戊二烯的新代谢途径。
【专利说明】一种以乙酸为原料合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及利用生物法制备异戊二烯化合物的方法，具体涉及一种以乙酸为原料合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用。
【背景技术】
[0002]异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95%用于合成橡胶。另外，异戊二烯还可用在医药农药中间体、合成润滑油添加剂、橡胶硫化剂和航空燃料等方面，其开发利用前景十分广阔。
[0003]目前，异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。
[0004]生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径。MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中，而MEP途径存在于植物的质体，细菌，藻类。这两类代谢途径的最终产物都是形成异戍二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)，之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。
[0005]微生物具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此微生物作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。
【发明内容】
[0006]本发明的发明目的是提供了一种以乙酸为原料合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用，本发明对利用传统甲羟戊酸途径的异戊二烯生物合成途径进行改造，建立一条合成可以利用乙酸为原料的异戊二烯新代谢途径的方法，在重组细胞体内，通过基因工程的手段过表达乙酰辅酶A合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶，将乙酸合成乙酰辅酶A，再将其转化为乙酰乙酰辅酶A后利用传统MVA部分途径将其转化为目标产物异戊二烯，从而构建一条新的利用乙酸为碳源的异戊二烯生物合成途径。
[0007]为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现:
一种以乙酸为原料合成异戊二烯的方法，它包括以下步骤:
(1)依次构建分别含有acs基因、aces基因的载体pGH-acs、pGH-aacs；
(2)构建含有Jsa?基因的载体*CY-1spSPa;构建含有ERG12基因、ERG8基因、ERG19基因和基因的载体 ；
扩增acc基因的accAD片段，将pC0LADuet_l载体与accAD片段分别用Pst I和Hind///进行双酶切，酶切后的载体与两端带有相应酶切位点的acdi?基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pCOL-acdi?； 扩增acc基因的accBC片段，将pCOL_acc仙与accBC片段分别用Bgl II和Xho I进行双酶切，酶切后的载体与acMC基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为含有accADBC基因的重组质粒pCOL-ac^^1 ；
所述pGH-acs与所述载体分别用Nde I和Bgl II进行双酶切，酶切后的载体与外源基因片段aa按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒ViChccADBC-acs ；
所述pGH-aacs与所述载体pCOL-accylflZC-acs分别用ZSo J和Pac J进行双酶切，酶切后的载体与外源基因片段aaa按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒vOdL_3CCJWBCy3CS_33CS ;
(3)扩增HMGS基因，将所述pkCY-1spSPa与基因HMGS分别用FseI和PvuI进行双酶切，酶切后的载体与外源基因片段mi?按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒V似_ispSPa-HMGS ；
扩增HMGR基因，将pkC1-HMGS-1spSPa与基因HMGR分别用Nco I和BatnH I进行双酶切，酶切后的载体与外源基因片段嫌從按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒xAC1-HMGR-1spSPa-HMGS ；
(4)将载体 vWX-HMGR-1spSPa-HMGS、pTrc-ERG12~ERG8~ERG19-1DIl 和\>COL-accADBC-acs-aacs共同转化大肠杆菌,涂布于加有卡那霉素、氯霉素和氨节青霉素抗生素的LB固体平板，获得阳性克隆YJM57工程大肠杆菌；
(5)将活化后的YJM57工程大肠杆菌接种到含有卡那霉素、氯霉素或氨苄霉素的LB液体培养液中培养，当OD6tltol为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂至终浓度0.5 mmol.L—1，然后转入在30°C下继续诱导培养24h，发酵获得异戊二烯。
[0008]本发明还提供了一种合成异戊二烯的重组细胞，所述重组细胞包含对应编码产生乙酰辅酶A合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶的基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5- 二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、异戊二烯合成酶，该重组细胞能够从乙酸合成异戊二烯。
[0009]所述的重组细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或微藻。
