大麻dna荧光复合扩增系统的制作方法
【专利摘要】本发明公开了大麻遗传标记多态性检测体系。本发明提供了一种用于鉴定大麻的引物组，由引物对1-15共15个引物对组成。本发明的实验证明，本发明有如下优点：1、同时扩增大麻15个STR基因座，比单个基因座的扩增更加高效、快捷，为大麻STR基因座的进一步研究、大麻STR数据库的建立、案件中大麻的检验鉴定提供了有效的方法；2、优化后的大麻15个基因座荧光复合扩增体系中各基因座间能实现平衡扩增、具有高灵敏度和稳定性，利于检验涉毒案件中经常遇到的腐败检材；3、准确率高,采自不同产地的大麻样本，经检测和数据统计分析，能够得到各自在15个基因座上的分型。
【专利说明】大麻DNA荧光复合扩増系统
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及大麻DNA荧光复合扩增系统。
【背景技术】
[0002] 大麻为被子植物门荨麻目大麻科大麻属一年生雌雄异株草本植物。大麻属植 物主要有栽培大麻（Cannabis sativa L)、印度大麻（Cannabis sativa L)和野生大麻 (Cannabis ruderalis Janisch) 3个品种，在长期的生物自然进化和人工培育过程中又产 生了许多大麻变种和亚种。大麻具有悠久的栽培历史，是许多国家重要的经济作物，被用作 纺织纤维、动物饲料、油料、药物和麻醉品。大麻具有至幻作用，能作用于神经系统，具有强 烈的成瘾性和麻醉性，使人的神经由兴奋转为抑制，所以联合国公约将其列为与海洛因、可 卡因并列的三大毒品之一。大麻至幻作用的有效成分包括大麻二酚（CBD)、大麻酚（CNB) 和四氢大麻酚（THC)，其中起重要作用的是THC。通常根据THC和CBD的含量将大麻分为毒 品型大麻（THOO. 5%，CBD〈0. 5%，即 THC/CBD>1)、中间型大麻（THOO. 5%，CBD>0. 5% ) 和纤维型大麻（THC〈0. 5%，CBD>0. 5%，即THC/CBD〈1)。虽然包括我国在内的许多国家均 明文规定对大麻的种植等活动进行限制、管制、监察和检察等措施。然而在高额利润的驱使 下，全球范围的毒品大麻种植和非法交易活动屡禁不止。与此同时，在大麻犯罪案件中缴获 成批未加工的大麻植物（如整株植物、种子等）的情况也屡见不鲜。在法庭科学中，虽然可 用传统的植物形态学方法和理化方法如常规化学法、毛细管电泳法、薄层色谱法等对大麻 进行鉴定，但这些方法有很大的局限性，对检材的要求较高且不能进行有效的产地推断，所 以为了实现法庭科学推断大麻来源的需要，尝试寻求新的更好的方法来解决这一问题。
[0003] 近年来随着分子生物学的快速发展，用DNA检验技术对大麻进行分子水平的鉴定 成为法庭科学研宄的热点和新技术方法。
[0004] RAPD即随机扩增多态性DNA标记，是建立在PCR基础之上的一种可对整个未知序 列基因组进行多态性分析的分子技术。它采用人工合成的含有9-10个碱基的随机序列组 成的寡核酸做引物，通过PCR扩增获得长度不同的多态性DNA片断。RAH)形成的遗传基础 是：在DNA等位区域内，因引物靶序列发生点突变，使扩增子（两个反向聚合的引物靶序列 之间的DNA区域）丢失，产生显性的RAPD，或因扩增子内发生序列的插人、缺失突变，产生共 显性的RAPD。个体的模板不同，其扩增产物就不同。在关于大麻的研宄中，1995年Gillan 和Cole等运用RAH)和HPLC两种方法对17株大麻标本进行检测，利用RAPD技术成功地对 HPLC无法区分的大麻样本进行了鉴定。1996年，Jagadish等用RAPD技术成功区分了大麻 和蛇麻草。Sakamoto等（1995年）、Mandolino等（1999年）及陈其军等（2001年）分别 将用RAH)技术获得的RAH)分子标记转化为SCAR标记。研宄证明RAH)可以对大麻进行有 效的种属鉴定。但是由于RAH)方法对模板DNA要求较高，且随机引物的片段较短，扩增产 物的稳定性和重复性欠佳，检测费用较高，费时费事，所以在法庭科学实际工作中很难作为 常规检测方法，其一般被用于大麻遗传多样性的研宄及特异性片段的筛查等工作中。
