一种基于lamp技术对多菌灵高抗灰葡萄孢菌株的快速检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种对多菌灵高抗灰葡萄孢菌株的快速检测方法，可用于引起作物灰霉病的灰葡萄孢菌对多菌灵的抗性群体的动态监测及流行预警。本发明是以环介导恒温扩增技术(LAMP)为基础建立起来的一种快速、便捷、特异性强、灵敏度高和成本低廉的分子检测技术。该检测方法通过在灰葡萄孢菌对多菌灵的高抗菌株的β微管蛋白上设计2对特异性引物，进行LAMP扩增，根据反应产物颜色判定是否为灰葡萄孢菌对多菌灵的高抗菌株。LAMP扩增产物显示为天蓝色，电泳图谱呈梯状条带，有产物扩增，鉴定为灰葡萄孢菌对多菌灵的高抗菌株；LAMP扩增产物显示为紫色，电泳图谱无条带，无产物扩增，鉴定为灰葡萄孢菌对多菌灵的非高抗菌株。本发明简便、快速、成本低，对作物灰霉病的抗性风险评估及合理用药具有重要的现实意义。
【专利说明】一种基于LAMP技术对多菌灵高抗灰葡萄孢菌株的快速检 测方法
【技术领域】
[0001] 本发明是基于环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification， LAMP)对灰葡萄孢菌的多菌灵高等抗性水平菌株的快速分子检测方法，可用于灰葡萄孢菌 对多菌灵抗性群体发展的动态监测与抗性风险评估，为灰霉病的抗性治理、流行预警及合 理用药指导提供重要的理论依据。
【背景技术】
[0002] 环介导恒温扩增反应（LAMP)是2000年由日本学者Notomi等发明的一种新颖的 恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是：利用一 套（4种）特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应， 60?65 °C范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物--白色的焦磷酸镁沉淀 产生。羟基萘酚蓝（HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不 同的颜色，阴性（没有扩增出产物）时为紫色，阳性（有产物扩增）时为天蓝色。LAMP方 法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小 时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度 高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原的快速诊断及抗性检测。
[0003] 灰霉病是一类由灰葡萄孢（Botrytis cinerea)引起的植物真菌病害，可危害200 多种蔬菜、果树以及观赏性植物等重要的经济作物，该病的发生可引起植物幼苗、果实及贮 藏器官的猝倒、落叶、花腐、烂果及烂窑，造成严重的经济损失。近年来，随着保护地蔬菜生 产的发展，加重了灰霉病的发生和流行。目前由于作物种质资源缺少高抗灰霉病的品种，采 用化学药剂是控制灰霉病最有效方便的途径之一。多年来，灰霉病主要采用苯并咪唑类杀 菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行防治。但是随着使用年限的增长的使用剂量的增加， 田间逐渐产生了抗药性群体，从而导致该病防效显著下降。经过多年的研究，南京农业大学 杀菌剂生物学实验室发现灰葡萄孢菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由灰葡萄孢菌β-微 管蛋白基因（BC1G_00122)突变造成，该基因编码第198位氨基酸密码子的突变可引起灰葡 萄孢菌对多菌灵高等抗药性的产生。198位氨基酸的突变可分为3种突变基因型，分别为 GAG(Glu) - GCG (Ala)、GAG (Glu) - AAG(Lys)和 GAG (Glu) - GTG (Val)，约占所有抗药性突 变类型总量的96%，成为病原菌产生田间抗药性的主要原因。