[0010]本发明还提供了所述的重组细胞在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物和组合物包括:异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。
[0011]本发明中利用乙酸为碳源的新异戊二烯生物合成途径与传统MVA途径相比其优点在于:(1)传统的MVA途径只能以葡萄糖为碳源合成目标产物异戊二烯，不能以乙酸为原料合成异戊二烯；而本发明通过基因工程手段过表达乙酰辅酶A合成酶后，可以利用乙酸为原料合成异戊二烯；(2)本发明利用基因工程过表达乙酰辅酶A羧化酶和乙酰乙酰辅酶A合成酶后，与传统的MVA途径相比，新途径使碳源向异戊二烯合成代谢途径通量增大，同时乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A转化途径发生改变:传统的MVA途径中是由乙酰辅酶A酰基转移酶催化乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A，是一步反应；而新途径是由两步反应组成:首先，乙酰辅酶A羧化酶催化乙酰辅酶A合成丙二酸单酰辅酶A，其次，乙酰乙酰辅酶A合成酶催化丙二酸单酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A。
[0012]本发明主要通过基因工程的手段，在细胞中过表达乙酰辅酶A合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶的基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5- 二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、异戊二烯合成酶获得的重组细胞含有表达上述酶的基因，该重组细胞能够从乙酸合成异戊二烯。最终在大肠杆菌细胞中成功建立一种高效的能够利用乙酸为原料的新异戊二烯生物合成代谢途径，获得了可以高效合成异戊二烯的重组细胞，从而建立一条新的利用乙酸为原料的生物催化剂生产异戊二烯的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是本发明中利用乙酸合成异戊二烯新合成途径的示意图。
[0014]图2是本发明中pYJM52 (fiCQL-accAD)的质粒图谱。
[0015]图3是本发明中pYJM53 (x>C0L-accADBC)的质粒图谱。
[0016]图4是本发明中pYJM54的质粒图谱。
[0017]图5 是本发明中 pYJM55的质粒图谱。
[0018]图6是本发明中pYJM56 (pACY~ispSF~MGS)的质粒图谱。
[0019]图7 是本发明中 pYJM57 ^kC1-HMGR-1spSp-HMGS)的质粒图谱。
[0020]图8表明本发明中工程菌YJM57产异戊二烯的时间曲线。
【具体实施方式】
[0021]下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于下述的具体实施例。
[0022]实施例1
如图1所示，本发明通过在大肠杆菌中共同过量表达来源于鼠伤寒沙门氏菌{Salmonell aenterica)的乙酰辅酶A合成酶(ACS);来源于大肠杆菌{Escherichiaco7i)乙酰辅酶A羧化酶(ACC);来源于链霉菌sp.CL190)的乙酰乙酰辅酶A合酶(AACS),来源于屎肠球菌faecium) 3_轻-3-甲基戍二酰辅酶A合酶(HMGS)和轻甲基戍二酰辅酶A还原酶(HMGR);来源于酿酒酵母cerevisiae)的甲轻戍酸激酶(ERG12)、甲轻戍酸_5_磷酸激酶(ERG8)、甲轻戍酸_5_ 二磷酸脱羧酶(ERG19)、异戊烯焦磷酸异构酶(IDIl)和异戊二烯合成酶(IspS);利用乙酸为原料合成中间产物乙酰辅酶A生物合成异戊二烯。
[0023]所述乙酰辅酶A合成酶基因iacs基因)来源于:I)大肠杆菌{Escherichia colistr.K-12 substr.MG1655)(GenBank:AAC43163)，或2)来源于其它细菌，优选鼠伤寒沙门氏菌{Salmonell typhimurium LT2) (GenBank: 16767525),或 3)粗糖脉抱菌
erassa ) (66111^111^:1^】83612)、酿酒酵母(5^<^<3/'0焊<^(95.cerevisiae YJM789) (GenBank:EDN59693)、酿酒酵母(feccAaro焊cm cerevisiae S288c) (GenBank:NP_009347)、拟南芥^Arabidopsis thaliana) (GenBank:AED94121)，或 4)来源于其它生物体,和乙酸辅酶 A合成酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0024]所述乙酰辅酶A羧化酶基因(acc基因，即acc灿见'基因)是来源于:1)来源于细菌，优选大肠杆菌 CfocAericAia coli str.K-12 substr.MG1655) (GenBank:accA: 110590387; accB: 110590390; accC: 110590391; accD 110590392)，或 2)谷氨酸棒杆菌 iCorynebacterium glutamicum ATCC 14067) (GenBank:KEI22444);乙酸隹丐不动杆菌况ter sp.ADPI) (GenBank: accA: 50086048; accB: 50084890;accC: 50086323; accD: 50083297);或3)来源于其它生物体，和乙酰辅酶A羧化酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0025]所述乙酰乙酰辅酶A合酶基因iaacs基因)是来源于:I)链霉菌iStreptomycessp.CL190)(GenBank:AB272317.1);或 2)烟曲霉fumigatus var.RP-2014)(GenBank: