一种获得牡丹单条染色体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种获得牡丹单条染色体的方法，通过显微切割技术获得，该方法通过选取减数分裂时期的牡丹细胞，经过样品液制备、镜检、转膜、压片分散牡丹染色体等步骤，得到样品；再用高端激光显微切割系统，通过准备收集管、上样、寻找和选定目标染色体、调节激光参数、目标染色体划线、激光切割进而成功得到牡丹花粉母细胞中完整的单条染色体，且染色体之间没有相互污染，为下游研究做好铺垫。
【专利说明】-种获得牡丹单条染色体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞生物学显微分离【技术领域】，具体涉及一种获得牡丹单条染色体的 方法，特别涉及一种通过激光显微切割分离技术获得牡丹单条染色体的方法。
【背景技术】
[0002] 染色体显微切割分离技术是从细胞生物学深入到分子生物学的一项桥梁技术。近 年来，该技术在构建基因高分辨遗传图谱和物理图谱，快速有效的获得染色体区带特异性 的序列标签位点（ST巧及表达序列标签巧ST)，构建克隆连锁群，W及在同源基因的定位和 克隆等方面显示出巨大的优越性。该技术自80年代初问世W来，最大的突破点就是与PCR 技术相结合，之后通过与微克隆、FISH、DNA测序、文库筛选等分子生物学技术相结合，在文 库构建、染色体病研究、基因定位与克隆、W及进化遗传学等方面的研究中取得了令人瞩目 的成绩，由于该技术具有独特的直接性和实用性，因此在分子生物学领域显示出良好的应 用自U景。
[0003] 目前已报道的染色体分离技术主要有玻璃针法、流式细胞法W及激光显微切割技 术。染色体显微分离技术产生于20世纪80年代初，1981年，德国的欧洲分子生物学实验 室巧MBL)Scalenghe 等（Scalenghe E,Tureo E, Edrom J E, etal, 1981. Microdissection and cloning of DNA from a speci円c region of Drosophila melanogaster Polytene C虹omosomes. Qiromosoma, 82:205-16.)用极细玻璃针（直径大约为0. lum)成功分离了果 虫电多线期X染色体第3段的几个片段，通过蛋白酶消化、酷抽提、EcoRI酶切进行重组克隆了 果虫电局部染色体区段，之后玻璃针手工切割技术被应用于部分动物局部染色体的分离，在 植物染色体分离方面也有应用，如向日葵，西瓜，烟草，水稻、大豆等染色体的切割分离。玻 璃针法虽然费用成本较低，但是手工操作困难，需要很强的显微操作技能。
[0004] 流式细胞法是根据染色体发出的英光波长不同从而分离得到各条染色体，该技术 是一项自动分离技术，比手工分离的玻璃针方法更便捷，但是用该法一般不能够得到单条 染色体，得到的是成百上千条相同或相似的染色体，所W，染色体之间存在很高的污染可能 性。
[0005] 激光显微切割技术即利用全自动激光显微切割系统，在显微镜下通过激光对非均 一性样品进行特定分选、收集。全自动激光显微切割系统是DNA、RNA研究及蛋白质组学等 研究工作中的最新技术之一，可W最大程度地避免混合样本对精细实验结果造成的细微干 扰或误导，从而得到最精确的实验结果（Leica LMD7000激光显微切割中文操作手册）。该 系统能够切割病理切片组织、细胞集落、单细胞、染色体W及活细胞等微小样本。激光显微 切割技术比手工操作的玻璃针和主要针对多条染色体分离的流式细胞法更加便捷、更加精 准，且能够分离单个细胞内的单条或数条染色体。但是，由于激光显微操作系统价格昂贵， 所W应用不广泛。
[0006] 目前，彭仁海等（亚洲棉7号染色体分离及文库构建，棉花学报，2012,24巧）； 379?385)，杨红艳（激光显微分离杨树染色体技术研究，北京林业大学，2010)，马有志等 (小麦染色体的显微激光分离，遗传学报，26 (I) :43-48,1999)，高居荣等（激光显微切割技 术切割棉花单条染色体的研究，实验技术与管理，2009)通过激光显微切割获得了单个细胞 内的数条染色体或单染色体，但是由于各物种染色体的制备、染色体的分离操作到收集各 不相同，现有技术中还没有牡丹或巧药科植物染色体显微分离技术的正式报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种获得牡丹单条染色体的方法，通过激光显微切割技术获 得，该方法中的显微切割过程由人工和电脑共同控制，采用人工划线、激光自动或手动控制 切割，在对染色体无损伤的情况下，即可得到牡丹单条完整染色体。
