具有提高的胁迫耐受性和产量的转基因植物的制作方法
【专利摘要】公开了能够增强植物在限水条件下的生长、产量和/或提高环境胁迫耐受性的多核苷酸，其中所述植物经转化以含有此类多核苷酸。还提供了使用此类多核苷酸的方法以及含有此类多核苷酸作为转基因的转基因植物和农产品，包括种子。
【专利说明】具有提高的胁迫耐受性和产量的转基因植物 本申请是中国专利申请200880009520. 1的分案申请，原申请的申请日是2008年3月 20日，发明名称是"具有提高的胁迫耐受性和产量的转基因植物"。 发明领域
[0001] 本发明总体上涉及过量表达编码多肽的核酸序列的转基因植物，其中所述的多肽 能够赋予正常的或非生物胁迫条件下提高的胁迫耐受性并且因而赋予增加的植物生长和 作物产量。此外，本发明涉及编码多肽的新的经分离核酸序列，其中所述的多肽赋予植物在 非生物胁迫条件下提高的耐受性，和/或在正常的或非生物胁迫条件下增加的植物生长和 /或产量。 发明背景
[0002] 非生物的环境胁迫如干旱、盐度、热和寒冷是植物生长和作物产量的主要限制性 因素。作物产量在本文中定义为每英亩收获的相关农产品（如谷粒、饲草或种子）的蒲式 耳数。由这些胁迫引起的主要作物如大豆、稻、玉米、棉属植物、和小麦的作物损失和作物产 量损失代表了重要的经济和政治因素并且在众多不发达国家造成食物短缺。
[0003] 水分有效性（water availability)是诸多非生物胁迫和它们对植物生长影响的 一个重要方面。连续暴露于干旱条件造成植物代谢方面的重大改变，所述重大改变最终导 致细胞死亡并且因此导致产量损失。因为在一些土壤中的高盐含量导致有效用于细胞摄取 的水更少，所以高盐浓度对植物的影响与干旱对植物的影响相似。此外，在冰冻温度的情形 下，植物细胞因植物内部形成冰而失水。因此，因干旱、热、盐度和寒冷胁迫所致的作物损伤 主要归咎于脱水。
[0004] 因为植物在其生活周期期间一般暴露于水分有效性降低的条件。大多数植物已经 演化了针对由这些非生物胁迫所致干燥的保护机制。然而，若干燥环境过于严重且持续时 间太长，则对大多数作物植物的发育、生长、植物大小和产量的影响是深远的。开发在水使 用方面高效的植物因而是一项可能在世界范围内明显改善人类生活的策略。
[0005] 常规植物育种策略进展相对缓慢并且需要对非生物胁迫耐受的建立者品系 (founder line)与其他种质杂交以开发新的非生物胁迫抗性品系。相对于此类建立者品系 有限的种质资源以及远缘相关植物种之间杂交的不相容性代表了常规育种中遭遇的重大 问题。针对耐受性的育种基本上不成功。
[0006] 许多农业生物技术公司在致力于开发转基因的耐受非生物胁迫的作物植物中，尝 试了鉴定能赋予对非生物胁迫应答耐受的基因。虽然已经表征了参与植物中胁迫应答或用 水效率的一些基因，然而，对赋予胁迫耐受性和/或用水效率的植物基因的表征和克隆仍 大多是不完整的和零散的。迄今，在开发转基因的耐受非生物胁迫的作物植物方面取得的 成功是有限的，并且此类植物没有被商业化。
[0007] 为了开发转基因的耐受非生物胁迫的作物植物，需要在作物植物的模型植物系 统、温室研究和田间试验中测试众多参数。例如，用水效率（WUE)是经常与干旱耐受相关的 一个参数。对植物应答脱水、渗透压休克和极端温度的研究也用来确定该植物针对非生物 胁迫的耐受性或抗性。当测试转基因的存在对植物胁迫耐受性的影响时，与田间相比较，温 室或植物生长室环境的固有优势是能够将土壤属性、温度、水和养分有效性和光强度标准 化。
[0008] 已经以多种方式定义和测量WUE。一种方法是计算完整植物干重与该植物在整个 生命期间所消耗水的重量的比率。另一种变例是在测量生物量积累和水使用时使用较短的 时间间隔。又一种方法是使用来自植物限定部分的测量结果，例如仅测量地上部分和水使 用。WUE又定义为C0 2摄取与来自叶或叶部分的水蒸气损失之比，这常常在极短的时间段 (例如秒/分钟）内测量。固定在植物组织中并用同位素比质谱仪测量的 13c/12c比率也已 经用来在采用(：3光合作用的植物中估计WUE。