[0005] AFLP检测技术是RAH)和RFLP技术相结合的产物，该技术的原理是对基因组DNA 限制性酶切片段进行选择性扩增，它具有多态性强、不需预先知道目标基因组序列、DNA模 板浓度宽容度大、谱带清晰，实验稳定性好等优点。在关于大麻的研宄中，2006年，Shannon L等利用AFLP分子标记对三个工业纤维大麻品种和一个高毒药用品种间的遗传差异进行 检测，10对引物扩增检测出1206条普带，其中88%具有多态性，其中18条普带对工业发麻 和高毒大麻具有鉴别意义。郭佳等用银染AFLP技术用55对引物组合对12个大麻地域品 种进行初筛，选出了 5对多态性好的引物组合，每对AFLP引物组合扩增出47?76条普带。 AFLP技术存在操作繁琐，费时费力，不便进行数据统计和对比等不足，所以AFLP也一般被 用于标记的筛查等。
[0006] 单核苷酸序列多态性（SNP)是基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多 态性，是新近发展起来的一种分子遗传标记技术。其具有分布广泛、数量众多、易于批量检 测等优点。2010年，Rotherham D等尝试运用SNP芯片鉴别药用型大麻和非药用型大麻，取 得了一定的进展。SNP技术为二等位基因标记，具有巨大的优势和潜力。随着DNA芯片等技 术的发展，其被应用于大麻种属、品种检验具有良好的发展前途。但由于其检测仪器费用高 昂等原因，大麻SNP的发展还需要进行大量的基础研宄。
[0007] 短串联重复序列STR是由2-6bp的核心序列串联重复多次组成的寡核苷酸序列， 因重复次数不同而具有高度多态性。STR标记被广泛应用到法庭科学实践中进行个体识别 和亲子鉴定。也有部分法庭科学家尝试利用STR标记对植物DNA进行分析的报道。STR技 术的优势在于基因座位点丰富、多态性较高、结果稳定，检测可实现自动化，节省时间和人 力，所以目前用STR标记来鉴别大麻、区分大麻品种等法庭科学研宄取得了一定的成果。目 前用于法庭科学的研宄检验的STR标记主要有27个。2003年，Hsieh等人报道了第一个 大麻STR基因座。数据显示该基因座的重复单位为6bp，具有高度的多态性，检测的108个 样本中该基因座的重复次数从3?40次不等，杂合度接近87. 04%。结果显示此基因座可 将大麻与其近缘物种（例如烟草）进行区分，因此可用于对大麻的鉴定和研宄大麻种间的 遗传关系。同年Gimore等使用5个STR基因座标记检测了 93株大麻，共得到79种等位基 因，结果经统计学分析，得出大麻不同品种间具有遗传多样性的结论，证明STR技术用于鉴 别大麻植物的来源地具有一定可行性。而Alghanim和Almirall报道了一项关于大麻STR 基因座结构类型的研宄成果，他们利用12个不同的寡核苷酸探针对大麻STR基因座进行 筛查，数据结果显示，49%的克隆产物含有微卫星序列，其中GA/CT约占50%，GTT/CAA占 16%，AAG/TTC占15%，GAT/CTA占10%。同时他们还开发了 11个多态性STR标记（3个二 核苷酸序列和8个三核苷酸序列），并从中检测到了 52个等位基因，这11个STR基因座杂合 度的范围是0. 386?0. 710,在群体中检出相同基因型的机会为1. 8 X 10-7。研宄结果表明 这11个STR标记可以用于大麻的DNA分型及大麻品种间亲缘关系的评估。2008年Howard 等在SWGDAM的指导下建立了大麻STR复合扩增系统，他们选取了 10个三核苷酸重复单位 的 STR 基因座（ANUCS301, ANUCS302, ANUCS303, ANUCS304, ANUCS305, ANUCS501, B01-CANN1, B05-CANN1，B02-CANN2, C11-CANN1)，采用4个复合扩增体系对分别从大麻干燥根、茎、叶以 及新鲜叶片、冰冻叶片、干燥叶片组织提取的DNA进行检测研宄，结果表明干燥叶片组织是 进行大麻STR分析的最好DNA来源，进行扩增的最佳DNA模板量为10ng ;通过对大麻的近 缘植物如烟草等的分析说明该复合系统具有较好的特异性。2009年Howard等建立了第一 个澳大利亚大麻STR基因数据库，也是世界上第一个大麻STR基因数据库。