产生清洁味道的酶制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及产生清洁味道的酶制剂。本发明描述了一种细胞内生产的乳糖酶，其包含相对于每NLU的乳糖酶活性而言少于40个单位的芳基硫酸酯酶活性。本发明还提供了包括用酶制剂处理底物的工艺，其中所述酶制剂基本不含芳基硫酸酯酶。
【专利说明】产生清洁味道的酶制剂
[0001] 本发明是申请日为2006年11月28日、申请号为200680044411. 4、题为"产生清 洁味道的酶制剂"的申请的分案申请。
【技术领域】
[0002] 本发明涉及用酶制剂处理底物的方法、新颖的酶制剂和用于制备酶制剂的过程。 本发明还涉及乳糖酶。 技术背景
[0003] 酶改善食品级别产物的化学性质、物理化学性质或感官觉（organoleptic)性质 的用途是广泛的。在对牛奶和其它动物衍生的底物的加工中，酶的使用使最终产物增加了 显著的价值。例子是用乳酸酶孵育使得奶能被乳糖不耐受个体接受，对酪蛋白和乳清蛋白 的蛋白水解来减轻变应原性，并促进泡沫特性，使用磷脂酶A2修饰卵磷脂来改善烘焙性能 并稳定蛋黄酱，对肉和鱼制品使用转谷氨酰胺酶来改善硬度和弹性，以及通过添加葡萄糖 氧化酶从蛋制品或搓碎的乳酪中去除氧。另外，酶处理被用于增强多种动物衍生食品的香 味。例如，蛋白酶被用于加速鱼和肉提取物中的香味发生。另外，在乳酪中加速香味发生是 公知的目标。尽管EMC(经酶改良的乳酪）是其中最初使用多种脂酶的成熟制品，但是通过 添加少量的胞外蛋白酶（exoprotease)、脂酶或酯酶来加速乳酪老化中涉及的细微的味道 改变是更近期的发展。
[0004] 本发明还涉及乳糖酶。乳糖酶或0 -半乳糖苷酶（E. C :3. 2. 1. 23)是催化乳糖（一 种二糖）水解为其组分--单糖葡萄糖和半乳糖的酶。乳糖存在于乳制品中，更特别地存 在于奶、脱脂奶、奶油和其它乳制品中。天然存在的乳糖酶对乳糖的降解发生在人体（和其 它哺乳动物）肠壁中。
[0005] 乳糖在缺乏乳糖酶的大部分种群中引起的营养和功能问题是公知的，并且被描述 过。这类种群的成员不能够水解乳糖，乳糖在这类情况下进入大肠，在那里导致脱水、弱的 钙吸收、腹泻、肠胃气胀、嗳气和痛性痉挛（cramp)，甚至在严重的情况下导致水样爆炸性腹 泻（watery explosive diarrhoea)〇
[0006] 乳糖酶的一种重要的工业应用是生产供乳糖不耐受个体用的、乳糖经水解的乳制 品。这类经水解的乳制品包括巴氏灭菌奶、UHT-奶和从其所有或部分的最初组分经过或不 经过中间加工步骤（如蛋白质水解）重建的奶。用乳糖酶的处理可以在对奶进行热处理之 前或之后进行。可以通过向奶中添加所述酶进行乳糖酶处理。乳糖的可溶性特性使其可导 致结晶，导致砂质（sandy)或砂样（gritty)结构。这类不期望的结构可存在于一些乳制品 (如炼乳、淡奶、奶粉、冰冻奶、冰激凌）中和具有高乳含量的糖果制品中。乳糖酶对乳糖的 完全或部分水解解决了该问题，提供了具有均一质地的制品，且使得消费者更能接受。
[0007] 乳糖酶的另一工业应用是提高含乳糖制品如奶或酸奶中的甜味。这类制品中，乳 糖的水解产生了葡萄糖，从而导致甜味提高。乳糖酶的另一工业应用是水解含有乳成分的 乳糖制品如面包。将乳糖添加进这类制品中以增加香味、保持水分、提供褐色和改善烘烤特 性。在例如增强外皮颜色发生、改善香味和风味、改变结构、延长保质期（shelf life)和增 强面包结构的方面，经水解的乳糖糖浆是有希望的。
[0008] 发酵的乳制品（如酸奶）中，通过乳糖酶进行的乳糖水解将增加甜味。然而，当在 开始发酵加工前添加乳糖酶时，其可能提高酸发生的速率，从而减少加工时间。对奶或奶衍 生制品（如乳清）的乳糖酶处理使得这类制品适用于在针对乳糖不耐受动物（如猫）的动 物饲料和宠物饲料中应用。乳糖水解允许制造更高浓度的乳清，同时预防与前文针对乳糖 缺陷患者所述相似的肠道问题。经乳糖酶水解的乳清被浓缩，产生含70-75%固体的糖浆， 其被用作为冰激凌、烘焙制品和糖果制品中的食物成分。
