使用稳定辅酶的脱氢酶稳定作用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及使用稳定辅酶的脱氢酶稳定作用。本发明涉及通过在稳定辅酶的存在下贮藏酶用于使酶稳定的方法。此外，本发明涉及使用稳定辅酶稳定的酶及其在用于检测分析物的测试元件中的用途。
【专利说明】使用稳定辅酶的脱氢酶稳定作用
[0001] 本申请是国际申请日为2009年2月19日的国际申请PCT/EP2009/001206进入中 国、申请号为200980105640. 6的题为"使用稳定辅酶的脱氢酶稳定作用"的发明专利申请 的分案申请。
【技术领域】
[0002] 本发明涉及通过在稳定辅酶的存在下贮藏酶使酶稳定的方法。本发明进一步涉及 用稳定辅酶稳定的酶，及其在用于检测分析物的测试元件中的用途。
【背景技术】
[0003] 生物化学测量系统是临床相关的分析方法的重要组成成分。本文优先考虑的事是 测量分析物例如代谢物或底物，其借助于酶直接或间接进行测定。分析物在这种情况下借 助于酶_辅酶复合物进行转变，并且随后进行定量。这需要待测定的分析物与合适的酶和 辅酶接触，其中酶通常以催化量使用。辅酶通过酶促反应得到改变，例如被氧化或还原。这 个过程可以直接，或通过介质电化学或光度测定地进行检测。校准提供量度和待测定的分 析物浓度之间的正相关关系。
[0004] 辅酶是与酶共价或非共价结合，并且通过分析物的转变而改变的有机分子。辅酶 的突出例子分别是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)，由 其通过还原分别产生NADH和NADPH。
[0005] 现有技术中已知的测量系统因对于有限时间段稳定，以及为了达到这种稳定性对 环境的特定需求例如冷却贮藏或干燥贮藏而著称。对于具体应用，例如由最终用户自身执 行的测试，例如在血糖的自我监控中，通过不正确、不引人注意的错误贮藏发生不正确的结 果因此是可能的。通过主要包装打开太长时间的干燥剂耗尽特别可能导致错误测量，这对 于一些系统几乎不会被用户鉴别出。
[0006] 用于增加生物化学测量系统的稳定性的一种已知措施是使用稳定的酶，例如使用 来自嗜热生物的酶。进一步的可能性是通过化学修饰例如交联或通过诱变使酶稳定。此 夕卜，还可以添加酶稳定剂例如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清清蛋白，或可以在聚合物网络 中例如通过光聚合而封入酶。
[0007] 还已进行通过使用稳定的介质来改善生物化学测量系统的稳定性的尝试。因此， 通过使用具有尽可能低的氧化还原电位的介质，测试的特异性增加，并且在反应过程中的 干扰被消除。然而，酶/辅酶复合物的氧化还原电位形成对于介质的氧化还原电位的下限。 低于这些电位，与介质的反应减慢或甚至停止。
[0008] 可替代可能性也是使用不含介质的生物化学测量系统，其中例如存在辅酶例如辅 酶NADH的直接检测。然而，此种测量系统的一个缺点是辅酶例如NAD和NADP是不稳定的。
[0009] NAD和NADP是对碱不稳定的分子，其降解途径在文献中得到描述 (N. J. Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzymes,Academic Press New York, London 1982,编辑 J. Everese，B. Anderson，K. You，第 3 章，第 56-65 页）。NAD 和 NADP 的 降解通过切割核糖和吡啶单位之间的糖基键分别基本上导致ADP-核糖。另一方面还原型 NADH和NADPH是对酸不稳定的：例如，表异构化是一种已知的降解途径。在两种情况下， NAD/NADP和NADH/NADPH的不稳定性都来源于核糖单位和吡啶单位之间的糖基键的不稳定 性。然而，即使在不急剧的条件下，例如在水溶液中，辅酶NAD和NADP分别仅通过环境水分 而水解。这种不稳定性可能导致分析物测量中的不精确。
[0010] 许多 NAD/NADP 衍生物例如在 B. M. Anderson in The Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press New York, London 1982,编辑 J. Everese，B. Anderson，K. You， 第4章中得到描述。然而，这些衍生物中的大多数不由酶良好接受。迄今为止因此已用于 诊断测试的唯一衍生物是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（乙酰NAD)，其在1956年首次得到 描述（N. 0. Kaplan，J. Biol.Chem. (1956)，221，823)。这种辅酶也显示由酶的弱接受和氧化 还原电位中的改变。
[0011] W0 01/94370描述了具有经修饰的吡啶基团的进一步NAD衍生物的使用。然而，烟 酰胺基团的修饰一般而言对催化反应具有直接影响。在大多数情况下，这种影响是负面的。
