一种抗氧化多肽及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种抗氧化多肽，其氨基酸序列为Tyr-Thr-Ile-Gln-Tyr。本发明进一步提供了所述抗氧化多肽的制备方法，包括以下步骤：1)以鲢鱼鱼肉为原料，加水混合，于80～90℃水浴中静置15～20min，匀浆，得到鱼肉匀浆液；2)在步骤1)所得鱼肉匀浆液中加入胃蛋白酶进行酶解，在95～100℃下保温3～5min，冷却至室温，离心，收集上清液；3)取步骤2)所得上清液，用孔径为2500-3000道尔顿陶瓷膜进行超滤，得到所述抗氧化多肽。本发明所述多肽具有优异的抗氧化功能，可以作为抗氧化原料应用于功能食品中。
【专利说明】一种抗氧化多肽及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水产食品加工领域，具体涉及一种以鲢鱼鱼肉为原料生产的具有抗氧 化功能的生物活性肽，以及该抗氧化多肽的制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质经过水解得到多肽，使得蛋白质的结构被改变，疏水区的活性官能基团暴 露，随着肽键的裂解，游离氨基酸增加，从而可以提供质子或电子源，保持较高的氧化还原 电位，使其具有清除活性自由基的能力，具有抑制脂质过氧化作用的发生，从而抗氧化肽的 抗氧化活性得以提高。氧化对需氧生物特别是脊椎动物和人类是一个重要的代谢过程，但 是它却导致了自由基的形成。自由基是高度不稳定的、易于和其他分子发生化学反应，活性 氧自由基（ROS)被认为能引起氧化应激。氧化应激涉及多种人类疾病如癌症，动脉粥样硬 化，糖尿病，神经系统疾病，如阿尔茨海默病，帕金森氏病等等，以及老龄化。在食品体系中， 脂类或蛋白质可能会受到ROS的攻击经历氧化过程，从而导致食品产生不愉快味道，颜色 发暗，同时也可能产生潜在的毒性产物。抗氧化多肽的应用能使人体免受氧化应激的破坏， 并防止食品成分由于捐献电子给ROS以及中和ROS的负面作用而变质。因此抗氧化肽在医 学、化妆品、生物、食品领域有广泛的应用价值。
[0003] 目前，国内外专利对于抗氧化肽的开发均有所涉及。（1)专利EP1188767A1公开 了一种来源于酪蛋白的抗氧化肽的制备和分离纯化方法；（2)专利US 7273847制备了来自 肺表面活性蛋白化合物的多肽具有抑制脂肪氧化的作用和抗菌性；（3)专利US8232243B2 公开了含有色氨酸和酪氨酸的肽作为抗氧化的方法，这种抗氧化剂可以用于治疗和预防氧 化过程带来的疾病和综合征；（4)专利CN103275180A公开了一种马面飩鱼头蛋白抗氧化肽 及其制备方法和用途，该抗氧化肽的氨基酸序列为Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr (LSHGPY)，分 子量为672Da ; (5)专利CN 103103242A公开了一种抗氧化活性肽及其制备方法，其特征在 于以蓝圆鰺鱼肉蛋白为原料，采用枯草杆菌2709产生的碱性蛋白酶水解，水解液灭酶后经 离心、超滤、凝胶层析和反相高效液相色谱等分离并确定其中两种天然抗氧化肽的结构，其 氨基酸序列分别为His-Asp-His-Pro-Val-Cys (组氨酸-天冬氨酸-组氨酸-脯氨酸-缬 氨酸-半胱氨酸）和His-Glu-Lys-Val-Cys (组氨酸-谷氨酸-赖氨酸-缬氨酸-半胱氨 酸）；（6)专利CN103431158A公开了一种鸭肉蛋白源抗氧化肽的酶法制备工艺，包括酶解底 物的制备、酶解方法和检测等步骤。
[0004] 目前，国内外专利中未见以淡水鱼鱼肉为资源，利用胃蛋白酶制备抗氧化肽的相 关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的在于，针对抗氧化多肽产品开发的现状，提供一种全新的、具有 优异抗氧化性能的多肽。
[0006] 本发明提供了一种抗氧化多肽，其氨基酸序列为：
[0007] Tyr-Thr-Ile-Gln-Tyr。
[0008] 所述多肽可以以鲢鱼鱼肉为原料通过酶解后得到，也可以通过多肽固相合成等方 法得到。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种简便、高效、低成本地制备所述抗氧化多肽的方 法。
[0010] 具体的，所述制备方法包括以下步骤：
[0011] 1)以鲢鱼鱼肉为原料，加水混合，于80?90°C水浴中静置15?20min，匀浆，得到 鱼肉匀浆液；