[0009] WUE的提高表明生长和水消耗的效率相对改善，但是单独考虑这个信息不能指出 这两个过程之一是否已经改变或两者皆改变。在选择性状旨在改良作物的过程中，在生长 无变化的情况下，因水使用降低引起的WUE增加将在水输入成本高昂的灌溉农业系统中具 有特殊优势。在水使用没有相应骤增的情况下，主要受生长增加推动的WUE提高将适用于 全部农业系统。在不限制水供应的许多农业系统中，生长增加也能提高产量，即便这种生长 增加以水使用提高（即WUE无变化）为代价。因此，需要WUE和生物量积累这两者均增加 的新方法以改善农业生产率。
[0010] 伴随与非生物胁迫耐受性相关的参数测量结果是说明转基因潜在影响作物产量 的参数测量结果。对于饲草作物如苜蓿、青贮作物和干草而言，植物生物量与总产量相关。 然而对于谷类作物，已经使用其他参数来估计产量，如由总植物干重、地上部分干重、地上 部分鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座丛直径、叶长度、根长度、根质量、分蘖数和叶数 所测量的植物大小。发育早期的植物大小一般与发育晚期的植物大小相关。具有较大叶面 积的较大植物一般可以比较小植物吸收更多的光线和二氧化碳并且因而将可能在相同时 段期间赢得更大的重量。这还是植物拥有以初始获得较大大小的微环境或遗传优势的潜在 延续。存在针对植物大小和生长速率的强遗传组分，并且因而就一系列的多样遗传表型而 言，在一种环境条件下的植物大小可能与另一种环境条件下的大小相关。以这种方式，使用 标准环境来模拟田间作物在不同地方和时间上所遭遇的多样的动态环境。
[0011] 收获指数，即种子产量对地上部分干重的比率，在许多环境条件下是相对稳定的 并且因而植物大小与谷物产量之间可能存在强相关。植物大小和谷物产量是内在关联的， 因为大部分的谷物生物量取决于植物叶和茎的现有或储备的光合生产率。因此，已经利用 植物大小选择法，甚至在发育早期利用植物大小选择法，来筛选在暴露于田间试验时可以 表现产量增加的植物。如同非生物胁迫耐受性，在生长室或温室中的标准化条件下测量在 早期发育中的植物大小是测量因存在转基因所赋予的潜在产量优势的标准实践。
[0012] 因此，需要鉴定在胁迫耐受性植物和/或高效使用水的植物中表达的额外基因， 其中所述的额外基因能够赋予宿主植物和其它植物物种胁迫耐受性和/或提高的用水效 率。新产生的胁迫耐受性植物和/或具有提高的用水效率的植物将具备许多优势，如可以 栽培的作物植物的范围增加，例如通过降低植物物种的水需要做到这一点。其它想要的优 势包括提高嫩枝或茎抵抗对风、雨、害虫或疾病反应而致的倒伏、扭弯。 发明简述
[0013] 本发明人已经发现：用某些多核苷酸转化植物导致植物生长和/或对环境胁迫应 答的增强并且因此当所述多核苷酸在该植物中作为转基因存在时，增加此植物的农产品的 产量。能够介导此类增强作用的多核苷酸已经从展叶剑叶藓（Physcomitrella patens)、 欧洲油菜（Brassica napus)、玉蜀黍（Zea mays)、亚麻（Linum usitatissimum)、稻（Oryza satvia)、大豆（Glycine max)或普通小麦（Triticum aestivum)分离并且列于表1中，并 且其序列如表1中所示在序列表中描述。 表1 :
【权利要求】
1. 分离的多核苷酸，其具有选自以下核酸分子的序列： a. 包含SEQ ID NO. 19中所不多核苷酸序列的核酸分子； b. 编码多肽的核酸分子，其中所述多肽与由（a)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列 具有至少80%同一性；和 c. 与（a)至（b)的核酸分子在严格杂交条件下杂交的核酸分子。