这一数据库是 在2008年研宄成果的基础上，利用以上10个STR基因座对510个大麻植物样本（其中包 含57份纤维大麻样本）进行扩增分析并建立起来的。实验中共检测到了 106个等位基因和 314种不同的基因型，所有的纤维大麻样本呈现单一的基因型，55%的毒品大麻样本存在一 份或几份样本基因型相同的情况。数据分析结果表明这种相同基因型的情况是由无性繁殖 产生的。这提示了被检测的大麻可能来源于同一个母体，从而为案件的侦破提供了有价值 的线索。同年Maria等报道了一个包含6个STR基因座的复合扩增体系。通过这个复合扩 增体系成功鉴别出了来自于美国33个州的98份大麻样本（包括14份纤维大麻和84份毒 品大麻）。2011年Stephan等选取了 15个STR基因座进行复合扩增，对63份大麻样本进 行了检测，该复合体系建议的PCR初始模板量为32ng，其检测结果表明用STR进行地域来源 的确认具有一定的可行性。此外，就国内而言，大麻STR基因座的研宄才刚刚起步，2008年 马原等用3个STR基因座对62份来自四个不同品种的云南大麻进行了个体和群体的遗传 多态性调查。这一研宄为应用STR遗传信息推断中国毒品原植物的品种和产地提供理论基 础。总的说来，目前关于大麻的研宄主要倾向于毒品型大麻与非毒品型大麻的研宄，涉及到 大麻地域来源的研宄十分稀少。国外关于大麻的复合扩增体系的研宄仍处于初级阶段，在 国内则是空白。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，为了填补国内大麻STR复合扩增体系研宄的空白，为实现用大麻STR基 因座进行大麻地域来源推断、为以后建立中国大麻STR基因库等的研宄提供有力的技术支 持与保障，发明了这一简便、快速、高效的包括大麻性别位点在内的16个大麻基因荧光复 合扩增检测体系。
[0009] 本发明的一个目的是提供一种用于鉴定大麻的引物。
[0010] 本发明提供的引物，由引物对 P17、P4、P15、P25、P6、P24、ANUC305、ANUC308、P19、 P13、P14、P7、ANUC501、DM029、DM016 和 ANUC303 共 16 个引物对组成：
[0011] 所述引物对P17由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物组 成；
[0012] 所述引物对P4由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成；
[0013] 所述引物对P15由序列表中序列5所示的引物和序列表中序列6所示的引物组 成；
[0014] 所述引物对P25由序列表中序列7所示的引物和序列表中序列8所示的引物组 成；
[0015] 所述引物对P6由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物组 成；
[0016] 所述引物对P24由序列表中序列11所示的引物和序列表中序列12所示的引物组 成；
[0017] 所述引物对ANUC305由序列表中序列13所示的引物和序列表中序列14所示的引 物组成；
[0018] 所述引物对ANUC308由序列表中序列15所示的引物和序列表中序列16所示的引 物组成；
[0019] 所述引物对P19由序列表中序列17所示的引物和序列表中序列18所示的引物组 成；
[0020] 所述引物对P13由序列表中序列19所示的引物和序列表中序列20所示的引物组 成；
[0021] 所述引物对P14由序列表中序列21所示的引物和序列表中序列22所示的引物组 成；
[0022] 所述引物对P7由序列表中序列23所示的引物和序列表中序列24所示的引物组 成；
[0023] 所述引物对ANUC501由序列表中序列25所示的引物和序列表中序列26所示的引 物组成；
[0024] 所述引物对DM029由序列表中序列27所示的引物和序列表中序列28所示的引物 组成；
[0025] 所述引物对DM016由序列表中序列29所示的引物和序列表中序列30所示的引物 组成；
[0026] 所述引物对ANUC303由序列表中序列31所示的引物和序列表中序列32所示的引 物组成。
