一种y染色体修饰方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种Y染色体修饰方法及其应用。本发明公开一种动物Y染色体修饰方法，是利用TALEN方法对离体的动物体细胞的Y染色体进行特异性的自杀元件修饰。本发明为选择性培育特定性别的动物、提高育种效率奠定基础。
【专利说明】一种Y染色体修饰方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种Y染色体修饰方法及其应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 动物的性别控制（sex control)技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干 预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术。性别控制技术在畜牧生产中 意义重大。首先，通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制的生产性状（如泌乳） 和受性别影响的生产性状（如生长速度、肉质等）的最大经济效益。其次，控制后代的性别 比例可增加选种强度，加快育种进程。通过控制胚胎性别还可克服牛胚胎移植中出现的异 性孪生不育现象，排除伴性有害基因的危害。
[0003] 性别控制技术最早起源于昆虫"不育技术"的提出，昆虫不育技术主要用于防止和 控制害虫。特别是蚊子，需要释放大量的雄性不育蚊子进入环境，因此，培养过程中需要性 别分离技术或者性控技术，获得大量的雄性蚊子。同时，家蚕这种高经济性状昆虫，也需要 性控技术获得高产丝、低消耗的雄性家蚕。鱼类性别控制的研究，对水产养殖来说，具有 重要的实用意义。因为许多养殖鱼类，其生物学或经济性状诸如生长率、成熟年龄、繁殖方 式、体色、体型和个体大小等雌、雄鱼之间存在差异。因此，人们可以根据需要专门生产全 雌或全雄苗种进行单性养殖以提高经济效益。除了上述物种，家畜动物也迫切需要性别控 制技术，从而提_生广性状，提_经济效益，例如牛、猪、羊和鸡等等。国内外实践表明，在畜 牧业发展中，品种贡献率达到40%以上，因此动物育种技术在促进畜牧业乃至农业发展中 发挥至关重要甚至是不可替代的作用。然而在我国，主要畜牧类品种则严重依赖于进口，在 主要的畜牧类品种中，奶牛品种依赖程度达100%，猪、鸡品种依赖程度接近90% !这意味 着动物农业整个产业链的源头--品种严重依赖于国际市场。因此如果我们国家要进一步 提高畜牧业的效率、进一步保证畜牧业产业链的安全，动物育种则是重中之重。因此，发展 性别控制技术可以大大促进动物育种的发展，大大提高经济效益。
[0004]目前，从昆虫到家畜发展了很多性别控制方法，其中昆虫主要包括：生物学法、传 统遗传学法和转基因技术法。然而，家畜主要利用物理、化学和最新的分子技术的方法，对 精子或早期受孕胚胎进行鉴定，获得想要的性别后代。这里主要介绍这方面研究。目前奶 牛性别控制的常用方法主要包括：x，Y精子的分离、胚胎性别的鉴定和环境控制等方法。
[0005] 第一，X，Y精子的分离。
[0006]原理根据X，Y精子在物理（体积，密度，电荷，运动性）和化学（DNA含量，表面抗 原）等方面的差异，建立的对精子进行分选的各种方法，包括沉降法、电泳法、离心法及其 目前应用比较多的流式细胞分离法、免疫学和FISH技术鉴定方法。
[0007] 流式细胞分离法：主要依据是X、Y精子DNA的含量不同。一般来说，X精子比Y精 子含有较多DNA，所以用荧光染料H 〇echst33342染色时，X精子吸收的染料多，发出的荧光 也强，就此可以分辨出X与Y精子，然后再利用计算机控制使荧光强的X精子带上正电荷， Y精子带上负电荷，在通过高压电场时便向不同的方向偏转，从而达到分离目的，分辨率可 达90 %，但用流式细胞分离器分离精子时，精子需要一个个通过，这样就必须稀释精液，这 就会造成精子的运动能力下降，而且荧光染料对精子有毒害作用，加之效率太低仪器价格 昂贵，在授精后还有产仔数和妊娠率下降的情况，还无法用于生产实践。
[0008] 免疫学方法：随着免疫学的发展人们发现在雄性组织包括Y精子，存在有H- Y抗 原。雄性组织免疫雌性动物产生H-Y抗体，且只有Y精子才能表达H-Y抗原，因而利用H- Y抗体检测精子质膜上存在的H- Y抗原，再通过免疫或分离方法获得X、Y精子。1982年， 研究者Zavos把H- Y抗血清注入母兔阴道内，15分钟后输精，所产生的雌性兔占74. 2%。 H- Y抗血清是利用免疫雌性动物后而获取的，但H- Y抗原自身是一种弱抗原，加之动物个 体自身对免疫反应的差异，很难起到较好的免疫效果，而且分离精子活力下降也会影响受 胎率和产仔数。目前国内外对H- Y克隆抗体都有广泛的研究，可以期望未来免疫学方法能 在控制性别上得到应用。
