一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程【技术领域】。本发明所提供的基因工程菌是共表达乙酰辅酶A合成酶基因acs、苹果酸酶基因maeB、聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA的基因工程菌。同时本发明还提供了基因工程菌的构建方法。本发明所提供的基因工程菌能够以乙酸为原料合成间苯三酚，具有生产成本低，产量高的特点，产量可达1.2g/L以上，最高产率可达30％，为理论产率的52％，适用于产业化推广。
【专利说明】一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]间苯三酚又名1，3，5-三羟基苯、均苯三酚，是重要的精细化工产品，可以用作药物合成的中间体、燃料耦合剂、轮胎增粘剂以及偶氮复合油墨等原料，在纺织品及皮革染色工艺、生产塑料胶囊、替代碘化银用于人工降雨等方面有广泛应用。除此之外，间苯三酚本身还是一种优良的医药产品，性能优越的抗养护剂，早已广泛用于抗菌、防腐等。
[0003]早在20世纪50年代，间苯三酚的化学合成工艺就已经建立起来并应用到工业生产中，包括2，4，6-三硝基甲苯(TNT)途径、1，3，5-三异丙基苯途径等。但传统的化学合成工艺后处理较难、污染环境且原料存在安全隐患，同时副产物的存在使得间苯三酚的分离精制比较困难。
[0004]生物催化是以酶为催化剂来完成的化学反应，反应条件温和，对环境友好；以可再生资源为底物的生物催化合成，是解决全球能源危机的有效途径，近年来研究非常活跃。间苯三酚及其衍生物的生物催化合成途径主要是在对荧光假单胞菌PhlACBDE基因簇的功能分析的基础形成的。通过反向遗传学的手段，研究者发现了间苯三酚合成的关键基因phlD，PhlD蛋白可催化小分子底物丙二酸单酰辅酶A聚酮缩合及环化等一系列反应，最终生成间苯三酚，这一研究使生物法合成间苯三酚成为可能。研究者已在大肠杆菌中过表达PglD及marA基因，以葡萄糖为碳源进行发酵,最终间苯三酹产量能够达到3.8g *L-1 (YujinCao,et al.1mproved phloroglucinol product1n by metabolically engineeredEscherichia col1.Appl Microb1l B1technol (2011)91:1545 - 1552)。由于葡萄糖成本较高，限制了生物法的广泛应用，寻找更廉价的碳源，降低生物法制备间苯三酚的成本是现有技术亟待解决的问题。
[0005]乙酸作为一种价廉易得的可替代碳源，从工业废液中回收乙酸，作为工程大肠杆菌的碳源，发酵生产间苯三酚，既可回收利用资源，又可减轻环境污染，同时还能降低生产成本，具有广阔的应用前景。乙酸在大肠杆菌体内的代谢途径，有2种代谢方式，一是以由乙酰辅酶A合成酶(ACS)催化生成乙酰辅酶A，一是由乙酸激酶(ACK)和磷酸转乙酰酶(PTA)催化生成乙酰辅酶A (Alan J.Wolfe, Microb1l.Mol.B1l.Rev.2005，69 (I): 12-50)。但目前尚没有利用乙酸发酵生成间苯三酚的菌株报道，以乙酸为原料生物合成间苯三酚是否可行尚无法确定。
【发明内容】
[0006]为解决以葡萄糖为原料生产间苯三酚成本过高的问题，本发明提供了一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌，所采取的技术方案如下:
[0007]本发明的目的之一在于提供一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌，其特征在于，是是共表达乙酰辅酶A合成酶基因acs、苹果酸酶基因maeB、聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA的基因工程菌。。
[0008]上述基因可来源于化学合成、扩增自微生物或扩增自重组质粒。
[0009]优选地，所述乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB，来源于枯草芽孢杆囷、烟曲霉囷或大肠杆囷。
[0010]优选地，乙酰辅酶A合成酶基因acs来自大肠杆菌的,来自大肠杆菌的，Gene ID:12933681 ;所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌的，Gene ID:12931931。
[0011]本发明的另一目的在于提供了一种所述基因工程菌的构建方法，该方法的步骤如下:
[0012]I)获得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB ；
[0013]2)构建含有聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA的重组质粒；
[0014]3)构建含有乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB的重组质粒；
[0015]4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到宿主菌中，获得基因工程菌。
[0016]所述方法中乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB,来源于枯草芽孢杆囷、烟曲霉囷或大肠杆囷。
[0017]所述方法中所述乙酰辅酶A合成酶基因acs优选来源于大肠杆菌的，Gene ID:12933681 ;所述苹果酸酶基因maeB优选来源于来自大肠杆菌的，Gene ID:12931931。
[0018]所述方法的具体步骤如下:
[0019]I)获得聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB ；
[0020]所述乙酰辅酶A合成酶基因acs,来自大肠杆菌，Gene ID:12933681 ;所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌，Gene ID:12931931 ；
[0021]2)将步骤I)所得的聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA克隆到质粒载体pET30上,构建重组质粒pET-pdlD-marA ；