[0008] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：
[0009] -种获得牡丹单条染色体的方法，其通过显微切割技术获得，包括如下步骤：
[0010] 第一步，样品制备
[0011] 1)样品液制备；选取牡丹花蕾上的雄蕊并进行软化，切取花药，向花药上滴加 20?30 y 1卡宝品红进行染色，并夹碎样品，去掉组织残渣，得到样品液；
[0012] 2)镜检；将样品液在普通光学显微镜10?30倍下进行初步观察，判断是否有 10% W上的牡丹细胞处于减数分裂后期，如果有10% W上的牡丹细胞处于减数分裂后期， 则继续下面实验；如果处于减数分裂后期的牡丹细胞数目小于10%，则重新选取雄蕊；
[0013] 3)转膜；将样品液从普通载玻片转移到覆膜载玻片上，保持覆膜完整；
[0014] 4)压片；用盖玻片盖在覆膜载玻片的样品液上，垂直敲打盖玻片，使染色体散开； 压片、掲掉盖玻片、室温瞭干覆膜载玻片；
[0015] 第二步，显微切割
[0016] 1)准备收集管；将PCR管固定在激光显微切割仪的收集管架上，向PCR管中加入 3?6 y 1 1 % TE溶液；
[0017] 2)上样；将样品制备步骤中的步骤5)瞭干的覆膜载玻片倒置固定于激光显微切 割仪的样品夹中；
[0018] 3)寻找目标染色体：在显微镜10?30倍镜下寻找目标染色体；
[0019] 4)选定目标染色体；切换显微镜40?63倍镜，调出清晰画面；
[0020] 5)调节激光参数：
[0021] 6)目标染色体划线：在软件采集屏幕中画出要切割的目标染色体区域；
[0022] 7)激光切割：自动或手动控制激光切下所选取的目标染色体，并收集至PCR 管；小也取下PCR管，并盖严，对PCR管进行离也，使溶有染色体的溶液沉入管底，并 于-4(TC?-8(TC保存，备用。
[0023] 进一步，所述的样品制备过程中的步骤1)所述的牡丹花蕾颜色嫩黄，直径为12? 16mm，细胞处于减数分裂后期。
[0024] 又，步骤1)所述的软化及切取花药过程为，在普通载玻片上滴一滴醋酸，将选取 的雄蕊置于醋酸中软化，用解剖针切取1?3mm长的花药。
[00巧]又进一步，所述的样品制备过程中的步骤3)转膜，还包括，用少量醋酸清洗残留 在普通载玻片上的样品液，将清洗液也转移到覆膜载玻片上。
[0026] 优选地，在所述的显微切割过程中，步骤5)调节的激光参数为；激光强度power范 围，15?20 ;激光孔径aperture, I?3 ;激光切割速度speed, 10?15 ;其他参数为机器设 定参数。
[0027] 优选地，为了避免染色体失活，所述的样品制备过程的操作最好在冰上进行。
[0028] 本发明在样品制备过程中的转膜，利用液体的表面张力作用，将样品液从普通载 玻片转移到覆膜载玻片上；通过将样品转移到覆膜载玻片上，使切割分离下来的染色体通 过覆膜的重力作用掉入PCR管中，从而收集到染色体。
[0029] 瞭干覆膜载玻片前，掲盖玻片时容易损失染色体，所W要快速掲片，即从覆膜载玻 片上掲掉普通盖玻片时要干净利落，减少样品中染色体的损失和损伤；同时，在开始时也要 注意材料的选择，即选择较多处于减数分裂后期（减数第一次、第二次分裂后期均可）的细 胞，此时期的牡丹染色体之间自然向细胞两极分离，再通过人工压片促使染色体之间更加 分散，进而减少了细胞内染色体之间的重叠程度。
[0030] 在显微切割的过程中，寻找目标染色体时，由于隔着一层玻璃，可能会造成画面清 晰度不高，不利于区分染色体，因此本发明在压片时要将染色体充分散开，能够清楚的区分 所要切割的染色体边缘；压片时避免晃动，防止损伤染色体。
[0031] 在调节激光参数时，要确保激光能量能够切下完整染色体，因此，激光强度不能过 高，强度过高时会对染色体造成轻微损伤；激光切割速度适中，切割太慢时会使切割时间延 长，也容易对染色体造成轻微损伤，切割太快则可能切割不完全，使沾有染色体的覆膜不能 掉下来；线宽（即激光孔径）要尽量细，防止切到其他染色体。
[00础有益效果