[0009] FISH技术鉴定法：荧光原位杂交技术（是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂 交样本进行检测的技术）。FISH由于其直观，快速，敏感性高和方便灵活越来越得到广泛的 应用。基本原理是：将标记了荧光的单链DNA(探针）和与其互补的DNA退火杂交，通过观 察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况。即利用Y染色体特异核酸探针与精 子上的特定的序列杂交，而后标定荧光物质，在荧光显微镜下直接观察并区分X精子和Y精 子。该方法特别适用于X精子和Y精子DNA含量差别很微小，重分析不能保证准确性的情 况。最初运用FISH在牛精子上的结果是可清楚鉴定79%的精子。但是该方法的缺陷是耗 费时间长,且试剂的价格较高。
[0010] 第二：胚胎性别的鉴定
[0011] 原理是在胚胎期，利用核型分析法、免疫学法和SRY-PCR鉴定法检测其雌性还是 雄性，从而选着目的性别胚胎进行后续操作。
[0012] 核型分析法：通过查明胚胎细胞的性染色体类型为XX型和XY型来鉴定胚胎的性 另IJ。操作过程为：取少量的胚胎细胞经秋水仙素处理固定染色，检查性染色体，根据染色体 在细胞分裂中期不同的谱带和Y染色体的大小形态来判定性别，这种方法准确率几乎可达 至IJ100%，但操作繁琐，难以在生产中应用。目前主要用来验证其他性别鉴定方法的准确率。
[0013] 免疫学法：先将8细胞桑葚胚期的胚胎与H- Y抗体反应30min，再与异硫氰酸盐 荧光素（FITC)标记的免疫球蛋白IgM抗体反应，然后在荧光显微镜下检查胚胎是否带有荧 光素，若有则判定为H - Y+胚胎，不显荧光则为H - Y-胚胎。在牛有89%的雌性鉴定准确 率，猪有81 %的鉴定准确率，绵羊有85%，的鉴定准确率。
[0014] SRY-PCR法：是一种利用雄性特异性基因探针和PCR扩增技术鉴定胚胎性别的方 法，该方法的原理：在SRY基因核心序列的两侧设计并合成一对特异性引物，分别互补于扩 增序列的两条链，在TaqDNA聚合酶和胚胎细胞DNA存在的条件下，经高温变性，低温退火和 链延伸三个步骤进行DNA扩增，将靶序列扩增至上百万倍以上，经电泳检测扩增结果，能扩 增出SRY序列的为雄性，反之为雌性。Herr等在1990年首先成功的建立了牛胚胎性别鉴定 的PCR法。即通过合成SRY基因或其他Y染色体上特异性片段的部分序列作为引物，在一定 条件下PCR扩增反应能扩增出目标片段的胚胎为雄性胚胎，否则为雌性胚胎。通过PCR扩增 Y染色体DNA可大大增加灵敏度，改善准确率，经活组织取样的胚胎不会有很大的损伤且不 易被黏附在胚胎表面或透明带里的精子污染，还有希望进一步冷冻，将采取的活细胞经PCR 扩增，扩增产物经琼脂糖电泳，染色即可观察有无特异性片段，用PCR扩增的胚胎鉴定的准 确率可达90%以上是目前为止最为理想的胚胎性别鉴定方法之一。正因为如此该方法已被 广泛应用在家畜，特别是牛，羊胚胎的性别鉴定。但这种方法对胚胎具有很大的损伤，且这 种分析需要较长时间，而胚胎在体外的时间和胚胎移入受体时间受到严格的限制，如果在 时间上不能同步，将使移植效率受到影响。为了解决这个问题，人们不得不将进行PCR分析 的胚胎暂时冷冻保存起来，待PCR结果出来后再进行解冻，这样大大增加了操作的难度，并 对胚胎产生进一步的伤害。总之，目前的这些方法不能满足生产应用，急需新的方法。
[0015] 动物转基因技术是生物【技术领域】的研究热点，特别是目前最新发展的人造核酸酶 介导的精确地基因组编辑技术，它的应用范围已经渗透到基础研究、农业、医药等诸多领 域。1997年，首例体细胞克隆绵羊"Dolly"诞生的报道引起了社会各界的强烈关注，同时 也标志着生物领域的一种新的技术一哺乳动物体细胞核移植技术的成功建立。同年报道的 首例利用体细胞核移植技术培育出的转基因绵羊"Polly"的诞生才是动物转基因研究领域 真正的里程碑，它掀开了体细胞核移植技术用于生产转基因大家畜的新篇章，同时伴随着 "人造核酸酶技术"ZFN/TALEN和Cas9等精确基因组编辑技术的出现和发展，与传统的大动 物体细胞核移植技术相结合，可以实现大动物精确基因组修饰及其多基因修饰，大大加快 了大动物转基因技术的发展。尽管，转基因技术不断进展，但是利用此技术进行大动物性别 控制没有研究。
[0016] SRY基因是大多数哺乳动物的性别控制基因，在哺乳动物的性别发育过程中，Y染 色体的存在决定其向雄性发育。在这一过程中起决定作用的基因是Y染色体连锁的Sry， 它是哺乳动物唯一的睾丸决定因子，该基因是位于哺乳动物Y染色体上与性别发生直接相 关的基因，该基因的有无和突变与否直接决定了哺乳动物的性别表型。基因型为XX的带 有SRY基因的个体会以雄性表型存在，SRY基因的突变也会在一定程度上引起性反转或性 别异常，2013年研究人员报道SRY基因敲除小鼠，丧失雄性特征，变为雌性。SRY蛋白属于 含有HMG盒（High mobility group)并特异结合于DNA序列蛋白的一个亚类，该亚类包括 多种转录因子，可以激活下游很多雄性相关基因的表达，从而控制雄性发育。
【发明内容】
[0017] 本发明的目的是提供一种Y染色体修饰方法及其应用。
[0018] 本发明提供一种动物Y染色体修饰方法，是利用TALEN方法对离体的动物体细胞 的Y染色体进行特异性的自杀元件修饰；
[0019] 所述自杀元件能特异性杀死其所在的含有Y染色体的生殖细胞，同时对其所在的 动物的体细胞不产生危害；