[0022]3)将步骤I)中所得的乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB克隆到质粒载体pACYC-Duet上,构建重组质粒pACYC-maeB-acs ；
[0023]4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到大肠杆菌BL21 (DE3)中，得到重组大肠杆菌。
[0024]本发明的另一目的在于提供一种利用所述基因工程菌生产间苯三酚的方法，该方法的步骤如下:
[0025]I)获得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰辅酶A合成酶基因acs
[0026]和苹果酸酶基因maeB ；
[0027]所述乙酰辅酶A合成酶基因acs,来自大肠杆菌，Gene ID:12933681 ;所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌，Gene ID:12931931 ；
[0028]2)将步骤I)所得的聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA克隆到质粒载体pET30上,构建重组质粒pET-pdlD-marA ；
[0029]3)将步骤I)中所得的乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB克隆到质粒载体pACYC-Duet上,构建重组质粒pACYC-maeB-acs ；
[0030]4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到大肠杆菌BL21 (DE3)中，得到重组大肠杆菌；
[0031]5)将步骤4)所得的重组大肠杆菌按体积比1% -5%的接种量接种到乙酸培养基中发酵生产间苯三酚，发酵条件为:发酵温度为30-37°C、pH 6-8和培养至0D_为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1-1.0mmol.?Λ培养48小时。
[0032]所述方法中步骤5)所述乙酸培养基，每升含有6g乙酸、2g牛肉粉、Ig甜菜碱、KH2P042.5g、(NH4) 2S043g、柠檬酸-H2O lg, KCl 1.86g、FeS04_7H20 80mg、MgS04_7H20 0.24g,用NaOH将pH回调至7.0。
[0033]本发明所提供的基因工程菌，用于发酵生产以间苯三酚为中间产物的代谢产品。
[0034]本发明有益效果:
[0035]1.本发明构建的大肠杆菌能够转化乙酸生成间苯三酚。
[0036]2.利用本发明方法以乙酸为碳源，间苯三酚的产量可达到lg/L以上，最高产率可达到30%，为理论产率的52%。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1 pACYC-acs 质粒图谱。
[0038]图2 pACYC-maeB-acs 质粒图谱。
[0039]图3不同菌株间苯三酚产量、产率。
[0040]图4间苯三酚发酵过程曲线。
【具体实施方式】
[0041]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0042]以下实施例所采用的分子生物学方法均为常规技术手段，而发酵生产间苯三酚或以间苯三酚为中间产物的目标产物的方法也均为普通发酵过程优化。
[0043]以下实施例所用试剂、材料和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规试剂、材料和仪器，可从商业渠道获取。
[0044]实施例1
[0045]乙酰辅酶A合成酶基因acs,苹果酸酶基因maeB共表达载体的构建,具体过程如下:以寡核苷酸 5’ -CCG GGA TCC ATG AGC CAA ATT CAC AAA CAC-3’ 和 5’ -TTG GAA TTCTTA CGA TGG CAT CGC GA-3’为引物，以大肠杆菌基因组DNA为模版，采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出乙酰辅酶A合成酶基因acs，并在5’端和3’端分别引入BamH I和EcoR I酶切位点，然后用上述酶切位点将此基因克隆到pACY⑶uet-Ι载体上，得到重组质粒 pACYC-acs (图1);以寡核苷酸 5’ -CCG AGA TCT ATG GAT GAC CAG TTA AAA CAA A-3’和5’-TTG GGT ACC TTA CAG CGG TTG GGT TTG-3’为引物，以大肠杆菌基因组DNA为模版，采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出苹果酸酶maeB，并在5’端和3’端分别引入Bgl II和Kpn I酶切位点，然后用上述酶切位点将此基因克隆到pACYC-acs载体上，得到重组质粒pACYC-acs-maeB(图 2)。
[0046]实施例2
[0047]合成间苯三酚的工程大肠杆菌菌株BL21 (DE3)/pACYC-acs-maeB/PET-pglD-marA的制备，并用该菌株发酵转化乙酸为间苯三酚，其具体过程如下:
[0048]采用碱裂解法提取实施例1中构建得到的重组质粒pACYC-acs-maeB与发明人所在实验室已构建的重组质粒PET-pglD_marA(Yujin Cao, et al.Appl Microb1lB1technol (2011)91:1545 - 1552)，采用热击转化法将5μ I重组质粒至转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，然后取50 μ I转化后的菌液涂布于含有34 μ g.mL—1氯霉素与50μ g.mL-1卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，长出的菌落即为共表达乙酰辅酶A合成酶基因及苹果酸酶基因的重组大肠杆菌菌株。挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至LB液体培养基，370C、180rpm振荡培养过夜，然后将菌液按体积比I %的接种量接种到添加34 μ g.mL—1氯霉素与50 μ g.mL—1卡那霉素的以乙酸为唯一碳源的培养基中，乙酸浓度为0.lmol/L，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol.171，发酵24小时；将培养液进行离心，分离细胞和上清，采用液相色谱法检测发酵液上清中的乙酸与间苯三酚含量，并以购买的乙酸与间苯三酚标准品作为对照。通过外标法计算得到，间苯三酚的产量可达到122mg/L，产率可达9.1 %，产率为理论产率的15.6 %。未过表达两酶的菌株发酵液中检测不到间苯三酚，结果如附图3所示。