[0033] 本发明方法在取样过程中多选择处于减数分裂时期后期的花粉母细胞，此时期的 牡丹染色体之间自然向细胞两极分离，再通过人工压片促使染色体之间更加分散，进而减 少了细胞内染色体之间的重叠程度。人工压片减少了染色体之间因距离较近而可能造成的 污染几率，有利于获得不受污染的单条染色体。
[0034] 本发明在压片时将染色体充分散开，易于区分，在进行显微切割的过程中，寻找目 标染色体时，隔着玻璃得到清晰度较好的画面，利于区分染色体，获得完整的单条染色体。 [00巧]利用本发明的方法中显微切割过程采用人工和计算机共同控制，可W获得完整的 牡丹单染色体，进而可获得高纯度单条染色体的DNA。
[0036] 本发明的方法也可用于切割巧药属其它物种的染色体，由于牡丹染色体本身较 大，所W在40?63倍镜下即可切割。此技术试用其他染色体时，染色体较小的话，则需调 高显微镜倍数。
【专利附图】
【附图说明】
[0037] 图1是本发明实施例1中处于减数第一次分裂后期的细胞。
[003引图2是本发明实施例1中选定的目标染色体。
[0039] 图3是本发明实施例1中划线的目标染色体。
[0040] 图4是本发明实施例1中对目标染色体激光切割后的区域。
[0041] 图5是本发明实施例2中的目标染色体DNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中，1，2，3为 PCR产物。
【具体实施方式】
[0042] W下结合具体实施例和附图进一步详细描述本发明的技术方案，需要特别指出的 是，该些描述仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制，各种对本发明做出的显而 易见的修正和改变也纳入本发明的范围内。
[0043] 实施例1通过显微切割技术获得凤丹单条染色体的方法
[0044] 1.器材和试剂
[0045] 器材；綴子，冰盒，解剖针，载玻片，盖玻片，培养皿，滤纸，吸水纸，烧杯，酒精灯， PCR管，覆膜载玻片，单面刀片，10 U 1移液枪及枪头，普通光学显微镜，小型离也机，莱卡显 微切割仪7000。
[004引试剂；卡宝品红，45%醋酸（体积比），70%酒精（体积比），1% TE溶液（lOmmol/ L Tris-HCUpH 8.0)，Immol/L EDTA(pH 8.0))。
[0047] 2.样品制备
[004引 1)取出保存在酒精中的颜色嫩黄、直径在12?16mm之间的牡丹花蕾，用綴子夹出 后撕取一根雄蕊，吸水纸吸去上面的酒精。
[0049] 2)然后在普通载玻片上滴一小滴45%的醋酸，将选取的雄蕊置于醋酸中软化1? 3s，用解剖针切取一段1?2mm长的花药，剩下的放入酒精中保存。
[0050] 3)向普通载玻片上的花药滴加20 Ul左右卡宝品红，并用綴子夹碎样品，去掉肉 眼可见的花药组织残渣，得到染色后的样品液。
[0051] 4)将染色后的样品液在普通光学显微镜下进行初步观察，判断是否有10% W上 的染色体处于减数分裂后期（参见图1)，如果有10% W上的牡丹细胞处于减数第一次或第 二次分裂后期，则继续下面实验；如果处于减数第一次或第二次分裂后期的细胞数目小于 10%，则重新选取雄蕊。
[0052] 5)利用液体的表面张力作用，将样品液从普通载玻片上转移到覆膜载玻片上；用 綴子夹取液体，液体吸附在綴子上，在覆膜上轻轻一点，有少许液体粘在膜上之后，此时綴 子张开，样品液即转移到覆膜上，注意不要弄破覆膜。
[0053] 6)将盖玻片盖在覆膜载玻片的样品液上，用解剖针底部垂直敲打盖玻片，使染色 体散开。
[0054] 7)用大拇指用力压片，注意手指不要滑动；利用单面刀片从盖破片一侧迅速将盖 玻片掲掉；室温瞭干覆膜载玻片，得到样品。
[005引 3.显微切割
[0056] 1)打开莱卡激光显微切割仪，过5分钟之后打开激光钥匙，准备好样品夹及收集 装置，收集装置为4个PCR管。
[0057] 。将4个PCR管按A，B，C，D管槽顺序做好标记，将PCR管分别固定在收集架上， 每个PCR管中打入加1 1 % TE溶液。
[0058] 3)打开软件，点击收集管卸载（unload)图标，装上收集架，点击复位（continue) 选项，收集架退回机器。
[005引4)点击样品夹卸载（unload)图标，将赔干的覆胺载玻片倒置固定于样品夹中，并 小也放入，点击复位（continue)选项，样品夹退回机器。
[0060] W在显微镜20倍镜下找到目标染色体后，转换到40倍或63倍镜，调出清晰画面。