[0012] 2)在步骤1)所得鱼肉匀浆液中加入胃蛋白酶进行酶解，充分反应后，在95? 100°C下保温3?5min，冷却至室温，离心，收集上清液；
[0013] 3)取步骤2)所得上清液，用孔径为2500-3000道尔顿陶瓷膜进行超滤，得到含有 所述抗氧化多肽的多肽溶液。
[0014] 本发明步骤1)中，水的加入量与鱼肉重量比优选为1?3:1 ;所述匀浆的条件为 10000?13000rpm，匀浆时间优选为1?3min。
[0015] 本发明步骤2)中，胃蛋白酶的加入量与步骤1)所述鲢鱼鱼肉原料的重量比优选 为I :100?300 ;所述酶解的具体条件为：在pH 1. 8?2. 5、35?40°C的条件下进行反应， 酶解反应应该充分进行，反应时间优选为0. 25?2. Oh ;所述离心的条件为4000?6000g， 离心时间优选为5?lOmin。
[0016] 本发明步骤3)中，利用孔径为2500-3000道尔顿陶瓷膜，采用常规操作进行超滤， 收集分子量小于滤膜孔径的多肽的溶液，该混合溶液中富集了本发明请求保护的抗氧化多 肽。该混合溶液进行浓缩、干燥后，可以得到含有目标多肽的多肽混合物。
[0017] 本发明提供的制备方法还可以包括对所述混合溶液/混合物的纯化步骤，纯化产 物经浓缩、冷冻干燥后，即可得到纯度较高的目标抗氧化多肽。
[0018] 所述纯化可以根据本发明请求保护的抗氧化多肽的性质选择特定的凝胶柱、硅胶 柱以及相应的流动相体系，通过常规的色谱法操作进行纯化。
[0019] 具体的，本发明提供的制备方法可以包括以下纯化步骤：取本发明所述步骤3)得 到的多肽溶液，浓缩，使用Sephadex G-25葡聚糖凝胶色谱柱，以去离子水为流动相进行洗 脱，收集含有目标多肽的洗脱液。
[0020] 本发明提供的制备方法可以进一步包括以下纯化步骤：取经S印hadex G-25凝胶 色谱柱洗脱得到的洗脱液，浓缩，使用十八烷基键合硅胶色谱柱，以含有〇. 1 %三氟乙酸的 乙腈-水为流动相进行洗脱，收集含有目标多肽的洗脱液。
[0021] 上述各纯化步骤中，可以根据所述抗氧化多肽的性质，通过紫外吸收法、反相高效 液相色谱法、标准品对照法等方法检测洗脱液中的目标多肽。
[0022] 本发明所述方法得到的多肽，可通过LC-MS/MS进行氨基酸序列的测定和验证。
[0023] 本发明进一步保护所述抗氧化多肽的应用。
[0024] 本发明提供的多肽具有较好清除自由基作用，是天然的抗氧化剂，其应用主要在 于作为抗氧化原料添加于功能食品中。
[0025] 与现有技术相比，本发明提供的多肽及其制备方法具有以下优点：1)本发明所得 的多肽具有优异的抗氧化功能，可以作为抗氧化原料添加于功能食品中；2)本发明基于食 品源，利用食品级胃蛋白酶，经过特定的酶解和分离技术获得特定分子量的鱼肉蛋白多肽， 能广泛应用于抗氧化功能食品，安全可靠；3)本发明开发的抗氧化多肽制备方法原料易 得，方法简单，成本低廉，所得多肽的纯度和活性均不低于固相合成法得到的多肽，适于产 业化生产，有效地解决目前抗氧化多肽难以实现产业化生产的问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为实施例1所得多肽的质谱图。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0028] 实施例1 :抗氧化多肽的制备
[0029] 1、多肽的制备：
[0030] 1)取鲢鱼鱼肉100克，加入200克水，在85°C水浴中静置20min，采用分散均质机 在12000rpm条件下匀浆2min，得到鱼肉匀浆液300克；
[0031] 2)调节步骤1)所得鱼肉匀浆液中加入胃蛋白酶1克，在pH2. 5、温度37°C条件下 进行酶解，反应2小时后，在95°C下保温3min，冷却至室温，在5000g条件下离心5min，收集 上清液；
[0032] 3)取步骤2)所得上清液，利用孔径为3000道尔顿陶瓷膜进行超滤，得到含有分子 量小于3000道尔顿的多肽的溶液；
[0033] 4)取步骤3)所得多肽溶液，浓缩，使用S印hadex G-25凝胶色谱柱（色谱柱长 100cm，直径2. 6cm)，以去离子水为流动相进行洗脱，洗脱液流速为0. 8mL/min，在280nm下 检测各洗脱组分的吸收值，参考目标多肽的吸收值，收集含有目标多肽的洗脱液；