[0027] 所述引物对中的一条引物均用荧光标记。
[0028] 上述引物中，所述引物对P17、P4、P15、P25、P6中每对引物对中的一条引物均标记 FAM ；
[0029] 所述引物对P24、ANUC305、ANUC308、P19、P13中每对引物对中的一条引物均标记 HEX ；
[0030] 所述引物对P14、P7中每对引物对中的一条引物均标记TAMRA ;
[0031] 所述引物对ANUC501、DM029、DM016和ANUC303中每对引物对中的一条引物均标记 ROX〇
[0032] 本发明另一个目的是提供一种用于鉴定大麻的PCR试剂。
[0033] 本发明提供的PCR试剂，含有上述引物。
[0034] 上述的PCR试剂中，
[0035] 所述引物对？17、？4、？15、？25、？6、？24、六顯0305、六顯0308、？19中的各条引物在所 述PCR试剂中的终浓度均为0. 3 y M ;
[0036] 所述引物对P13、P7、ANUC303中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为 0. 5 yM ；
[0037] 所述引物对P14、ANUC501DM029中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为 0. 15 yM ；
[0038] 所述引物对DM016中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为0. 45 yM。
[0039] 含有上述引物或含有上述PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。
[0040] 上述引物、上述PCR试剂或上述的试剂盒在鉴定大麻中的应用也是本发明保护的 范围；
[0041] 或上述引物、上述PCR试剂在制备鉴定大麻产品中的应用也是本发明保护的范 围。
[0042] 上述引物、上述PCR试剂或上述的试剂盒在鉴定待测样本是否含有大麻中的应用 也是本发明保护的范围；
[0043] 或上述引物、上述PCR试剂在制备鉴定待测样本是否含有大麻产品中的应用也是 本发明保护的范围。
[0044] 本发明第三个目的是提供一种辅助检测待测样本是否为大麻或是否含有大麻的 方法。
[0045] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0046] 用权利要求1或2中的所述16对引物对共同对待测样本进行STR复合扩增，得到 扩增产物；检测所述扩增产物，
[0047] 若扩增产物满足如下1)-15)全部标准，则待测样本候选为大麻或者候选含有大 麻；若扩增产物不满足如下1)-15)全部标准，则待测样本候选不为大麻或者候选不含有大 麻；
[0048] 所述标准为：
[0049] 1)含有显FAM基团颜色且大小为91-118bp的等位基因片段；
[0050] 2)含有显FAM基团颜色且大小为134-188bp的等位基因片段；
[0051] 3)含有显FAM基团颜色且大小为202-230bp的等位基因片段；
[0052] 4)含有显FAM基团颜色且大小为246-273bp的等位基因片段；
[0053] 5)含有显FAM基团颜色且大小为298-368bp的等位基因片段；
[0054] 6)含有显HEX基团颜色且大小为99-114bp的等位基因片段；
[0055] 7)含有显HEX基团颜色且大小为139-169bp的等位基因片段；
[0056] 8)含有显HEX基团颜色且大小为177-203bp的等位基因片段；
[0057] 9)含有显HEX基团颜色且大小为229-247bp的等位基因片段；
[0058] 10)含有显HEX基团颜色且大小为270-306bp的等位基因片段；
[0059] 11)含有显TAMRA基团颜色且大小为152-178bp的等位基因片段；
[0060] 12)含有显TAMRA基团颜色且大小为204-283bp的等位基因片段；
[0061] 13)含有显ROX基团颜色且大小为71-112bp的等位基因片段；