[0061] 6)点击激光菜单（laser menu)图标下的激光控制（laser control)命令，调节激 光参数中激光强度（power)范围为15?20,孔径（aperture)为1?3,切割速度（speed) 为10?15,其他参数为机器设定参数。
[0062] 7)选择收集管A (或B、C、D)，选择切割（化aw+州t)命令，在软件采集屏幕里画出 要切割的区域，再切下所选取的染色体。参见图2?图4,图2为选定的目标染色体，图3为 对选定的目标染色体划线，图4为激光切割目标染色体后的结果。
[0063] 如果目标区域有干扰成分，则可选择点击即切割（move+cut)命令，切掉干扰成分 之后再对目标染色体进行切割。
[0064] 8)小也取下PCR管，并盖严。
[0065] 9)用小型离也机对PCR管进行离也，使溶有染色体的溶液沉入管底，并于-8(TC保 存。
[0066] 实施例2单染色体扩增实验
[0067] 选取H个实施例1切割下来的牡丹单染色体，利用单细胞全基因组扩增试剂盒进 行扩增，之后进行琼脂糖凝胶电泳，再用nano化OP (超微量分光光度计）测定DNA浓度。
[0068] 参见图5,为目标染色体DNA的琼脂糖凝胶电泳图，左起第二孔为DL2000DNA marker,第3,4,5孔分别为选取的H条单染色体扩增出来的弥散带，扩增出来的片段长度 为300?2000bp，W 1 % TE溶液做空白对照（CK组），测得DNA浓度如表1所示：
[0069] 表 1 DNA 浓度
[0070]
【权利要求】
1. 一种获得牡丹单条染色体的方法，其特征在于，通过激光显微切割技术获得牡丹单 条染色体，包括如下步骤： 第一步，样品制备 1) 样品液制备：选取牡丹花蕾上的雄蕊并进行软化，切取花药，向花药上滴加20? 30 yl卡宝品红进行染色，并夹碎样品，去掉组织残渣，得到样品液； 2) 镜检：将样品液在普通光学显微镜10?30倍下进行初步观察，判断是否有10%以 上的牡丹细胞处于减数分裂后期，如果有10%以上的牡丹细胞处于减数分裂后期，则继续 下面实验；如果处于减数分裂后期的牡丹细胞数目小于10%，则重新选取雄蕊； 3) 转膜：将样品液从普通载玻片转移到覆膜载玻片上，保持覆膜完整； 4) 压片：用盖玻片盖在覆膜载玻片的样品液上，垂直敲打盖玻片，使染色体散开；压 片、揭掉盖玻片、室温晾干覆膜载玻片； 第二步，显微切割 1) 准备收集管：将PCR管固定在激光显微切割仪的收集管架上，向PCR管中加入3? 6 ill 1 % TE 溶液； 2) 上样：将上述晾干的覆膜载玻片倒置固定于激光显微切割仪的样品夹中； 3) 寻找目标染色体：在显微镜10?30倍镜下寻找目标染色体； 4) 选定目标染色体：切换显微镜40?63倍镜，调出清晰画面； 5) 调节激光参数： 6) 目标染色体划线：画出要切割的目标染色体区域； 7) 激光切割：自动或手动控制激光切下所选取的目标染色体，并收集至PCR管；小心取 下PCR管，并盖严，对PCR管进行离心，使溶有染色体的溶液沉入管底，并于-40°C?_80°C 保存，备用。
2. 根据权利要求1所述的获得牡丹单条染色体的方法，其特征在于，所述的样品制备 过程中，步骤1)所述牡丹花蕾的颜色嫩黄、直径为12?16mm。
3. 根据权利要求1所述的获得牡丹单条染色体的方法，其特征在于，所述的样品制备 过程中，步骤1)所述的软化及切取花药过程为，在普通载玻片上滴一滴醋酸，将选取的雄 蕊置于醋酸中软化，用解剖针切取1?3mm长的花药。
4. 根据权利要求1所述的获得牡丹单条染色体的方法，其特征在于，所述的样品制备 过程中，步骤3)转膜，还包括，用少量醋酸清洗残留在普通载玻片上的样品液，将清洗液也 转移到覆膜载玻片上。
5. 根据权利要求1所述的获得牡丹单条染色体的方法，其特征在于，所述的显微切割 过程中，步骤5)调节的激光参数为：激光强度范围，15?20 ;激光孔径1?3 ;激光切割速 度10?15 ;其他参数为机器设定参数。
6. 根据权利要求1至4任一项所述的获得牡丹单条染色体的方法，其特征在于，样品制 备操作在〇?4°C进行。
【文档编号】C12N5/04GK104357375SQ201410648397
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】袁军辉, 胡永红, 张林娟 申请人:上海辰山植物园