2. 权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自以下多核苷酸： a. 编码细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基（CDK)蛋白的多核苷酸，所述CDK蛋白包含 SEQ ID NO:20的第1至72位氨基酸； b. 编码⑶K蛋白的多核苷酸，所述⑶K蛋白包含SEQ ID NO: 20的第1至91位氨基酸； 和 c. 多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 19的第1至884位核苷酸。
3. 具有选自以下序列的分离的多肽： a. SEQ ID NO. 20中所示的多肽序列；和 b. 与（a)的多肽序列具有至少80%同一性的多肽。
4. 权利要求3的分离的多肽，其中所述多肽由权利要求1或2的多核苷酸编码。
5. 表达盒，其包含权利要求1或2的多核苷酸。
6. 分离的重组表达载体，其包含权利要求1或2的多核苷酸。
7. 细菌宿主细胞，其用权利要求1或2的多核苷酸、权利要求5的表达盒或权利要求6 的表达载体转化。
8. 非繁殖的用表达盒转化的转基因植物细胞，所述表达盒包含编码CDK蛋白的分离的 多核苷酸，其中与该植物的野生型品种相比较，所述多核苷酸的过量表达导致在正常的或 限水条件下植物的环境胁迫耐受性提高，或植物生长增加或相关农产品的产量增加。
9. 非繁殖的转基因植物细胞，其包含根据权利要求1或2的多核苷酸、根据权利要求3 或4的多肽、根据权利要求5的表达盒或根据权利要求6的表达载体或根据权利要求7的 细菌宿主细胞，其中所述非繁殖的转基因植物细胞来源自植物，与该植物的野生型品种相 比较时，根据权利要求1或2的多核苷酸、根据权利要求3或4的多肽、根据权利要求5的 表达盒或根据权利要求6的表达载体的表达导致植物在正常的或限水条件下的生长和/或 产量增加和/或环境胁迫耐受性提高。
10. 权利要求8或9的转基因植物细胞，其中所述植物是双子叶植物或单子叶植物。
11. 权利要求8或9的转基因植物细胞，其中所述植物是针叶植物或落叶植物。
12. 利要求8或9的转基因植物细胞，其中所述植物选自苜蓿、大豆、番茄、马铃薯、烟 草、油籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜和青花椰菜、拟南芥（Arabidopsis thaliana)、棉属植 物、落花生、小麦、大麦、高粱、谷子、黑麦、黑小麦、玉米、稻、燕麦、柳枝稷、芒属、甘鹿、苹果、 李、番木瓜和杨。
13. 产生转基因植物的方法，所述转基因植物包含根据权利要求1或2所述的至少一个 多核苷酸，其中与该植物的野生型品种相比较时，所述多核苷酸在该植物中的表达导致该 植物在正常的或限水条件下的生长和/或产量增加和/或环境胁迫耐受性提高，所述方法 包括步骤： a.将包含根据权利要求1或2所述的至少一个多核苷酸的表达载体导入植物细胞，和 b.从所述植物细胞产生表达所述多核苷酸的转基因植物，其中与该植物的野生型品种 相比较时，所述多核苷酸在转基因植物中的表达导致该植物在正常的或限水条件下的生长 和/或产量增加和/或环境胁迫耐受性提高。
14. 增加植物在正常的或限水条件下的生长和/或产量和/或提高植物的环境胁迫耐 受性的方法，所述方法包括在植物中提高根据权利要求1或2所述的至少一个多核苷酸表 达的步骤。
15. 根据权利要求1或2的多核苷酸、根据权利要求3或4的多肽、根据权利要求5的 表达盒或根据权利要求6的表达载体或根据权利要求7的细菌宿主细胞用于产生转基因 植物的用途，所述的转基因植物包含根据权利要求1或2的多核苷酸或根据权利要求3或 4的多肽，其中与该植物的野生型品种相比较时，所述的转基因植物在正常的或限水条件下 具有增加的生长和/或产量和/或具有提高的环境胁迫耐受性。
【文档编号】C12N15/82GK104450640SQ201410646021
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2008年3月20日 优先权日:2007年3月23日
【发明者】A·舍利, D·艾伦, B·麦克尔西 申请人:巴斯福植物科学有限公司