[0062] 14)含有显ROX基团颜色且大小为126±0. 5bp的等位基因片段或含有显ROX基团 颜色且大小为238±0. 5bp的等位基因片段；
[0063] 15)含有显ROX基团颜色且大小为142-151. 5bp的等位基因片段。
[0064] 上述方法中，所述STR复合扩增反应退火温度为55. 5°C ;
[0065] 所述待测样本为样本的基因组DNA。
[0066] 本发明的检验系统适合于中国范围内种植的大麻。
[0067] 本发明的实验证明，本发明有如下优点：
[0068] 1、用16对引物同时扩增包括大麻性别位点在内的15个基因座，比单个基因座的 扩增更加高效、快捷，为大麻STR基因座的进一步研宄、大麻STR数据库的建立、案件中大麻 的检验鉴定提供了有效的方法；
[0069] 2、优化后16对引物扩增体系能实现平衡扩增、具有高灵敏度和稳定性，利于检验 涉毒案件中经常遇到的腐败检材。
[0070] 3、准确率高，采自不同产地的大麻样本，经检测和数据统计分析，能够得到各自 在15个基因座上的分型。
【专利附图】
【附图说明】
[0071]图1为上图为未对大麻STR15plex荧光复合体系进行优化前的扩增情况，下图为 进行一系优化后的扩增效果。
[0072]图2为大麻基因座15plex荧光扩增系统的灵敏度检测结果
[0073] 图3为大麻基因座15plex荧光扩增系统的组织同一性检测结果
[0074]图4为大麻基因座15plex荧光扩增系统的种属特异性检测结果
【具体实施方式】
[0075] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0076] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，部分如 表1所示：
[0077] 表1为实验材料的出售公司
[0078]
【权利要求】
1. 一种用于鉴定大麻的引物，由引物对P17、P4、P15、P25、P6、P24、ANUC305、ANUC308、 P19、P13、P14、P7、ANUC501、DM029、DM016 和 ANUC303 共 16 个引物对组成： 所述引物对P17由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成； 所述引物对P4由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成； 所述引物对P15由序列表中序列5所示的引物和序列表中序列6所示的引物组成； 所述引物对P25由序列表中序列7所示的引物和序列表中序列8所示的引物组成； 所述引物对P6由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物组成； 所述引物对P24由序列表中序列11所示的引物和序列表中序列12所示的引物组成； 所述引物对ANUC305由序列表中序列13所示的引物和序列表中序列14所示的引物组 成； 所述引物对ANUC308由序列表中序列15所示的引物和序列表中序列16所示的引物组 成； 所述引物对P19由序列表中序列17所示的引物和序列表中序列18所示的引物组成； 所述引物对P13由序列表中序列19所示的引物和序列表中序列20所示的引物组成； 所述引物对P14由序列表中序列21所示的引物和序列表中序列22所示的引物组成； 所述引物对P7由序列表中序列23所示的引物和序列表中序列24所示的引物组成； 所述引物对ANUC501由序列表中序列25所示的引物和序列表中序列26所示的引物组 成； 所述引物对DM029由序列表中序列27所示的引物和序列表中序列28所示的引物组 成； 所述引物对DM016由序列表中序列29所示的引物和序列表中序列30所示的引物组 成； 所述引物对ANUC303由序列表中序列31所示的引物和序列表中序列32所示的引物组 成。
2. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于： 所述引物对？17、？4、？15、？25、？6中每对引物对中的一条引物均标记？八1; 所述引物对？24、4顯0305、4顯0308、？19、？13中每对引物对中的一条引物均标记册父； 所述引物对P14、P7中每对引物对中的一条引物均标记TAMRA ; 所述引物对ANUC501、DM029、DM016和ANUC303中每对引物对中的一条引物均标记ROX。