[0020] 所述修饰是在Y染色体的性别决定基因SRY上进行修饰；
[0021] 所述TALEN方法是利用TALE蛋白对Y染色体特异靶序列进行突变，同时将自杀元 件同源重组到靶序列位置。
[0022] 上述方法中，所述对离体的动物体细胞的Y染色体进行特异性的自杀元件修饰的 方法为：使TALE蛋白-I和TALE蛋白-II在雄性动物A的离体体细胞中表达，得到Y染色 体上靶序列发生突变的体细胞；同时将自杀元件同源重组到靶序列位置，实现自杀元件在 雄性动物A的离体体细胞Y染色体上靶序列处的定点整合；
[0023] 所述TALE蛋白-I的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；
[0024] 所述TALE蛋白-II的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示；
[0025] 所述靶序列如SEQIDNo.1所示；
[0026] 所述靶序列位于Y染色体的SRY基因上；
[0027] 所述TALE蛋白-I和TALE蛋白-II能分别与SEQIDNo.1中自5'末端起第4 位至第18位、第35位至第48位核苷酸序列特异结合，TALE蛋白-I和TALE蛋白-II中的 FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，使得TALE蛋白-I和TALE蛋白-II 分别与靶序列特异结合位点之间的序列发生突变。
[0028] 上述任一所述的方法中，所述使TALE蛋白-I和TALE蛋白-II在雄性动物A的 离体体细胞中表达的方法为：将分别含有TALE蛋白-I和TALE蛋白-II编码基因的重组 表达质粒导入所述雄性动物A的离体体细胞中；
[0029] 所述TALE蛋白-I的编码基因序列如SEQIDNo.2所示；
[0030] 所述TALE蛋白-II的编码基因序列如SEQIDNo.4所示；
[0031] 所述将自杀元件同源重组到靶序列位置为将所述自杀元件通过线性化的同源重 组载体整合在所述靶序列位置上；
[0032] 所述线性化的同源重组载体上具有靶序列同源左臂-自杀元件-靶序列同源右臂 的片段。
[0033] 上述任一所述的方法中，所述靶序列同源左臂的序列如SEQIDNo.9中自5'末端 起第676位至第1636位核苷酸所示；
[0034] 所述靶序列同源右臂的序列如SEQIDNo.9中自5'末端起第5526位至第6449 位核苷酸所示。
[0035] 上述任一所述的方法中，所述自杀元件包含精子特异性启动子和自杀基因；
[0036] 所述自杀基因在精子成熟过程中被所述精子特异性启动子启动表达，杀死所述自 杀基因所在的含有Y染色体的精子；
[0037] 所述自杀元件的序列如SEQIDNo.9中自5'末端起第1948位至第3730位核苷 酸所示；
[0038] 所述靶序列同源左臂-自杀元件-靶序列同源右臂的的序列如SEQIDNo.9中自 5'末端起第676位至第6449位核苷酸所示。
[0039] 上述任一所述的方法中，所述同源重组载体的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；
[0040] 所述线性化为限制性内切酶Ahdl线性化；
[0041] 所述动物为牛。
[0042] 一种获得雌性动物的方法也属于本发明的保护范围，是利用上述任一所述的方法 对雄性动物A的离体体细胞中的Y染色体进行修饰，得到带有自杀元件的转基因细胞；以转 基因细胞为核供体细胞，通过体细胞克隆技术得到体细胞克隆雄性动物B;以体细胞克隆 雄性动物B为父本，获得的后代均为雌性；
[0043] 所述动物具体为牛。
[0044] 一种试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒含有如下1)_4)的至少一种物 质：
[0045] 1)含有SEQIDNo.3所示蛋白的编码基因的DNA分子、重组载体、表达盒、转基因 细胞系或重组菌；
[0046] 2)含有SEQ ID No. 5所示蛋白的编码基因的DNA分子、重组载体、表达盒、转基因 细胞系或重组菌；
[0047] 3) SEQ ID No. 9所示的DNA分子或含有该分子的转基因细胞系或重组菌；
[0048] 4)含有SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第6449位核苷酸所示的DNA分 子、重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
[0049] 所述SEQ ID No. 3所示的蛋白的编码基因具体如SEQ ID No. 2所示；
[0050] 所述SEQ ID No. 5所示的蛋白的编码基因具体如SEQ ID No. 4所示。
[0051] SEQ ID No. 9所示的DNA分子也属于本发明的保护范围；
[0052]和 / 或，
[0053] 含有SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第6449位核苷酸所示的DNA分子也 属于本发明的保护范围；
[0054]和 / 或，
[0055] SEQ ID No. 2所示的DNA分子也属于本发明的保护范围；