[0009] 乳糖酶已经被描述过，其分离自大量生物，包括微生物。乳糖酶通常是微生物 如 Kluyveromyces 和 Bacillus 的细胞内成分。Kluyveromyces 和特别是 K. fragilis 和 K. lactis，和其它酵母如Candida、Torula和Torulopsis属的酵母是酵母酶乳糖酶的常见 来源，而B. coagulans或B circulans是细菌乳糖酶的公知来源。可以获得来自这些生物 的若干种商业乳糖酶制剂，如Maxilact?(来自K. lactis，由DSM，Deflt，荷兰生产）。所 有这些乳糖酶是所谓的中性乳糖酶，因为它们具有pH = 6和pH = 8之间的pH最适度。若 干种生物如Aspergillus niger和Aspergilus oryzae能够生产细胞外乳糖酶，US专利 5, 736, 374描述了这类乳糖酶的一个例子，其由Aspergilllus oryzae生产。乳糖酶的特性 如pH和温度最适度在物种之间变化。然而，通常，被分泌的乳糖酶显示pH = 3. 5到pH = 5. 0的较低pH最适度；而细胞内乳糖酶通常显示在pH = 6. 0到pH = 7. 5区域内的较高pH 最适度，但是这些一般规则有例外发生。对中性或酸性乳酸酶的选择取决于应用中的pH模 式。在中性pH的应用中，中性乳酸酶通常是优选的；这类应用包括奶、冰激凌、乳清、乳酪、 酸奶、奶粉等。酸性乳酸酶更适合于在酸性范围内应用。合适的乳酸酶浓度取决于最初的 乳糖浓度，所需的水解程度、pH、温度和水解时间。
[0010] 尽管酶处理的目的在于改善食品的功能性和/或味道模式，但是偶然地，酶处理 可能具有意外的和不希望的副作用。不希望的副作用的一个例子是酶处理导致的异味的发 生。
[0011] Mettall et. al,The Australian Journal of Dairy Technology, (1991),46-48 描述了用乳糖酶处理乳时发生异味的问题。根据该出版物，高水平的蛋白酶会导致异味的 快速产生。因此生产操作被最优化，以使得蛋白水解副活性最小化，从而降低异味形成的风 险。针对K lactis衍生的乳糖酶的纯化操作的一个例子被描述于W0 02/081673中。
[0012] 人们发现，甚至具有低蛋白酶活性的乳糖酶制剂仍然能够引起异味形成。在来自 酵母细胞质的中性乳糖酶的情况下尤其如此。与乳糖酶制剂使用相关的异味形成对于乳糖 水解的UHT奶来说是特别关键的。用于该情况的乳糖酶是中性乳糖酶，因为它们具有对奶 来说良好的pH最适度。UHT奶接受高热处理，以获得室温下若干月的保质期。冰箱外的长 时间储存使得这些制品特别容易形成异味：即使是非常慢的异味形成速率也能够在几个月 的储存后导致显著的异味形成，使得产物对消费没有吸引力。
【发明内容】
[0013] 目前，我们惊奇地发现，用酶制剂处理底物时，酶制剂中作为污染副活性存在的芳 基硫酸酯酶（即便是非常低的水平）能够在产物中导致异味的强烈发生，而使用没有芳基 硫酸酯酶活性或有降低的芳基硫酸酯酶活性的酶制剂则导致异味发生的强烈减少。
[0014] 因此，本发明提供了一种工艺，在一个方面，包括用酶制剂处理底物的工艺，其中 所述酶制剂基本不含芳基硫酸酯酶。
[0015] 本发明其它方面还提供了基本不含芳基硫酸酯酶的酶制剂。
[0016] 本发明在一个具体的方法还提供了相对于每NLU乳糖酶活性而言包含少于40个 单位的芳基硫酸酯酶活性的乳糖酶。
[0017] 根据本发明的乳糖酶制剂可有利地用于食品和饲料制品中，以水解乳糖，而不形 成异味化合物。
[0018] 我们惊奇地发现芳基硫酸酯酶是负责异味形成的决定性酶活性。我们通过对UHT 奶添加芳香族硫酸酯酶发现了确定的证据，所述添加导致该单种酶能够模拟通常在乳糖酶 处理的UHT奶中观察到的异味。
[0019] 虽然不希望受任何科学理论束缚，但是我们相信芳香族硫酸酯酶对代谢缀合物 (尤其是用硫酸酯基团取代的烷基苯酚）的水解是导致异味发生的机制。因此，根据本发明 的酶制剂特别有利于处理含有用硫酸酯基团取代的烷基苯酚的底物。
[0020] 发明详沭
[0021] 本发明的一个方面提供了相对于每NLU乳糖酶活性而言包含少于40单位芳基硫 酸酯酶活性的乳糖酶。优选地，该乳糖酶相对于每NLU乳糖酶活性而言包含少于30个单位 的芳基硫酸酯酶活性，更优选地相对于每NLU乳糖酶活性而言少于20单位的芳基硫酸酯酶 活性，最优选地相对于每NLU乳糖酶活性而言少于10单位的芳基硫酸酯酶活性。芳基硫酸 酯酶单位在实施例2中有定义，并针对以NLU表达的乳糖酶活性（也在实施例2中定义） 对其进行了标准化。