3. -种用于鉴定大麻的PCR试剂，含有权利要求1或2中的所述引物。
4. 根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于： 所述引物对P17、P4、P15、P25、P6、P24、ANUC305、ANUC308、P19中的各条引物在所述 PCR试剂中的终浓度均为0. 3 y M ; 所述引物对P13、P7、ANUC303中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为0. 5 y M ; 所述引物对P14、ANUC501DM029中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为 0. 15 yM ； 所述引物对DM016中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为0. 45 y M。
5. 含有权利要求1或2所述引物或含有权利要求3或4所述PCR试剂的试剂盒。
6. 权利要求1或2所述引物、权利要求3或4所述PCR试剂或权利要求5所述的试剂 盒在鉴定大麻中的应用； 或权利要求1或2所述引物、权利要求3或4所述PCR试剂在制备鉴定大麻产品中的 应用。
7. 权利要求1或2所述引物、权利要求3或4所述PCR试剂或权利要求5所述的试剂 盒在鉴定待测样本是否含有大麻中的应用； 或权利要求1或2所述引物、权利要求3或4所述PCR试剂在制备鉴定待测样本是否 含有大麻产品中的应用。
8. -种辅助检测待测样本是否为大麻或是否含有大麻的方法，包括如下步骤： 用权利要求1或2中的所述16对引物对共同对待测样本进行STR复合扩增，得到扩增 产物；检测所述扩增产物， 若扩增产物满足如下1)-15)全部标准，则待测样本候选为大麻或者候选含有大麻；若 扩增产物不满足如下1)-15)全部标准，则待测样本候选不为大麻或者候选不含有大麻； 所述标准为： 1) 含有显FAM基团颜色且大小为91-118bp的等位基因片段； 2) 含有显FAM基团颜色且大小为134-188bp的等位基因片段； 3) 含有显FAM基团颜色且大小为202-230bp的等位基因片段； 4) 含有显FAM基团颜色且大小为246-273bp的等位基因片段； 5) 含有显FAM基团颜色且大小为298-368bp的等位基因片段； 6) 含有显HEX基团颜色且大小为99-114bp的等位基因片段； 7) 含有显HEX基团颜色且大小为139-169bp的等位基因片段； 8) 含有显HEX基团颜色且大小为177-203bp的等位基因片段； 9) 含有显HEX基团颜色且大小为229-247bp的等位基因片段； 10) 含有显ffiX基团颜色且大小为270-306bp的等位基因片段； 11) 含有显TAMRA基团颜色且大小为152-178bp的等位基因片段； 12) 含有显TAMRA基团颜色且大小为204-283bp的等位基因片段； 13) 含有显ROX基团颜色且大小为71-112bp的等位基因片段； 14) 含有显ROX基团颜色且大小为126±0. 5bp的等位基因片段或含有显ROX基团颜色 且大小为238±0. 5bp的等位基因片段； 15) 含有显ROX基团颜色且大小为142-151. 5bp的等位基因片段。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于： 所述STR复合扩增反应退火温度为55. 5°C ; 所述待测样本为样本的基因组DNA。
【文档编号】C12N15/11GK104450888SQ201410645266
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月10日 优先权日:2014年11月10日
【发明者】裴黎, 宋炳轲, 张颖, 倪萍娅, 白雪, 叶健, 徐小玉, 马原, 冯涛, 张贵芹, 彭建雄, 凃政, 刘开会, 季安全 申请人:公安部物证鉴定中心