[0056]和 / 或，
[0057] SEQ ID No. 4所示的DNA分子也属于本发明的保护范围。
[0058] 上述试剂盒或上述DNA分子在制备自杀元件修饰动物离体体细胞Y染色体的产品 中的应用也属于本发明的保护范围；
[0059]或，
[0060] 上述试剂盒或上述DNA分子在制备Y染色体上带有自杀元件的雄性动物的产品中 的应用也属于本发明的保护范围；
[0061]或，
[0062] 上述试剂盒或上述DNA分子在制备Y染色体上带有自杀元件的雄性动物细胞的产 品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0063] 所述自杀元件具体如SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第6449位核苷酸所 示的DNA分子，具体位于Y染色体的SRY基因上；
[0064]或，
[0065] 上述试剂盒或上述DNA分子在制备用于动物性别的选择和/或控制的产品中的应 用也属于本发明的保护范围；
[0066]或，
[0067] 上述试剂盒或上述DNA分子在动物繁育中的应用也属于本发明的保护范围；
[0068] 所述动物具体为牛。
[0069] 本发明的原理是首先对雄性动物A体细胞中的Y染色体的性别决定基因SRY进行 "自我杀死含Y染色体精子"元件修饰，同时不破坏SRY基因，将其作为核供体细胞，再通过 体细胞克隆技术得到体细胞克隆雄性动物B，由于体细胞克隆雄性动物B的精子成熟后，Y 染色上的DTA基因特异表达，杀死含有Y染色体的精子，因此含Y染色体的精子死亡，而含 X染色体的精子正常存活，体细胞克隆雄性动物B的精子进行受精获得的个体全部是雌性， 从而达到性别控制的目的。
[0070] 本发明提供的方法为一种通过精确基因修饰的雄性哺乳动物体细胞，进而实现鉴 定和/或选择特定性别动物的目的的方法。本发明为选择性培育特定性别的动物、提高育 种效率奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0071] 图 1 为 pSRY-TALEN-F 和 pSRY-TALEN-R 载体图谱。
[0072] 图2为同源重组供体载体pPRMl-DTA单酶切后的线性图谱。
[0073] 图3为细胞克隆的PCR鉴定结果。
[0074] 图4为克隆牛的PCR鉴定结果。
[0075] 图5为克隆牛的精液PCR鉴定结果。
[0076] 图6为克隆牛的后代性别鉴定的PCR结果。
【具体实施方式】
[0077] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0078] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0079] DMEM/F12+10% FBS培养基按照如下方法配制：该培养基由DMEM/F12和胎牛血清 (FBS)混匀而成，FBS与DMEM/F12的体积比为1 :9。
[0080] pPGKloxPneo2 购自addegen，产品目录号为 13443。
[0081] 成熟液的制备方法如下：将M199培养基和胎牛血清（FBS)按照体积比9:1混匀， 得到混合液，在混合液中加入0. 01U/mL bFSH (促卵泡生长激素）、0. 01U/mL bLH (促黄体生 成素）和1 U g/mL雌二醇。
[0082] 操作液的制备方法如下：将M199培养基和胎牛血清（FBS)按照体积比9:1混匀， 得到混合液，在混合液中加入7. 5 ii g/mL细胞松驰素B。
[0083] Zimmerman液按照如下方法配制：含有0? 3M甘露醇、0? 1M MgS04、0. 05M CaCl2、 0? 5mM HEPES、0. 05g/100mL BSA 的水溶液，pH7. 2,用 0? 22 ii m 滤膜过滤
[0084] A23187 液购自 sigma，货号为 C9275。
[0085] CRlaa培养液按照如下方法配制：114mM氯化钠、3. ImM氯化钾、26. 2mM碳酸氢钠、 20. 4mM丙酮酸钠的水溶液，PH7. 2,用0. 22um滤膜过滤。
[0086] B0液的配制：
[0087] (1) A 液（100ml)
[0088] NaCl 0.8185g KCI 0. 0376g NaH2P04 0 . 0 1 61g MgCl, ? 2H20 0.01:32% CaCl2 0.0311g
[0089] 超纯水100ml定容。
[0090] (2)B 液（100ml)
[0091] NaHC03 1. 1552g
[0092] 超纯水 100ml定容。
[0093] A、B液均经高温消毒后备用。
[0094] (3) B0 液（100ml)
[0095] A 液 80ml
[0096] B 液 20ml
[0097] 丙酮酸钠 0.0138g
[0098] 青霉素 3.lmg
[0099] 链霉素 3.lmg
[0100] 肝素钠 3mg。
[0101] 实施例1、"自我杀死含Y染色体精子"元件精确修饰Y染色体性别控制基因SRY 的种公牛的体细胞的制备
[0102] -、种公牛成纤维细胞系的建立