KEY79579);或 3)苏云金芽抱杆菌thuringiensis IBL 4222 )(GenBank:EEN03006);或4)来源于其它生物体，和乙酰乙酰辅酶A合酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0026]所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因OWM基因)可以来源于:I)酿酒酵母{Saccharomyces cerevisiae) (GenBank: YM4987.09C);或 2)来源于其它细菌，优选屎肠球菌 iBnterococcus faecium) (GenBank: AAG02443.1)，类肠球菌faecal is)(GenBank: ESU74184.1)，金黄色酿胺葡萄球菌aureus) (GenBank:YP—501316.1)，魏氏利斯特菌{Listeria welshimeri) (GenBank: YP—849629.1)，酿胺链球菌pyogenes) (GenBank: AAL97584.1);或 3)来源于其它生物体，和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0027]所述羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因OWft?基因)来源于:1)酿酒酵母{Saccharomyces cerevisiae) (GenBank: YLR450W);或 2)来源于其它细菌，优选屎肠球菌(Bnterococcus faecium) (GenBank: YP—QQ5354442.1)，类肠球菌
faecal is) (GenBank: AAG02438.2)，金黄色酿胺葡萄球菌{Staphylococcus aureus )(GenBank: AAG02423.1)，酿胺链球菌pyogenes) (GenBank:WP—030125991.1);或3)来源于其它生物体，和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0028]所述甲轻戊酸激酶基因QERG12基因)来源于:I)酿酒酵母i^acclmromycescerevisiae) (GenBank: NP—013935.1)，优选酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，粪肠球 HEnterococcus faecal is) (GenBank: EPI38248.1)，金黄色酿胺葡萄球菌{Staphylococcus aureus) (GenBank: ABR51486.1)，尿肠球菌 i^nterococcus faecium)(GenBank: EFS06266.1)，酿胺链球菌pyogenes)(GenBank: AFV37808.1)；或3)来源于其它生物体，和甲羟戊酸激酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0029]所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因iBRGS基因)来源于:1)酿酒酵母{Saccharomyces cerevisiae) (GenBank: NP—013947.1 )，优选酿酒酵母，或 2)来源于其它细菌，类肠球菌faecaliS^) (GenBank: WP—016626966.1)，金黄色酿胺葡萄球菌aureus) (GenBank: AIA27148.1),屎肠球菌、Enterococcusfaecium) (GenBank: WP—016629841.1)，酿胺链球菌pyogenes)(GenBank:WP—023613167.1);或3)来源于其它生物体，和甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0030]所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(说价^基因)来源于:1)酿酒酵母{Saccharomyces cerevisiae) (GenBank: AY757921.1),优选酿酒酵母，或 2)来源于其它细菌，幾肠球 ^iEnterococcus faecalis、(GenBank: YP_005707688.1)，屎肠球菌(Bnterococcus faecium) (GenBank: EPI24610.1),酿胺链球菌(Sirep1coccWspyogenes) (GenBank: AAL97580.1);或3)来源于其它生物体,和甲轻戍酸-5-二磷酸脱羧酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0031]所述异戍烯焦磷酸异构酶基因iIDIl基因)来源于:1)酿酒酵母iSeicclmromycGScerevisiae) (GenBank:ΝΡ_015208.1)，优选酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，粪肠球菌iEnterococcus faecalis、(GenBank: NP_814639.1),金黄色酿胺葡萄球舊{Staphylococcus aureus) (GenBank: YP_501084.1),屎肠球菌{Enterococcusfaecium) (GenBank: ERK34722.1),酿胺链球菌(Sirep1coccWs pyogenes) (GenBank:YP_001128672.1)或3)来源于其它生物体，和异戊烯焦磷酸异构酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0032]所述异戍二烯合成酶基因(JspS基因)来源于:1)银白杨iPopulus alba )(GenBank: AB198180),优选银白杨，或 2)黑杨nigra ) (GenBank: AM410988),或3)白杨 X 欧洲山杨alba x Populus tremula ) (GenBank: AJ294819)或 4)和异戊二烯合成酶基因同源性超过70%的核酸序列，或3)来源于其它生物体，和异戊二烯合成酶基因没有明显的同源性，但和异戊二烯合成酶基因具有相同或相似功能的核酸序列。