[0034] 5)取步骤4)所得洗脱液，浓缩，使用十八烷基键合硅胶色谱柱，以含有0. 1 %三氟 乙酸的乙腈-水为流动相进行洗脱，流动相流速为lmL/min，参考相同洗脱条件下目标多肽 的出峰保留时间，收集含有目标多肽的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得抗氧化多肽〇.24g，纯 度为 91. 25%。
[0035] 2、多肽的检测：
[0036] 将所得多肽通过LC-MS/MS法进行检测，检测结果如图1所示，可知其氨基酸序列 为 Tyr-Thr-Ile-Gln-Tyr(YTIQY)，分子量为 686Da。
[0037] 实施例2 :抗氧化多肽的制备
[0038] 1)取鲢鱼鱼肉300克，加入900克水，在80°C水浴中静置20min，采用分散均质机 在13000rpm条件下匀浆lmin，得到鱼肉匀浆液350克；
[0039] 2)调节步骤1)所得鱼肉匀浆液中加入胃蛋白酶2克，在pHl. 8、温度35°C条件下 进行酶解，反应1小时后，在95°C下保温5min，冷却至室温，在6000g条件下离心5min，收集 上清液；
[0040] 3)取步骤2)所得上清液，利用孔径为2500道尔顿陶瓷膜进行超滤，得到含有分子 量小于2500道尔顿的多肽的溶液；
[0041] 步骤4)和5)同实施例1 ;即得抗氧化多肽0. 69g，纯度为89. 08%。
[0042] 实施例3 :抗氧化多肽的制备
[0043] 1)取鲢鱼鱼肉200克，加入200克水，在90°C水浴中静置15min，采用分散均质机 在IOOOOrpm条件下匀浆3min，得到鱼肉匀浆液240克；
[0044] 2)调节步骤1)所得鱼肉匀浆液中加入胃蛋白酶1.5克，在pH2. 5、温度40°C条 件下进行酶解，反应1. 5小时后，在KKTC下保温3min，冷却至室温，在4000g条件下离心 IOmin,收集上清液；
[0045] 3)取步骤2)所得上清液，利用孔径为2800道尔顿陶瓷膜进行超滤，得到含有分子 量小于2800道尔顿的多肽的溶液；浓缩，冷冻干燥，得混合多肽4. 2g。
[0046] 经反相高效液相色谱法检测，所得混合多肽中目标抗氧化多肽的含量为10. 6%。
[0047] 对比例1 :
[0048] 委托GenScript公司，采用常规多肽固相合成方法，得到的本发明提供的序列为 Tyr-Thr-Ile-Gln-Tyr 的多肽，纯度为 90. 15%。
[0049] 对比例2 :
[0050] 委托GenScript公司，采用常规多肽固相合成方法，合成专利文献 CN103275180A公开的抗氧化肽，纯度为89. 69 % ;所述抗氧化肽的氨基酸序列为 Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr(LSHGPY)，分子量为 672Da。
[0051] 实验例
[0052] 1、样品来源：实施例1?3和对比例1、2提供的多肽。
[0053] 2、抗氧化活性检测：
[0054] 1)清除DPPH自由基能力经测定：取浓度为20 ii g/mL的多肽溶液I. 5mL，加入 I. 5mL 99. 5%的乙醇和0. 675mL的0. 02% DPPH乙醇溶液混合，振荡混匀，室温下避光水浴 30min，然后在517nm下检测体系吸光值；空白为去离子水。
[0055] DPPH自由基清除能力％=[(空白吸光值-样品吸光值）/空白吸光值]X 100。
[0056] 2)还原力的测定：取浓度为20 ii g/mL的多肽溶液lmL，加入2. 5mL 0? 2M磷酸缓冲 液（pH6. 6)和2. 5mL 1% (质量分数）的铁氰化钾溶液，混匀后放入50°C水浴加热20min ; 取出迅速冷却，加入2. 5mL 10% (质量分数）三氯乙酸（TCA)溶液，混合均匀后用3000g离 心IOmin ;取上清液2. 5mL，加入2. 5mL去离子水和0? 5mL 1 % (质量分数）三氯化铁溶液， 充分混匀，在室温下反应IOmin后，用700nm波长测定吸光度；还原力可用700nm波长处吸 光值表不。
[0057] 3)氧化自由基吸收能力（ORAC)的测定方法：不同浓度的抗氧化多肽溶液20 ii L 与75mM磷酸盐缓冲液80 ii L(pH 7. 4)及50 ii L 200nM的荧光试剂充分混合后在37°C温育 15min，然后再加入50 ii L 80mM的AAPH溶液。用酶标仪每分钟读取荧光值共进行lOOmin。 荧光的激发波长和发射波长分别是485nm和538nm。用磷酸缓冲溶液代替样品作为空白。 以Trolox作为标准对照，使用的浓度为0, 2,4,8,12,16 ii M，绘制荧光淬灭曲线。ORAC值用 样品曲线的斜率与Trolox曲线的斜率之比，ORAC值得单位表示为ii M Trolox/mg肽。