[0103] 取荷斯坦奶牛种公牛的耳部皮肤组织，将耳部下缘背侧去毛后用体积百分含量为 70 %的乙醇水溶液清洗干净，再用刀片从耳部下缘背侧剔取面积为lcm2左右的皮肤，置于 0°C的DMEM/F12培养基中尽快运回实验室，以PBS和体积百分含量为70%的乙醇水溶液清 洗数遍后剪碎成1mm 3左右的小块，DMEM/F12清洗2遍后分批植块于含lmLDMEM/F12+10% FBS的25cm2的培养瓶中，待组织块贴壁牢固后再补加DMEM/F12+10% FBS至6mL，于37°C、 5% C02培养箱培养6-7d，每2d换液1次，待细胞生长汇合后，以0. 25%胰蛋白酶消化传代 2-3次，分批以细胞冻存液冻存。这样，经原代培养、传代培养、冷冻等体外培养操作，建立了 种公牛成纤维细胞系。
[0104] 二、祀点序列的确定
[0105] 选定的靶序列在SRY基因内部，序列如下：
[0106] 5 '-ctTTCTTGTGCTTATTTTCAATATTGACTTCCTTACTCTCGCTAACAAag-3'(SEQ ID No.1)
[0107] SEQIDNo. 1中自5'末端起第4位至第18位、第35位至第48位核苷酸序列为可被 TALENs蛋白中的结合功能域特异结合的部分，结合位点中间部分为TALENs蛋白的Fok I内 切核酸酶切割识别位点。
[0108] 三、构建作用于SRY基因的TALEN
[0109] pSRY-TALEN-F和pSRY-TALEN-R载体的示意图如图1所示。
[0110] pSRY-TALEN-F中SRY-F的编码基因序列如SEQ ID No. 2所示，SRY-F的氨基酸序 列如SEQ ID No. 3所示，SRY-F即为TALE蛋白-I。
[0111] pSRY-TALEN-R中SRY-R的编码基因序列如SEQ ID No. 4所示，SRY-R的氨基酸序 列如SEQ ID No. 5所示，SRY-R即为TALE蛋白-II。
[0112] TALE蛋白-I和TALE蛋白-II能分别与SEQ ID No. 1中自5 '末端起第4位至第 18位、第35位至第48位核苷酸序列特异结合，TALE蛋白-I和TALE蛋白-II中的FokI 功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，使得TALE蛋白-I和TALE蛋白-II分别与 靶序列特异结合位点之间的序列发生突变；如果TALENs蛋白发挥切割作用，细胞会启动自 身修复机制，在切割位点会出现小片段的删除或者插入，测序结果峰图为杂合峰图。
[0113] 四、构建同源重组供体载体pPRMl-DTA
[0114]1、Notl 单酶切 p2014Gene-l，得到 3070bp 的基因片段（如 SEQ ID No. 6 所示）， 该基因片段含有同源供体载体的5'端同源臂及"自我杀死含Y染色体精子"元件；Notl单 酶切pPGKl 〇XPne〇2,得到6307bp的载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组 质粒，将其命名为pDonor-5HR-DTA，将pDonor-5HR-DTA送测序，结果正确。
[0115] 2、提取步骤一的种公牛成纤维细胞的基因组DNA，以其为模板，以引物B171和 B172为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0116] B171 :5, -AAGGATGCAAGCTAGCCTTCCTTACTCTCGCTAACAA-3' ； (SEQ ID No. 7)
[0117] (下划线所示序列为Nhel酶切识别位点）
[0118] B172 :5' -ATGCAAGTGCGTCGACATCAGATTAATCAGACAGGAT-3'。(SEQ ID No. 8)
[0119] (下划线所示序列为Sail酶切识别位点）
[0120] 该PCR扩增产物为943bp，将其作为同源重组供体载体的3'端同源臂。
[0121] 将该PCR扩增产物连接pMD-19T载体，得到重组质粒，将其命名为pMD19T-3HR，将 PMD19T-3HR送测序，结果正确。
[0122] 3、Nhel和Sail双酶切pMD19T-3HR，得到943bp的基因片段；Nhel和Sail双酶 切pD 〇n〇r-5HR-DTA，得到9. 3kb的载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质 粒，将其命名为PPRM1-DTA，将pPRMl-DTA送测序，结果正确。
[0123] pPRMl-DTA 的序列如 SEQ ID No. 9 所示。
[0124] SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第1636位为靶序列同源左臂、第1948位 至第3730位为"自我杀死含Y染色体精子"元件、第5526位至第6449位为靶序列同源右 臂。
[0125] "自我杀死含Y染色体精子"元件包含精子特异性启动子和自杀基因。
[0126] 五、pPRMl-DTA载体线性化
[0127] 用Ahdl单酶切pPRMl-DTA载体，得到线性化片段，并用无水乙醇法纯化回收线性 化片段，用于转染种公牛成纤维细胞系。