[0022] 乳糖酶可以是细胞内或细胞外生产的乳糖酶。在一种优选的实施方案中，乳糖酶 是细胞内生产的乳糖酶。
[0023] 在一种优选的实施方案中，乳糖酶是中性乳糖酶。中性乳糖酶具有pH= 6和pH =8之间的pH最适度。
[0024] 中性乳糖酶制剂通常来自微生物的细胞质。对它们的生产包括微生物的（大规 模）发酵，随后是乳糖酶的分离。后者要求破坏细胞壁从而将酶从细胞质中释放。若干种 技术已经被用于获得细胞裂解物，包括通过有机溶剂（如辛醇）、超声波处理或弗氏细胞压 碎器（French Pressing)使细胞壁可透过。除乳糖酶外的其它酶（包括蛋白酶）同时从细 胞质中被释放。
[0025] 在一种优选的实施方案中，乳糖酶具有相对于每NLU乳糖酶活性而言少于 0. 5RFU/分钟的蛋白酶活性。
[0026] 已经针对大量生物（包括微生物）描述了可以根据本发明的方法纯化的细胞内乳 糖酶，并从所述生物中分离出来。乳糖酶通常是微生物如Kluyveromyces和Bacillus的细 胞内成分。Kluyveromyces和特别是K. lactis、K marxinus和K. fragilis，和其它酵母如 Candida、Torula和Torulopsis属的酵母是酵母酶乳糖酶的常见来源，而B. coagulans或B circulars是细菌乳糖酶的公知来源。可以获得来自这些生物的若干种商业乳糖酶制剂，如 Maxilact?(来自K. lactis，由DSM生产）。所有这些乳糖酶是所谓的中性乳糖酶，因为它 们具有pH= 6和pH= 8之间的pH最适度。
[0027] 已经针对多个物种描述了细胞内乳糖酶，对它们中的若干种而言，它们的氨 基酸序列和/或DNA序列是已知的。序列信息可由公众在序列数据库中获得，例如在 GenBank (Bethesda, Maryland USA)、European Molecular Biology Laboratory's European Bioinformatics Institute(EMBL-Bank in Hinxton, UK)、 the DNA Data Bank of Japan(Mishima，日本）和the Swissprot (瑞士）中获得。可以根据基因和/或蛋白质 序列中的同源性在基因组中鉴定乳糖酶。细胞内酶的粗制剂的特征在于存在若干种仅存在 于细胞的细胞质中的酶，例如涉及细胞中心代谢的酶，包括涉及糖酵解的酶。
[0028] 细胞外乳糖酶也已经被描述过。它们通常因为含有称作前导序列的肽序列而被认 为是细胞外酶。所述前导序列以某些方式被生产酶的细胞识别为所述酶应当被输送至细胞 外的信号。在分泌期间，前导序列通常被去除。已经针对多种物种描述了细胞外乳糖酶，例 如Aspergillus oryzae。细胞外乳糖酶的粗制剂特征在于不存在细胞内酶并且存在典型的 细胞外酶，如蛋白酶。人们发现细胞外酶的种类随生物而不同，它们对于所述生物来说是典 型的。因为发酵或加工期间的细胞裂解，故而这类细胞外酶制剂中可存在低水平的细胞内 酶。
[0029] 因此，可以根据乳糖酶与其它已知乳糖酶的氨基酸序列比较为基础，将其分类为 细胞外或细胞内的。原则上，细胞内乳糖酶可以与前导序列一起提供。这可能导致乳糖酶 从细胞中分泌进入培养基。在存在典型的细胞外酶和不存在或以低水平存在典型的细胞内 酶时，这类酶的粗制剂的特征将在于基于其氨基酸序列被归类为细胞内的乳糖酶。
[0030] 本发明使用的优选的细胞内乳糖酶为：具有http ://www. ebi. uniprot. org/ entry/BGAL_KLULA所述的氨基酸序列的K. lactis乳糖酶，或具有与K. lactis的氨基酸序 列至少90%、优选至少95%相同的氨基酸序列的乳糖酶。具有http ://www. ebi. uniprot. org/entry/Q6QTF4_KLUMA所述氨基酸序列的K. marxianus乳糖酶，或具有与K. lactis的 氨基酸序列至少90%、优选至少95%相同的氨基酸序列的乳糖酶。具有http ://www. ebi.