[0049]实施例3
[0050]用构建好的菌株BL21 (DE3) /pACYC-acs-maeB/PET-pglD-marA 发酵生成间苯三酚，其步骤如下:将培养好的发酵种子按5%的体积比接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中。培养温度37°C，诱导前调整为32°C，溶氧控制在50%。当OD6tltlS 1.0左右时，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol.L'发酵过程通过自动流加氨水，硫酸将pH控制在7.0，补料为3M的乙酸以I %速率流加，每3h取样测定0D，乙酸，间苯三酚。发酵48小时结束后，将样品进行离心，分离细胞和上清，采用液相色谱法检测发酵液上清中的乙酸与间苯三酚含量，并以购买的乙酸与间苯三酚标准品作为对照。通过外标法计算得到，结束发酵时，间苯三酚的产量可达到1.2g/L，最高产率可达30%，为理论产率的52%。结果如附图4所
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[0051]虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌，其特征在于，是共表达乙酰辅酶八合成酶基因苹果酸酶基因1112168、聚烯酮酐合成酶基因迪10和多重抗性因子基因皿1'八的基因工程菌。
2.权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶八合成酶基因％8和苹果酸酶基因脑⑷，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。
3.权利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶八合成酶基因％8，来自大肠杆菌，(^611610:12931931。
4.一种权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下: 1)获得聚烯酮酐合成酶基因汕10、多重抗性因子基因!11虹八、乙酰辅酶八合成酶基因808和苹果酸酶基因111368 ； 2)构建含有聚烯酮酐合成酶基因迪10、多重抗性因子基因的重组质粒； 3)构建含有乙酰辅酶八合成酶基因￡108和苹果酸酶基因1112168的重组质粒； 4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到宿主菌中，获得基因工程菌。
5.权利要求4所述方法，其特征在于，所述乙酰辅酶八合成酶基因和苹果酸酶基因脑68，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。
6.权利要求4所述方法，其特征在于，所述乙酰辅酶八合成酶基因％8，来自大肠杆菌，6611610:12931931。
7.权利要求4所述方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)获得聚烯酮酐合成酶基因汕10、多重抗性因子基因!11虹八、乙酰辅酶八合成酶基因808和苹果酸酶基因111368 ； 所述乙酰辅酶八合成酶基因，来自大肠杆菌，66116 10:12933681 ；所述苹果酸酶基因胍68，来自大肠杆菌，(^6116 10:12931931 ； 2)将步骤1)所得的聚烯酮酐合成酶基因汕10、多重抗性因子基因!11#八、克隆到质粒载体成了30上，构建重组质粒； 3)将步骤1)中所得的乙酰辅酶八合成酶基因％8和苹果酸酶基因脑⑷克隆到质粒载体 1)^1001161:上，构建重组质粒 1)^10111368-308 ； 4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到大肠杆菌8121(023)中，得到重组大肠杆菌。
8.一种利用权利要求1所述基因工程菌生产间苯三酚的方法，其特征在于，步骤如下: 1)获得聚烯酮酐合成酶基因汕10、多重抗性因子基因!11虹八、乙酰辅酶八合成酶基因808和苹果酸酶基因111368 ； 所述乙酰辅酶八合成酶基因，来自大肠杆菌，66116 10:12933681 ；所述苹果酸酶基因胍68，来自大肠杆菌，(^6116 10:12931931 ； 2)将步骤1)所得的聚烯酮酐合成酶基因汕10、多重抗性因子基因!11#八、克隆到质粒载体成了30上，构建重组质粒； 3)将步骤1)中所得的乙酰辅酶八合成酶基因％8和苹果酸酶基因脑⑷克隆到质粒载体 1)^1001161:上，构建重组质粒 1)^10111368-308 ； 4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到大肠杆菌8121(023)中，得到重组大肠杆菌； 5)将步骤4)所得的重组大肠杆菌按体积比1% -5%的接种量接种到乙酸培养基中发酵生产间苯三酚，发酵条件为:发酵温度为30-371、邱6-8和培养至006。。为0.6-0.8，加入诱导剂1？16至终浓度为0.1-1.0臟01.1—沁培养48小时。
9.权利要求8所述方法，其特征在于，步骤5)所述乙酸培养基，每升含有叱乙酸、牛肉粉、18 甜菜碱、狃2？042丨 58、(順4)30438、柠檬酸-％01.868、？6304-7！！20 80呢、1叻04-7！！20 0.24。用恥0?将邱回调至7.0。
10.权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，用于发酵生产以间苯三酚为中间产物的代谢产品。
【文档编号】C12N15/70GK104371966SQ201410636627
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月12日 优先权日:2014年11月12日
【发明者】咸漠, 徐鑫, 曹玉锦, 张汝兵 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所