[0033]1.外源基因的克隆 1.1外源基因的克隆
1.1.1鼠伤寒沙门氏菌乙酰辅酶A合成酶基因的克隆
选取来自鼠伤寒沙门氏菌{Salmonella typhimurium LT2)的乙酰辅酶A合成酶基因(.acs), GenBank: 16767525，由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得，之后与载体pGH(上海捷瑞生物工程有限公司)连接得到pGH-a^。
[0034]1.1.2大肠杆菌乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆
提取疋coli的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增乙酰辅酶A合成酶基因，GenBank:accA 110590387 ; accB 110590390; accC 110590391; accD110590392。再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
[0035]扩增引物序列为:
accAD-L:5， -AAAACTGCAGAGTCTGAATTTCCTTGATTTTG-3，
accAD-R:5， -CCCAAGCTTTCAGGCCTCAGGTTCCTGA-3，
accBC-L: 5’ -GGAAGATCTATGGATATTCGTAAGATTAAAAAACT-3>
accBC-R: 5’ -CCGCTCGAGTTATTTTTCCTGAAGACCGAG-3，。
[0036]1.1.3链霉菌乙酰乙酰辅酶A合酶基因的克隆
来自链霉菌sp.CL190)的乙酰乙酰辅酶A合酶基因Caac1S^GeneID: 325302226，由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。之后与所述载体pGH连接得到pGH~aacs。
[0037]1.1.4屎肠球菌3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因的克隆提取屎肠球菌的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(GenBank: AAG02443.1)，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
[0038]扩增引物序列为:
HMGS-F: 5’ -ATGCGGCCGGCCATGAAAATAGGGATTGATCGTCTTT-3> ；
HMGS-R: 5’ -ATCGGCGATCGCTTATATTTTGTAGTAACGA-3，。
[0039]1.1.5屎肠球菌羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的克隆
提取屎肠球菌的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(GenBank: YP_005354442.1)，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
[0040]扩增引物序列为:
HMGR-F: 5’ -ATGCCCATGGATGAAAGAAGTCGTTATGATAG-3> ；
HMGR-R: 5’ -ATTGGGATCCTTATTTTTCCCGGATTTTTTCCA-3，。
[0041]1.1.6酿酒酵母MVA下游代谢途径基因的克隆
酿酒酵母MVA下游代谢途径基因包括四个基因'ERG12，ERG8, ERG19和IDIl。四个基因的克隆参照文献获得(Jianming Yang, Guang Zhao, Yuanzhang Sun, Yanning Zheng,Xinglin Jiang, Wei Liuj Mo Xian*.B1—isoprene product1n using exogenousMVA pathway and isoprene synthase in E.col1.B1resource Technology, 2012，104:642 - 647.)
1.1.7银白杨异戊二烯合成酶基因的克隆
选取来自于alba 的基因{ispSPi0 GenBank N0.AB198180)基因序列进行稀有密石马子分析(http://www.genscript.com/ cg1-bin/tools/ rare_ codon_analysis),并将其稀有密码子优化为疋coli偏好的密码子(http://www.jcat.de/)。优化后的异戊二烯合成酶基因、ispSj送上海捷瑞公司进行化学合成，连入pGH载体上分别形成pGH-1spSPa载体。
[0042]2.表达载体的构建
2.1 pYJM8载体的构建
pYJM8载体(即载体pACY-15775>3),其构建参照文献获得(Jianming Yang, Guang Zhao,Yuanzhang Sun, Yanning Zheng, Xinglin Jiang, Wei Liu, Mo Xian*.B1-1sopreneproduct1n using exogenous MVA pathway and isoprene synthase in E.col1.B1resource Technology, 2012, 104:642 - 647.)?
[0043]2.2 pYJM14载体的构建
PYJM14载体(即载体pTrc-汾)，其构建参照文献获得(JianmingYang, Guang Zhao, Yuanzhang Sun, Yanning Zheng, Xinglin Jiang, Wei Liu, MoXian*.B1-1soprene product1n using exogenous MVA pathway and isoprenesynthase in E.col1.B1resource Technology, 2012, 104:642 - 647.)