[0004] 病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例达到3%时，即可引起抗 药性病害流行，导致药剂防治失败。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养 基上培养，再根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴别抗药性。本发明在抗药性机制研究的基 础上，基于LAMP技术能快速、准确检测灰葡萄孢菌对多菌灵的抗药性。该检测方法具有简 单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对灰霉病的有效防治、抗药性流 行预警具有重要的现实意义。然而，经检索目前国内外尚未有灰葡萄孢菌对多菌灵高抗菌 株的LAMP快速分子检测的相关报道。
【发明内容】
[0005] 已报道的灰葡萄孢菌对多菌灵抗性菌株的鉴定及检测方法存在费时、费力、成本 高的缺点。针对这一缺点，根据灰葡萄孢菌对多菌灵高抗菌株的基因型，通过实验条件优 化，建立了一种快速检测灰葡萄孢菌对多菌灵高抗菌株的方法。该方法具有简便、快速、省 时省力、灵敏度高、检测成本低等特点，对灰霉病的抗药性监测、控制病害发生与流行、指导 合理用药及减少经济损失具有实用价值。目前在国内外，本发明是LAMP技术在灰葡萄孢菌 对多菌灵抗性检测中的首次报道。
[0006] 田间采集的多菌灵抗性灰葡萄孢菌株的96%左右的突变类型是由于灰葡萄孢菌 的β微管蛋白基因编码的第198位氨基酸密码子突变造成的。该位点的突变可分为3种突 变基因型，分别为 GAG(Glu) - GCG(Ala)、GAG(Glu) - AAG(Lys)和 GAG(Glu) - GTG(Val)。 本发明所述的快速检测灰葡萄孢菌对多菌灵高等抗性水平菌株的分子生物学方法，可同时 检测上述3种突变基因型，步骤是：
[0007] (1)在灰葡萄孢菌的β微管蛋白基因上包括198位氨基酸的序列设计1对外引物 和1对内引物，利用该引物在恒温条件下，进行LAMP扩增；
[0008] ① LAMP反应所用的外引物对：
[0009] F3 ：GCAACTCTCTCTGTCCATCAA
[0010] B3 ：GCCAACTTTCGGAGATCTGA
[0011] ②LAMP反应所用的内引物对：
[0012] FIP ：GGTTGCTGAGCTTCAAGGTTCTCAGGTTGAGAACTCTGACAYGAC
[0013] BIP ：TCTTAACCACTTGGTTTCCGCCGAAGTTGACCAGGGAAACGG
[0014] ③LAMP最佳反应体系及条件：
[0015] 反应体系（10 μ L):
【权利要求】
1. 一种基于LAMP技术快速检测灰葡萄孢菌对多菌灵高抗菌株的分子生物学方法，该 方法共分三步： (1) 运用两对特异性引物对待测样品的基因组DNA进行LAMP恒温扩增，其中所述的两 对特异性引物的碱基序列分别是： LAMP反应所用的外引物对： F3 :5' -GCAACTCTCTCTGTCCATCAA-3' B3 :5, -GCCAACTTTCGGAGATCTGA-3' LAMP反应所用的内引物对： FIP ：5, -GGTTGCTGAGCTTCAAGGTTCTCAGGTTGAGAACTCTGACAYGAC-3, BIP :5' -TCTTAACCACTTGGTTTCCGCCGAAGTTGACCAGGGAAACGG-3' 反应体系： DNA 聚合酶 8υ/μ? 0.3 μ? l〇xThermoPol Buffer 1.0 μ? MgCb 25mM 1.4 μ? dNTP 10 mM 1.0 μ? FIP 40 μΜ 0.3 μ!^ BIP 40 μΜ 0.3 μ? F3 10 μΜ 0.2 μ? Β3 10 μΜ 0.2 μ? 甜菜碱 8 Μ 0.8 μ? ΗΝΒ 2.5 mM 0.8 μ?^ 基因组DNA 0.4 μ? 无菌 ddH2〇 3.3 μ? 反应参数： 62〇C 60min,80〇C lOmin ； (2) 对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3. 0%琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩 增结果； (3) 鉴定是否为灰葡萄孢菌对多菌灵高抗菌株；LAMP扩增产物显示天蓝色，电泳图谱 应为梯状条带，判定为灰葡萄孢菌对多菌灵的高抗菌株；扩增产物为紫色，电泳图谱无条带 扩增，判定为灰葡萄孢菌对多菌灵的非高抗菌株。
【文档编号】C12Q1/68GK104293971SQ201410619316
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】段亚冰, 周明国, 杨莹, 张晓柯, 王建新, 曹君红 申请人:南京农业大学