[0058] 该方法详见下述论文：Huang, W. ;Majumder, K. ;Wu, J. Oxygen radical absorbance capacity of peptides from egg white protein ovotransferrin and their interaction with phytochemicals. Food Chem. 2010, 123,635-641。
[0059] 3、测定结果，参见表1。
[0060] 表I :抗氧化肽的抗氧化活性实验结果
[0061]
【权利要求】
1?一种抗氧化多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为Tyr-Thr-Ile-Gln-Tyr。
2. 权利要求1所述抗氧化多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 以鲢鱼鱼肉为原料，加水混合，于80?90°C水浴中静置15?20min，匀浆，得到鱼肉 匀浆液； 2) 在步骤1)所得鱼肉匀浆液中加入胃蛋白酶进行酶解，充分反应后，在95?100°C下 保温3?5min，冷却至室温，离心，收集上清液； 3) 取步骤2)所得上清液，用孔径为2500-3000道尔顿陶瓷膜进行超滤，得到含有所述 抗氧化多肽的多肽溶液。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述匀浆具体为：在10000? 13000rpm条件下勻楽1?3min。
4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述酶解具体为：在pH 1. 8?2. 5、35?40°C的条件下反应0? 25?2. Oh。
5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述离心具体为：在4000? 6000g条件下离心5?lOmin。
6. 根据权利要求2?5任意一项所述的制备方法，其特征在于，还包括对步骤3)所得 多肽溶液进行纯化，纯化产物经浓缩、冷冻干燥后，即得抗氧化多肽。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括以下步骤：使用 Sephadex G-25凝胶色谱柱，以去离子水为流动相进行洗脱，收集含有所述抗氧化多肽的洗 脱液。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述纯化还包括以下步骤：使用十八 烷基键合硅胶色谱柱，以含有〇. 1 %三氟乙酸的乙腈-水为流动相进行洗脱，收集含有所述 抗氧化多肽的洗脱液。
9. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 取鲢鱼鱼肉，加入1?3倍于鱼肉重量的水，于80?90°C水浴中静置15?20min， 在10000?13000rpm条件下匀浆1?3min，得到鱼肉匀浆液； 2) 在步骤1)所得鱼肉匀浆液中加入胃蛋白酶，所述胃蛋白酶与步骤1)所述鲢鱼鱼肉 的质量比为1 :1〇〇?300,在pH 1. 8?2. 5、35?40°C的条件下进行酶解，反应0. 25?2. Oh 后，在95?100°C下保温3?5min，冷却至室温，在4000?6000g条件下离心5?lOmin， 收集上清液； 3) 取步骤2)所得上清液，利用孔径为2500-3000道尔顿陶瓷膜进行超滤，得到多肽溶 液； 4) 取步骤3)所得多肽溶液，浓缩，使用Sephadex G-25凝胶色谱柱，以去离子水为流动 相进行洗脱，收集含有所述抗氧化多肽的洗脱液； 5) 取步骤4)所得洗脱液，浓缩，使用十八烷基键合硅胶色谱柱，以含有0. 1 %三氟乙酸 的乙腈-水为流动相进行洗脱，收集含有所述抗氧化多肽的洗脱液；浓缩，冷冻干燥，即得 抗氧化多肽。
10. 权利要求1所述抗氧化多肽或由权利要求2?9任意一项所述制备方法得到的抗 氧化多肽的应用。
【文档编号】C12P21/06GK104356203SQ201410645383
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月12日 优先权日:2014年11月12日
【发明者】罗永康, 尤娟 申请人:中国农业大学