[0128] 线性化载体结构如图2所示。
[0129] 图2中，5HR和3HR代表同源重组的位置，PRM1表示牛的精子特异启动子；DTA为白 喉毒素基因即自杀基因；PGK为磷酸甘油激酶强启动子；Nec/表示新霉素抗性基因；polyA 表示转录终止信号。
[0130] 新霉素抗性基因是为了便于后续的转基因细胞的筛选所设置。
[0131] 六、基因转染
[0132] pPRMl-DTA与TALENs质粒的细胞共转染：将3ug Ahdl酶切线性化的pPRMl-DTA及 3ug TALENs质粒（pSRY-TALEN-F和pSRY-TALEN-R各1. 5ug共转染步骤一制备的种公牛成 纤维细胞（细胞数约2 X 106)得到转基因细胞。
[0133] pSRY-TALEN-F 和 pSRY-TALEN-R 分别编码的 TALE 蛋白-I 和 TALE 蛋白-II 能分 别与种公牛成纤维细胞Y染色体上的SEQ ID No. 1中自5'末端起第4位至第18位、第35 位至第18位核苷酸序列特异结合，TALE蛋白-I和TALE蛋白-II中的Fok I功能域形成 二聚体，发挥非特异性内切酶活性，使得TALE蛋白-I和TALE蛋白-II分别与靶序列特异 结合位点之间的序列发生突变；同时将带有外源基因的Ahdl酶切的线性化pPRMl-DTA导入 后，"自我杀死含Y染色体精子"元件同源重组到靶序列位置，实现种公牛成纤维细胞中的Y 染色体性别控制基因SRY被"自我杀死含Y染色体精子"元件精确修饰。
[0134] 七、PCR鉴定阳性转基因细胞
[0135] 以转基因细胞的基因组DNA为模板，以K0D2-F和K0D2-R为引物，进行PCR扩增，得 到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物为2. lkb的片段，表明转基因细胞为阳性转基因细胞， 同时以ddH20为模板，进行上述实验，作为对照。
[0136] K0D2-F :5，-tgctcctgccgagaaagtat-3，；（SEQ ID No. 10)
[0137] K0D2-R :5, -AAACAGTCTGTGAAGTTACCT-3，。（SEQ ID No. 11)
[0138] 结果如图3所示。
[0139] 图3表明，标号1、6的转基因细胞克隆鉴定为阳性转基因细胞克隆，并对PCR扩增 产物进行测序，结果正确。将阳性转基因细胞作为体细胞克隆核供体细胞，下述实施例中的 转基因细胞均为阳性转基因细胞。
[0140] 实施例2、利用"自我杀死含Y染色体精子"元件精确修饰Y染色体性别控制基因 SRY的种公牛的体细胞培育体细胞克隆种公牛
[0141] 一、卵母细胞的成熟培养
[0142] 从屠宰厂收集成年牛的卵巢，置于30°C的生理盐水，在4h内送到实验室，将卵巢 在37°C的PBS液中清洗三遍后，以直径为0. 7mm针头抽取直径为2-8mm的卵泡，回收形态均 匀、结构致密的卵丘-卵母细胞复合体（COCs)，以成熟液洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞 复合体以50-60枚/孔放入含成熟液的4孔板，在38. 5°C、5 % C02培养箱中成熟培养18-20h 后，得到成熟的细胞，将成熟的细胞放入盛有含体积百分含量〇. 1 %的透明质酸酶的水溶液 的管内振荡2-3min后，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态 完整,细胞质均匀并带有第一极体的卵母细胞为核受体细胞。
[0143] 二、体细胞克隆种公牛的获得
[0144] 1、将带有第一极体的卵母细胞移入操作液中，在200倍显微镜下用玻璃针于极体 上方将透明带切一小口，再用内径为20 y m的玻璃管将第一极体以及其下方的卵母细胞内 的染色体一并吸除，再放入含有体积百分含量20% FBS的M199溶液中洗三遍后，得到去核 的卵母细胞，将其置于培养箱中备用。
[0145] 2、将血清饥饿2-4d的实施例1制备的转基因细胞（核供体细胞）用0. 25%胰蛋白 酶（trypsin)消化2-4min，用20 iim直径玻璃管将直径为10-12 iim的转基因细胞移入步骤 1制备的去核的卵母细胞的透明带内，然后将其放入Zi_erman液中平衡（现用现配）3-5 分钟后放入融合槽内转动卵细胞使核供体细胞与去核的卵母细胞接触而与电场垂直，同时 在场强为2. 5kV/cm的直流脉冲场中，在脉冲时间为10 ii s、脉冲次数为2次、脉冲间隔为Is 的条件下融合（融合仪为BTX公司的ECM-2001)后，得到融合胚，将其迅速移入含有体积百 分含量10% FBS的M199中培养数小时后，挑选融合胚（具体挑选供体细胞和卵母细胞完全 融合的重构胚）进行激活处理。将融合胚放入5mM A23187液中5分钟后换到胚胎激活液 (含5ug/ml细胞松驰素B、10ug/ml放线菌酮的M199培养液）中5小时，待融合胚被激活后 换入含有体积百分含量5%的FBS的CRlaa中，在38. 5°C、5% C02培养箱中培养液中培养7 天后观察融合胚的囊胚发育率，结果表明克隆囊胚发育率为20% -60%。
