一种一次准确定量烷烃羟化酶基因alkB的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】一种一次准确定量烷烃羟化酶基因alkB的方法及其应用。环境检测过程中因烷烃羟化酶基因alkB编码的基因多样性较高，难以一次准确定量。本方法首先用通用序列接头的特异引物对目的基因进行预扩增，使目的基因的预扩增产物带有这段通用序列；然后用通用序列作引物实现预扩增产物的定量分析。本方法成功解决了普通多重实时荧光定量PCR技术中由引物扩增效率差异、非特异性扩增、引物二聚体等引起的定量结果准确性和可比性差的问题，可通过一步PCR反应准确地对PCR体系中多个目的基因的总量进行一次性定量。本方法操作简便快速，特异性高，检测结果准确可靠，检测灵敏度高，最低检测浓度为1×102拷贝/ml。
【专利说明】一种一次准确定量烷烃羟化酶基因aIkB的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生态技术和生物【技术领域】，具体地说，它涉及一种基于通用序列 的多重实时荧光定量PCR方法，及其在烷烃羟化酶基因alkB定量检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 油藏和石油污染环境中存在着大量的烃降解菌株，它们能以石油烃为碳源生长代 谢并产生生物表面活性物质，从而达到提高石油采收率或清除环境中的石油污染物。目前 已经发现约有100多个属的微生物能够直接或辅助降解一种或多种石油烃，这类微生物主 要有：Pseudomonas, Acinetobacter, Achromobacter, Nocardia, Bacillus, Micrococcus, A ctinomycet, Aureobasidium, Candida, Rhodotorula 及 PeniciIlium 等。现有石开究结果表 明：烷烃是一种高度还原性物质，微生物对石油烃类的降解主要通过好氧途径完成，其降解 的第一步是在烷烃分子中加入氧使其氧化为醇或酮，再进一步氧化为脂肪酸进入3 -氧 化途径进行氧化分解。在石油烃的生物降解过程中，这种氧化反应是由一类烷烃羟化酶催 化完成的。因此，准确定量环境中烷烃羟化酶基因（alkB)的数量对于分析原位烃氧化菌 (hydrocarbon oxidizing bacteria, H0B)的丰度和石油经的降解潜力具有重要意义。然 而，长期的自然进化过程使编码烷烃羟化酶的基因表现出了丰富的多样性，即：虽然alkB 基因的编码产物都是烷烃羟化酶，但它们的碱基序列甚至氨基酸序列却存在较大的差异， 这些酶属于同工酶家族。2013年6月8日之前，Genbank中公布的alkB基因序列已经超过 1100条，其同源性在43%?94%之间。这就给利用实时荧光定量PCR技术（qPCR技术）准 确定量alkB基因提出了巨大的挑战。主要原因在于：实时荧光定量PCR除了在PCR过程中 需要实时监测扩增产物的浓度之外，与普通PCR的原理是相同的。也就是说普通PCR的缺点 在实时荧光定量PCR中也难以避免。例如引物二聚体的形成和非特异性扩增的产生，这些 在以SYBR Green I等荧光染料为检测介质的实时荧光定量PCR中会对定量结果的准确性 产生严重的影响。因此，qPCR也必须遵循普通PCR所要遵循的规则，甚至要更严格地遵循。 在普通PCR过程中，引物的特异性是有效扩增目的基因，减少非特异性扩增的关键，这就使 多样性指数非常高的alkB基因的qPCR定量结果与实际偏差较大。为了克服这种困难，最 容易实现的策略是在PCR体系中加入多对特异性引物进行定量分析，即利用多重引物qPCR 技术对alkB基因进行定量。多重引物PCR技术是在普通PCR基础上，利用体系中含有的多 对特异引物，同时实现多个目的基因的扩增，广泛用于多种病原微生物的同时检测，以及某 些遗传病及癌基因的分型鉴定。然而，将多重引物直接用于qPCR分析还有许多困难，PCR体 系中的多对引物会使引物二聚体、非特异性扩增等干扰定量准确性的问题更为突出；此外， 不同引物间扩增效率的差异以及相互抑制也会影响到定量结果的准确性。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是解决普通多重实时荧光定量PCR技术中由引物扩增效率差异、非 特异性扩增、引物二聚体等因素引起的定量结果准确性和可比性差的问题，提供一种一次 准确定量烷烃羟化酶基因alkB的方法及其应用。
[0004] 本发明提供的一种一次准确定量烷烃羟化酶基因alkB的方法，是基于通用序列 的多重引物实时突光定量PCR(universalprimermutiplexqPCR，以下简称UPMQ)方法，该 方法首先用15对带有通用序列接头的特异引物对目的基因进行预扩增，使目的基因的预 扩增产物均带有这段通用序列；然后用通用序列作引物实现预扩增产物的定量分析。