【权利要求】
1. 乳糖酶，其包含相对每NLU乳糖酶活性而言少于40个单位芳基硫酸酯酶活性。
2. 根据权利要求1的乳糖酶,其包含相对每NLU乳糖酶活性单位而言少于30个单位的 芳基硫酸酯酶活性，更优选地相对每NLU乳糖酶活性而言少于20个单位的芳基硫酸酯酶活 性，最优选地相对每NLU乳糖酶活性而言少于10个单位的芳基硫酸酯酶活性。
3. 根据权利要求1或2的乳糖酶，其为细胞内生产的乳糖酶。
4. 根据前述权利要求任何一项的乳糖酶，其为中性乳糖酶，优选地为K. lactis乳糖 酶。
5. 根据前述权利要求任何一项的乳糖酶，其具有pH = 6和pH = 8之间的pH最适度。
6. 根据前述权利要求任何一项的乳糖酶，其具有每NLU乳糖酶活性少于0. 5RFU/分钟 的蛋白酶活性。
7. 包含权利要求1到6中任一项的乳糖酶的组合物。
8. 乳制品，其包含权利要求1到6中任一项的乳糖酶或权利要求7的组合物。
9. 生产乳制品的工艺，所述工艺包括向包含乳糖的乳制品中添加权利要求1到6中任 一项的乳糖酶或权利要求7的组合物。
10. 生产下述乳制品的工艺，所述乳制品没有芳基硫酸酯酶产生的异味，所述工艺包括 使用权利要求1到6中任一项的乳糖酶或权利要求7的组合物。
11. 纯化含乳糖酶的酶制剂的工艺，所述工艺包括使用色谱法从乳糖酶中分离芳基硫 酸酯酶。
12. -种工艺，其包括用酶制剂处理底物，其中所述酶制剂基本不含芳基硫酸酯酶。
13. 根据权利要求12的工艺，其中所述酶制剂是根据权利要求36到43中任一项的酶 制剂。
14. 根据权利要求10或13的工艺，其中所述工艺包括通过根据权利要求23到25中任 一项或权利要求34或35的工艺获得所述酶制剂。
15. 根据权利要求10到14中任一项的工艺，其中所述底物是蛋白质性质的底物。
16. 根据权利要求10到15中任一项的工艺，其中所述底物含有用硫酸酯基团取代的烷 基苯酚。
17. 根据权利要求10到16中任一项的工艺，其中所述底物含有乳蛋白，例如酪蛋白和 /或乳清蛋白。
18. 根据权利要求10到17中任一项的工艺，其中所述底物为奶、经发酵的乳制品，例如 酸奶、乳清、水解产物，和/或肉。
19. 根据权利要求10到18中任一项的工艺，其中所述处理期间所述底物中芳基硫酸酯 酶水平为每升底物至多500*10E3芳基硫酸酯酶单位，优选地每升底物至多250*10E3、优选 地至多100*10E3、优选地至多50*10E3、优选地至多25*10E3芳基硫酸酯酶单位。
20. 根据权利要求10到19中任一项的工艺，其中所述酶制剂包含乳糖酶、蛋白酶、脂酶 或酯酶。
21. 根据权利要求10到20中任一项的工艺，其为用于制备营养制品（例如乳制品）的 工艺。
22. 可以通过根据权利要求10到21中任一项的工艺获得的制品。
23. 用于制备酶制剂的工艺，所述工艺包括纯化粗酶制剂，所述粗酶制剂含有感兴趣的 酶和芳基硫酸酯酶，其中芳基硫酸酯酶与所述感兴趣的酶分离。
24. 根据权利要求23的工艺，其中所述纯化导致芳基硫酸酯酶活性降低至少50%、优 选地至少80 %、更优选地至少90 %、更优选地至少95 %、更优选地至少99 %。
25. 根据权利要求23或24的工艺，其中所述纯化通过色谱，优选地在单一色谱分离步 骤中进行。
26. 生产下述宿主细胞的工艺，所述宿主细胞是芳基硫酸酯酶缺陷菌株，所述工艺包括 将生产芳基硫酸酯酶的培养物置于下述条件下，所述条件下，所述培养物的部分被修饰，以 形成芳基硫酸酯酶缺陷的宿主细胞，并分离所述宿主细胞。
27. 根据权利要求26的工艺，其中使用诱变条件，优选地使用随机诱变条件，例如物理 或化学诱变。
28. 根据权利要求26的工艺，其中使用重组遗传操作技术，优选地使用一步基因打断、 标记物插入、定点诱变、缺失、RNA干扰、反义RNA。