2.3 pYJM52载体的构建
利用下列引物 accAD-L (5，-AAAACTGCAGAGTCTGAATTTCCTTGATTT TG-3’)和 accAD-R (5，-CCCAAGCTTTCAGGCCTCAGGTTCCTGA-3，)和大肠杆菌基因组为模板扩增acc基因的accAD片段(两端带有与载体连接的相应酶切位点)。
[0044]将pCOLADuet-1 载体(Novagen 公司)与基因 accAD 分别用 Pst I 和 Hind III 进行双酶切，酶切后的载体与两端带有相应酶切位点的acdi?基因按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4?6 h，连接产物转化疋coli DH5 α，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR扩增筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM52(pC0L-acc仙)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。质粒构建图谱如图2所示。
[0045]2.4 pYJM53载体的构建
利用下列引物 accBC-L (5，-GGAAGATCTATGGATATTCGTAAGATTAA AAAACT-3’)和 accBC-R(5’ -CCGCTCGAGTTATTTTTCCTGAAGACCGAG -3’ )和大肠杆菌基因组为模板扩增acc基因的片段(两端带有与载体连接的相应酶切位点)。
[0046]将pYJM52载体与accl片段分别用奴7 JJ和通ο /进行双酶切，酶切后的载体与外源基因片段acMC按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4?6 h，连接产物转化疋coli DH5 α，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJMSSbCOL-acdi^C)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。质粒构建图谱如图3所示。
[0047]2.5 pYJM54载体的构建
如图4所示，将所述载体pGH-aa与所述载体pYJM53分别用Nde I和Bgl II进行双酶切，酶切后的载体PYJM53与外源基因片段aa按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4?6 h，连接产物转化疋coli DH5a，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJMSMpCOL-acdi^C-aa)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。质粒构建图谱如图4所示。
[0048]2.6 pYJM55载体的构建
如图5所示，将所述载体pGH-aaa与所述载体pYJM54分别用Xho I和Pac /进行双酶切，酶切后的载体PYJM54与外源基因片段aaa按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4?6 h，连接产物转化疋coli DH5 a，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM55 (vCOL-accADBC-acs-aacs)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。质粒构建图谱如图5所示。
[0049]2.7 pYJM56载体的构建
利用下列引物 HMGS-F: (5，-ATGCGGCCGGCCATGAAAATAGGGATTGAT CGTCTTT-3’)和HMGS-R: (5’ -ATCGGCGATCGCTTATATTTTGTAGTAACGA -3’)和屎肠球菌基因组为模板扩增邏51?基因(两端带有与载体连接的相应酶切位点)。
[0050]将PYJM8载体与基因mi?分别用/和/^ra /进行双酶切，酶切后的载体PYJM8与外源基因片段mi?按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4?6 h，连接产物转化疋coli DH5a，然后涂布加有氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM56 (pACY-1sA^-mS)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。质粒构建图谱如图6所示。
[0051]2.8 pYJM57载体的构建
利用下列引物 HMGR-F (5，-ATGCCCATGGATGAAAGAAGTCGTTATGA TAG-3，)和 HMGR-R (5 ’ -ATTGGGATCCTTATTTTTCCCGGATTTTTTCCA-3> )和屎肠球菌基因组为模板扩增邏況基因(两端带有与载体连接的相应酶切位点)。
[0052]将pYJM56载体与基因HMGR分别用Nco I和BernH I进行双酶切，酶切后的载体PYJM56与外源基因片段趟--按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4?6 h，连接产物转化疋coli DH5 α，然后涂布加有氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒PYJM57 ^kC1-HMGR -1spSP~HMGS)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。质粒构建图谱如图7所示。
[0053]3.E.co7i重组菌株的构建