[0005] 该方法采用如下步骤进行：
[0006] (1)选用两条引物序列UP-15，-TAGGGGTGACTACCCACGGGT-3，， UP-25' -TGATAGGGAAGGCCCTGACGG-3'作为多重引物实时荧光定量PCR中特异引物前的通 用序列；
[0007] (2)选用15组针对alkB基因第二个和第四个组氨酸保守区对应的核酸序列设计 引物，其中上游混合引物由M-1F至M-15F等比例混合而成：
【权利要求】
1. 一种一次准确定量烷烃羟化酶基因alkB的方法，其特征在于采用如下步骤进行： (1) 选用两条引物序列UP-I5 ' -TAGGGGTGACTACCCACGGGT-3 '，UP-2 5' -TGATAGGGAAGGCCCTGACGG-3'作为多重引物实时荧光定量PCR中特异引物前的通用序 列； (2) 选用15组针对alkB基因第二个和第四个组氨酸保守区对应的核酸序列设计引物， 其中上游混合引物由M-IF至M-15F等比例混合而成： +游混^引物由下列引物M-IR至M-15R
以等比例混合而成: '
(3) 样品的采集和预处理； (4) 环境样品核酸的提取； (5) 阳性和阴性质控品的制备； (6) 烷烃羟化酶基因alkB标准曲线的绘制及灵敏度实验； 将浓度为l〇7copies/yL的阳性质控品，依次稀释为LOXlO6U.OXlO5U. 0X104、 1. 0X103、1. 0X102、1. 0XIO1和1. 0X10 °，每个梯度设置3个平行，并且设置无模板对照，利 用上述步骤（2)的引物体系为模板进行预扩增，预扩增的PCR体系为：
预扩增条件为：
利用预扩增产物进行实时荧光定量PCR分析； 扩增的PCR体系为：
:丨 3 :丨 :::丨 3 扩增条件为：
扩增反应结束后，计算各浓度样品所对应的Ct值，并以拷贝数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标绘制烷烃羟化酶基因alkB标准曲线； (7) 用步骤（2)的15对5'端含有通用序列接头的特异引物对环境基因组中的烷烃羟 化酶基因alkB进行预扩增，进一步利用预扩增产物进行实时荧光定量PCR分析；PCR体系 和扩增条件同步骤（6); (8) 扩增反应结束后，根据待测样品的Ct值及标准曲线的拟合方程式计算出烷烃羟化 酶基因alkB的量。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤⑴所述的两个通用序列，是利用大肠杆 菌的终止密码子和稀有密码子组合设计的一对用作定量引物的DNA序列，在利用该序列作 引物进行正常的PCR扩增时，以环境基因组为模板不能获得扩增产物。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2)所述的带有通用序列接头的特异 弓丨物，首先从GeneBank数据库http://www.ncbi.nlm.nih.ROV和功能基因数据库http:// funRene.cme.msu.edu/index.spr下载已报道的2000组目的基因序列，然后用Mothur软 件找出重复序列，用ClustalXl. 81进行序列比对，然后用MEGA4软件中P-distance模型和 Neighbor-joining算法进行各序列间的同源性和进化距离的分析与比较，构建系统发育 树，接着在核酸水平上对目的基因序列进行比对分析，针对第二个和第四个组氨酸保守区 对应的核酸序列设计引物，按照系统发育树将进化距离小于0. 12的序列分为一组，共得到 15组，最后用ClustalX软件进行组内序列比对，用Oligo软件设计出15对5'端含有通用 序列接头的特异引物，其中上游引物含有UP-I序列，下游引物含有UP-2序列。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于该方法是基于通用序列的多重引物实时荧光 定量PCR方法，每对特异引物的5'端加入一种或两种相同碱基的通用序列，这种相同碱基 的通用序列可以作为多重引物实时荧光定量PCR的定量引物，在进行PCR时先通过15对5' 端含有通用序列接头的特异引物预扩增3?8轮，然后通过定量引物的扩增产物进行定量 分析，能够对同源关系较远的烷烃羟化酶基因alkB同时进行定量。
5. -种权利要求1所述方法的应用，用于对环境中烷烃羟化酶基因alkB的定量分析和 检测，具有操作简便快速、特异性高、检测灵敏度高的特点，基因的最低检测浓度为IXlO2 拷贝/ml。
【文档编号】C12Q1/68GK104450889SQ201410648293
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】马挺, 李国强, 高梦黎, 田会梅, 高配科, 陈兆会 申请人:南开大学