29. 通过下述方法生产多肽的工艺，所述方法包括： (a) 在有益于多肽表达的条件下，在营养培养基中培养芳基硫酸酯酶缺陷型宿主细胞 (b) 在所述宿主细胞中表达所述多肽，和 (c) 可选地，从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收所述多肽。
30. 通过下述方法生产多肽的工艺，所述方法包括： (a) 用表达载体转化芳基硫酸酯酶缺陷型宿主细胞，其中所述载体表达所述多肽， (b) 在有益于所述多肽表达的条件下，在营养培养基中培养所述宿主细胞， (c) 在所述宿主细胞中表达所述多肽，和 (d) 可选地，从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收所述多肽。
31. 通过下述方法生产多肽的工艺，所述方法包括： (a) 在禁止芳基硫酸酯酶生产的营养培养基中和在有益于所述多肽表达的条件下，培 养宿主细胞 (b) 在所述宿主细胞中表达所述多肽，和 (c) 可选地，从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收多肽。
32. 通过下述方法生产多肽的工艺，所述方法包括： (a) 用表达载体转化宿主细胞，其中所述载体表达所述多肽， (b) 在禁止生产芳基硫酸酯酶的营养培养基中和在有益于所述多肽表达的条件下，培 养所述宿主细胞， (c) 在所述宿主细胞中表达所述多肽，和 (d) 可选地，从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收所述多肽。
33. 根据权利要求29到32中任一项的工艺，其中所述多肽是酶。
34. 用于制备酶制剂的工艺，所述工艺包括：通过根据权利要求33的工艺来制备酶，和 从所述营养培养基或从所述宿主细胞中回收酶制剂。
35. 根据权利要求23到25中任一项或权利要求33或34的工艺，其中所述酶是乳糖 酶、蛋白酶、脂酶或酯酶。
36. 能够通过根据权利要求23到35中任一项或权利要求35的工艺获得的酶制剂。
37. 根据权利要求12到36中任一项的酶制剂，其中所述酶制剂包括乳糖酶、蛋白酶、月旨 酶和/或酯酶。
38. 包含羧肽酶的酶制剂，其含有相对于每CPG而言少于10000个单位的芳基硫酸酯酶 活性。
39. 根据权利要求38的酶制剂，其含有相对于每CPG而言少于1000个单位、优选地少 于100个单位、优选地少于50、优选地少于10个单位的芳基硫酸酯酶活性。
40. 包含脯氨酸特异蛋白酶的酶制剂，其含有相对于每而言少于300*10E3个单位 的芳基硫酸酯酶活性。
41. 根据权利要求40的酶制剂，其含有相对于每PPU而言少于100*10E3个单位的芳基 硫酸酯酶。
42. 包含乳糖酶的酶制剂，所述酶制剂含有相对于每NLU的乳糖酶活性而言少于40个 单位的芳基硫酸酯酶活性。
43. 根据权利要求42的酶制剂，其含有每NLU乳糖酶活性少于30个单位的芳基硫酸 酯酶活性，更优选地每NLU乳糖酶活性少于20个单位的芳基硫酸酯酶活性，最优选地每NLU 乳糖酶活性少于10个单位的芳基硫酸酯酶活性。
44. 根据权利要求36到43中任一项的酶制剂用于制备乳制品的用途。
45. 根据权利要求36到43中任一项的酶制剂用于预防或减少异味发生的用途。
【文档编号】C12N9/48GK104450647SQ201410645968
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2006年11月28日 优先权日:2005年11月28日
【发明者】马克西米利安·彼得·马莉亚·斯瓦夫·德, 阿伯图斯·阿拉德·蒂克·范, 路泊·伊登斯, 彼得吕斯·雅各布斯·西奥多瑞斯·蒂克尔 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司