[0146] 3、胚胎移植与妊娠检测
[0147] 将形态优良的第7d的克隆囊胚移入同期发情的受体牛的子宫角内。在移植后的 第30d对受体母牛进行B超检测以确定受胎情况，并分别在移植后的第60d和第90d进行 直肠检测以确定妊娠率，妊娠率为40%。
[0148] 4、对妊娠母牛按常规饲养方法进行饲养，经过280天，妊娠母牛正常分娩，得到体 细胞克隆种公牛。
[0149] 三、种公牛及的生物学鉴定
[0150] 采集体细胞克隆种公牛耳部组织样，提取其基因组DNA，以基因组DNA为模板，以 K0D2-F和K0D2-R为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，同时以ddH 20为模板，进行上 述实验，作为对照。
[0151] PCR 反应程序：94 °C 5min ;94 °C 30sec，62 °C 30sec，72 °C 120sec，30 个循环； 72。。7min。
[0152] 如果PCR扩增产物为2.lkb的片段，表明基因敲入成功。
[0153] 结果表明共有5头个体，PCR都扩增出2. lkb的阳性片段，如图4所示。进一步将 PCR扩增产物进行测序，结果正确。证实步骤二成功获得体细胞克隆种公牛，该体细胞克隆 种公牛的Y染色体性别控制基因SRY被"自我杀死含Y染色体精子"元件精确修饰。
[0154] 实施例3、体细胞克隆种公牛精液的分子生物学鉴定
[0155] 将实施例2培育得到的体细胞克隆种公牛进行精子采集，然后用PCR方法进行鉴 定，确定其精子是否全是含X染色体的精子，具体步骤如下：
[0156] 以体细胞克隆种公牛精子的基因组DNA为模板，以SRY基因特异的PCR引物SRY-F 和SRY-R为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。同时以ddH 20为模板，进行上述实验， 以野生型荷斯坦奶牛种公牛的精子的基因组DNA为模板，进行上述实验，作为对照。
[0157] 引物序列如下：
[0158] SRY-F:5' -AACGACGATGTTTACAGTCCA-3' ；（SEQ ID No. 12)
[0159] SRY-R:5,-GCCCGGGTATTTGTCTCGGT-3,。（SEQ ID No. 13)
[0160] PCR 反应程序：94 °C 5min ;94 °C 30sec，62 °C 30sec，72 °C 30sec，30 个循环； 72。。7min。
[0161] 含有Y染色体的精子特异含有SRY基因，因此PCR扩增可以扩增出340bp片段，而 只含有X染色体的精子，不能扩增出条带。
[0162] 结果如图5所示。
[0163] 图5表明，体细胞克隆种公牛的精液没有扩增出目的条带，说明体细胞克隆种公 牛含Y染色体的精子自动死亡，只剩下正常的含X染色体的精子。
[0164] 实施例4、体细胞克隆种公牛后代个体的鉴定
[0165] 取Y染色体性别控制基因SRY被"自我杀死含Y染色体精子"元件精确修饰的实施 例2获得的体细胞克隆种公牛的精液，加入到含有肝素（50ug/ml)、咖啡因（0. Olnmol/ml)、 BSA (3. Omg/ml)的B0液中稀释洗涤两遍（以1800转/分钟，离心8分钟），去上清后再加 入lml相同的含有肝素（50ug/ml)、咖啡因（0. 01nmol/ml)、BSA(3. 0mg/ml)的B0液混合均 匀后，取50ul加到50ul的含有20-30枚卵母细胞的受精液（含10mg/ml BSA，不含脂肪酸 的B0液）中共培养5小时后，将其转入到体外培养液CRlaa中继续培养5到7天，待受精 卵发育到桑椹至囊胚期然后移植到受孕母体，得到后代个体进行PCR和形态学进行性别鉴 定。
[0166] 以牛耳细胞的基因组DNA为模板，以SRY-F和为SRY-R为引物，进行PCR扩增，得 到PCR扩增产物。同时以ddH 20为模板，进行上述实验，以野生型荷斯坦奶牛种公牛的精子 的基因组DNA为模板，进行上述实验，作为对照。
[0167] 结果如图6所示。
[0168] 图6表明，野生型荷斯坦奶牛种公牛的精子可以扩增出340bp的目的片段，标号为 1和2的后代个体均没有扩增出目的条带，并且所有的后代个体经形态学鉴定后都显示为 雌性母牛。
【权利要求】
1. 一种动物Y染色体修饰方法，是利用TALEN方法对离体的动物体细胞的Y染色体进 行特异性的自杀元件修饰； 所述自杀元件能特异性杀死其所在的含有Y染色体的生殖细胞，同时对其所在的动物 的体细胞不产生危害； 所述修饰是在Y染色体的性别决定基因 SRY上进行修饰。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述对离体的动物体细胞的Y染色体进 行特异性的自杀元件修饰的方法为：使TALE蛋白-I和TALE蛋白-II在雄性动物A的离 体体细胞中表达，得到Y染色体上靶序列发生突变的体细胞；同时将自杀元件同源重组到 靶序列位置，实现自杀元件在雄性动物A的离体体细胞Y染色体上靶序列处的定点整合； 所述TALE蛋白-I的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示； 所述TALE蛋白-II的氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示； 所述靶序列如SEQ ID No. 1所示。