将载体 PYJM57 {vkC1-HMGR-1spSP-HMGS)、pYJM14 i^\rc-ERG12-ERG8- ERG19-1DI1)和pYJ155 (pCOL-accADBC-acs-aacs)重组质粒共同热击转化万.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有卡那霉素、氯霉素和氨苄青霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得YJM57工程大肠杆菌。
[0054]本发明获得的重组细胞包含下述基因片段:乙酰辅酶A合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5- 二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、异戊二烯合成酶，该重组大肠杆菌能够从乙酸合成异戊二烯。
[0055]所述的重组细胞为细菌细胞，如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌或真菌细胞(如酿酒酵母)，或微藻等通过基因工程技术构建而成的。
[0056]所述的重组细胞可以用于制备化合物或组合物，所述化合物和组合物包括:异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯一异戊二烯一苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。
[0057]4.工程菌发酵实验
将构建好的重组质粒转化到感受态细胞中，通过发酵罐发酵对重组菌进行发酵培养，利用气象色谱技术对发酵产物进行定性和定量的检测。
[0058]挑取单克隆到50ml含有醋酸钠的M9种子培养基(I L M9 salts:5 g NaAc, 6 gNa2HPO4, 3 g KH2PO4,1 g NH4Cl, 0.5 g NaCl, 0.24 g MgSO4,121° C 高压蒸汽灭菌 15min。)中，37°C，180rpm活化过夜(18-24h)。将种子按10%的接种量接种至含有2L发酵培养基(14.6 g/L K2HPO4, 4 g/L KH2PO4, 10 g/L (NH4)2SO4, 2 g/L 柠檬酸钠，2.05 g/L 醋酸钠，0.117 g/L甜菜碱，0.011 g/L氯化钙，0.72 g/L硫酸镁，IX维生素(Sigma)和IX微量元素溶液.1000X微量元素溶液(每升)含有钥酸铵0.123mg;硫酸锌0.097mg;硼酸 0.823mg;硫酸铜 0.083mg;氯化锰 0.527mg ,4ml IM 硫酸镁，1900ml 蒸馏水)的5L小型发酵罐中，通气量1.3 VVM，转速400rpm，37° C培养至OD6tltl约为12时，0.25mM IPTG，30°C诱导表达，以纯醋酸调pH，控制pH在7.0，每隔8h补加一次IPTG。得到的异戊二烯产物通过GC对其进行定性和定量分析。每4h取发酵液5ml，测定细胞0D_、葡萄糖浓度；每15min取尾气1ml，利用气相色谱检测产物异戊二烯浓度。直到OD不再变化，产物不再产生为止。
[0059]检测条件:GC系统采用山东鲁南瑞虹SP-6890型气相色谱仪，色谱柱为HP-1NNOffAX column(25 mX250 ymX0.2 μ m)，检测器为FID检测器；气化室温度200 °C，检测器温度230 °C，载气流速:lml/min.柱升温程序为:50°C保温0.5min,
4 V Mn 升至 70 V，
25 0C /min 升至 250 °C，保温 5min。
[0060]图8表明，工程菌YJM57的异戊二烯产量(■)和细胞生长(▲)。当工程菌细胞生长12h开始进行诱导培养。
[0061]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
【权利要求】
1.一种以乙酸为原料合成异戊二烯的方法，其特征在于它包括以下步骤: (1)依次构建分别含有acs基因、SCC1S基因的载体pGH-acs、pGH-aacs； (2)构建含有Jsa?基因的载体*CY-1spSPa;构建含有ERG12基因、ERG8基因、ERG19基因和 基因的载体 ； 扩增acc基因的accAD片段，将pCOLADuet_l载体与accAD片段分别用Pst I和Hind///进行双酶切，酶切后的载体与两端带有相应酶切位点的acdi?基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pCOL-acdi?； 扩增acc基因的accBC片段，将pC0L_acc仙与accBC片段分别用Bgl II和Xho I进行双酶切，酶切后的载体与acMC基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为含有accADBC基因的重组质粒pCOL-ac^^1 ； 所述pGH-acs与所述载体分别用Nde I和Bgl II进行双酶切，酶切后的载体与外源基因片段aa按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒ViChccADBC-acs ； 所述pGH-aacs与所述载体pCOL-accylflZC-acs分别用ZSo J和Pac J进行双酶切，酶切后的载体与外源基因片段aaa按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒vOdL_3CCJWBCy3CS_33CS ; (3)扩增HMGS基因，将所述pkCY-1spSPa与基因HMGS分别用FseI和PvuI进行双酶切，酶切后的载体与外源基因片段mi?