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述使TALE蛋白-I和TALE蛋 白-II在雄性动物A的离体体细胞中表达的方法为：将分别含有TALE蛋白-I和TALE蛋 白-II编码基因的重组表达质粒导入所述雄性动物A的离体体细胞中； 所述TALE蛋白-I的编码基因序列如SEQ ID No. 2所示； 所述TALE蛋白-II的编码基因序列如SEQ ID No. 4所示； 所述将自杀元件同源重组到靶序列位置为将所述自杀元件通过线性化的同源重组载 体整合在所述靶序列位置上； 所述线性化的同源重组载体上具有靶序列同源左臂-自杀元件-靶序列同源右臂的片 段。
4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述靶序列同源左臂的序列如SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第1636位核苷酸所示； 所述靶序列同源右臂的序列如SEQ ID No. 9中自5'末端起第5526位至第6449位核 苷酸所示。
5. 根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述自杀元件包含精子特异性启 动子和自杀基因； 所述自杀基因在精子成熟过程中被所述精子特异性启动子启动表达，杀死所述自杀基 因所在的含有Y染色体的精子； 所述自杀元件的序列如SEQ ID No. 9中自5'末端起第1948位至第3730位核苷酸所 示； 所述靶序列同源左臂-自杀元件-靶序列同源右臂的的序列如SEQ ID No. 9中自5' 末端起第676位至第6449位核苷酸所示。
6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述同源重组载体的核苷酸序列 如 SEQ ID No. 9 所示； 所述线性化为限制性内切酶Ahdl线性化。
7. -种获得雌性动物的方法，是利用权利要求1-6任一所述的方法对雄性动物A的离 体体细胞中的Y染色体进行修饰,得到带有自杀元件的转基因细胞；以转基因细胞为核供 体细胞，通过体细胞克隆技术得到体细胞克隆雄性动物B ;以体细胞克隆雄性动物B为父 本，获得的后代均为雌性。
8. -种试剂盒，该试剂盒含有如下1)-4)的至少一种物质： 1) 含有SEQ ID No. 3所示蛋白的编码基因的DNA分子、重组载体、表达盒、转基因细胞 系或重组菌； 2) 含有SEQ ID No. 5所示蛋白的编码基因的DNA分子、重组载体、表达盒、转基因细胞 系或重组菌； 3. SEQ ID No. 9所示的DNA分子或含有该分子的转基因细胞系或重组菌； 4) 含有SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第6449位核苷酸所示的DNA分子、重 组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述SEQ ID No. 3所示的蛋白的编码基因具体如SEQ ID No. 2所示； 所述SEQ ID No. 5所示的蛋白的编码基因具体如SEQ ID No. 4所示。 9. SEQ ID No. 9所示的DNA分子； 和/或， 含有SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第6449位核苷酸所示的DNA分子； 和/或， SEQ ID No. 2所示的DNA分子； 和/或， SEQ ID No. 4所示的DNA分子。
10. 权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的DNA分子在制备自杀元件修饰动物 离体体细胞Y染色体的产品中的应用； 或， 权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的DNA分子在制备Y染色体上带有自杀元 件的雄性动物的产品中的应用； 或， 权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的DNA分子在制备Y染色体上带有自杀元 件的雄性动物细胞的产品中的应用； 或， 权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的DNA分子在制备用于动物性别的选择和 /或控制的产品中的应用； 或， 权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的DNA分子在动物繁育中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104450673SQ201410646037
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】戴蕴平, 孙照霖, 丁方荣, 王海萍, 李京, 李玲 申请人:中国农业大学