按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒V似_ispSPa-HMGS ； 扩增HMGR基因，将pkC1-HMGS-1spSPa与基因HMGR分别用Nco I和BatnH I进行双酶切，酶切后的载体与外源基因片段嫌從按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒xAC1-HMGR-1spSPa-HMGS ； (4)将载体 vWX-HMGR-1spSPa-HMGS、pTrc-ERG12~ERG8~ERG19-1DIl 和\>COL-accADBC-acs-aacs共同转化大肠杆菌,涂布于加有卡那霉素、氯霉素和氨节青霉素抗生素的LB固体平板，获得阳性克隆YJM57工程大肠杆菌； (5)将活化后的YJM57工程大肠杆菌接种到含有卡那霉素、氯霉素或氨苄霉素的LB液体培养液中培养，当OD6tltol为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂至终浓度0.5 mmol.L—1，然后转入在30°C下继续诱导培养24h，发酵获得异戊二烯。
2.根据权利要求1所述的以乙酸为原料合成异戊二烯的方法，其特征在于:所述基因来源于:鼠伤寒沙门氏菌中GenBank: 16767525、粗糙脉孢菌中GenBank:BAJ83612、酿酒酵母中GenBank: EDN59693、酿酒酵母中GenBank:NP_009347、拟南芥中GenBank:AED94121、大肠杆菌中 GenBank:AAC43163 ； 所述accylflZC基因来源于:谷氛酸棒杆菌中GenBank: KEI22444、大肠杆菌中GenBank:accA:110590387; accB: 110590390; accC: 110590391; accD 110590392、乙酸钙不动杆菌中 GenBank: accA: 50086048; accB: 50084890; accC:50086323; accD:50083297。
3.根据权利要求1所述的以乙酸为原料合成异戊二烯的方法，其特征在于:所述aaa基因来源于:链霉菌中GenBank:AB272317.1、烟曲霉中GenBank: KEY79579、苏云金芽孢杆菌中 GenBank:EEN03006 ； 所述HMGS基因来源于:酿酒酵母中GenBank: YM4987.09C、粪肠球菌中GenBank:ESU74184.1、金黄色酿胺葡萄球菌中GenBank: YP_501316.1、尿肠球菌中GenBank:AAG02443.1 或酿脓链球菌中 GenBank: AAL97584.1。
4.根据权利要求1所述的以乙酸为原料合成异戊二烯的方法，其特征在于?.臟HMGR基因来源于:酿酒酵母中GenBank: YLR450W、屎肠球菌中GenBank: ΥΡ_005354442.1、粪肠球菌中GenBank: AAG02438.2、金黄色酿脓葡萄球菌中GenBank: AAG02423.1、酿脓链球菌中 GenBank: WP_030125991.1 ； 所述汾基因来源于:酿酒酵母中GenBank: NP_013935.1、粪肠球菌中GenBank:EPI38248.1、金黄色酿胺葡萄球菌中GenBank: ABR51486.1、尿肠球菌中GenBank:EFS06266.1、酿脓链球菌中 GenBank: AFV37808.1。
5.根据权利要求1所述的以乙酸为原料合成异戊二烯的方法，其特征在于:所述基因来源于:酿酒酵母中GenBank: NP_013947.1、粪肠球菌中GenBank: WP_016626966.1、金黄色酿胺葡萄球菌中GenBank: AIA27148.1、尿肠球菌中GenBank: WP_016629841.1、酿脓链球菌中 GenBank: WP_023613167.1 ； 所述汾基因来源于:酿酒酵母中GenBank: AY757921.1、粪肠球菌中GenBank:YP_005707688.1、屎肠球菌中GenBank: ΕΡΙ24610.1、酿脓链球菌中GenBank: AAL97580.1。
6.根据权利要求1所述的以乙酸为原料合成异戊二烯的方法，其特征在于'驗皿1基因来源于:酿酒酵母中GenBank:ΝΡ_015208.1、粪肠球菌中GenBank: ΝΡ_814639.1、金黄色酿脓葡萄球菌中GenBank: ΥΡ_501084.1、屎肠球菌中GenBank: ERK34722.1、酿脓链球菌中 GenBank: ΥΡ_001128672.1 ； 所述/?sa?基因来源于:银白杨中GenBank:AB198180、黑杨中GenBank:AM410988、白杨X 欧洲山杨中 GenBank:AJ294819。
7.根据权利要求1所述的以乙酸为原料合成异戊二烯的方法，其特征在于:所述步骤(5)中诱导剂为IPTG0
8.一种合成异戊二烯的重组细胞，其特征在于所述重组细胞包含对应编码产生乙酰辅酶A合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶的基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5- 二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、异戊二烯合成酶，该重组细胞能够从乙酸合成异戊二烯。
9.根据权利要求8所述的重组细胞，其特征在于所述的重组细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或微藻。
10.根据权利要求8所述的重组细胞在制备化合物或组合物中的应用，其特征在于所述化合物和组合物包括:异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。
【文档编号】C12N1/21GK104372031SQ201410617430
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】杨建明 申请人:青岛农业大学