[0012] 在关于稳定作用的进一步想法中，核糖单位已进行改变，以从而影响糖基键的稳 定性。这个程序不直接干扰烟酰胺基团的催化反应。然而，一旦酶显示出与核糖单位的 强烈和特异性结合，就可能存在间接影响。Kaufmann等人在这方面在W0 98/33936和US 5,801，006以及冊01/49247中分别公开了许多硫代核糖（也1〇1^13〇86)-隱0衍生物。然 而，迄今为止仍未显示出烟酰胺-核糖单位的修饰和衍生物在酶促反应中的活性之间的联 系。
[0013] 不含糖基键的衍生物CarbaNAD在1988年首次得到描述（J. T. Slama， Biochemistry 1989, 27，183 和 Biochemistry 1989, 28, 7688)。其中的核糖由碳环糖单位 替换。尽管carbaNAD描述为脱氢酶的底物，但它的活性迄今为止仍未在临床上在生物化学 检测方法中得到证实。
[0014] 类似方法随后由G. M. Blackburn，Chem. Comm.，1996, 2765进行描述，以用亚甲 基双膦酸盐化合物代替天然的焦磷酸盐制备carbaNAD。亚甲基双膦酸盐显示对于磷酸 酶增加的稳定性并且用作ADP-核糖基环化酶的抑制剂。水解稳定性中的增加不是目的 (J. T. Slama，G. M. Blackburn) 〇
[0015] WO 2007/012494 和 US 11/460, 366 分别公开了稳定的 NAD/NADH和 NADP/NADPH衍 生物，这些衍生物的酶复合物及其在生物化学检测方法和试剂盒中的用途。
【发明内容】
[0016] 本发明所基于的目的是提供用于使酶稳定，特别是用于酶的长期稳定作用的方 法。
[0017] 这个目的通过用于使酶稳定的方法来达到，其中酶在稳定辅酶的存在下进行贮 藏。已令人惊讶地发现借助于稳定辅酶，在高相对湿度或甚至在液相中和在升高的温度下 几周或几月的长期稳定作用是可能的。这个认识是令人惊讶的，因为已知尽管在天然辅 酶的存在下酶具有数小时的增加的短期稳定性（Bertoldi等人，Biochem. J. 389,（2005)， 885-898 ;van den Heuvel 等人，（J.Biol. Chem. 280(2005)，32115-32121;和 Pan 等人， (J. Chin. Biochem. Soc.第3卷（1974)，第1-8页），但它们显示在较长时间段期间的较低稳 定性（Nutrition Reviews 36 (1978)，251-254)。
[0018] 与对于现有技术来说的这些认识相比较，令人惊讶的是，酶在稳定辅酶的存在下 具有比酶在天然辅酶的存在下显然增加的长期稳定性，这尤其是因为稳定辅酶对于酶具有 比天然辅酶更低的结合常数。
[0019] 通过本发明的方法得到稳定的酶是辅酶依赖性酶。合适的酶的例子是选自下述的 脱氢酶：葡糖脱氢酶（E.C. 1. 1. 1. 47)、乳酸脱氢酶（E.C. 1. 1. 1. 27、1. 1. 1. 28)、苹果酸脱氢 酶（E.C. 1. 1. 1. 37)、甘油脱氢酶（E.C. 1. 1. 1. 6)、醇脱氢酶（E.C. 1. 1. 1. 1)、a -羟丁酸脱氢 酶、山梨糖醇脱氢酶或氨基酸脱氢酶，例如L-氨基酸脱氢酶（E.C. 1. 4. 1. 5)。进一步合适的 酶是氧化酶，例如葡糖氧化酶（E.C. 1. 1. 3. 4)或胆固醇氧化酶（E.C. 1. 1. 3. 6)和氨基转移 酶，分别地，例如天冬氨酸或丙氨酸氨基转移酶、5'-核苷酸酶或肌酸激酶。酶优选是葡糖 脱氢酶。
[0020] 已证明在本发明方法的背景中采用突变的葡糖脱氢酶是特别优选的。如在本申请 的背景中使用的，术语"突变体"指天然酶的基因修饰变体，其尽管氨基酸数目是相同的，但 具有与野生型酶相比较经修饰的氨基酸序列，即在至少一个氨基酸中不同于野生型酶。一 个或多个突变的引入可以位点特异性地发生或非位点特异性地发生，优选通过使用本领域 已知的重组方法位点特异性地发生，然而，适合于具体需求和条件，发生在天然酶的氨基酸 序列内的至少一个氨基酸交换。与野生型酶相比较，突变体特别优选具有增加的热或水解 稳定性。
[0021] 突变的葡糖脱氢酶原则上可以包括通过与相对应的野生型葡糖脱氢酶相比较，在 其氨基酸序列中在任何位置处进行修饰的一个或多个氨基酸。突变的葡糖脱氢酶优选包括 在野生型葡糖脱氢酶的氨基酸序列的位置96、170和252中至少一个处的突变，特别优选具 有在位置96和位置170处的突变，以及在位置170和位置252处的突变的突变体。已证明 对于突变的葡糖脱氢酶不包括除这些突变外的进一步突变是有利的。
[0022] 在位置96、170和252处的突变原则上可以包括野生型酶的任何氨基酸交换，其导 致稳定作用，例如热或水解稳定性中的增加。在位置96处的突变优选包括谷氨酸对于甘氨 酸的氨基酸交换，而就位置170而言，谷氨酸对于精氨酸或赖氨酸的氨基酸交换，特别地谷 氨酸对于赖氨酸的氨基酸交换是优选的。就在位置252处的突变而言，这优选包括赖氨酸 对于亮氨酸的氨基酸交换。
[0023] 突变的葡糖脱氢酶可以通过衍生自任何生物学来源的野生型葡糖脱氢酶的突变 而获得，其中术语"生物学来源"在本发明的背景中包括原核生物例如细菌，和真核生物 例如哺乳动物和其他动物。野生型葡糖脱氢酶优选衍生自细菌，特别优选来自巨大芽孢 杆菌（Bacillusmegaterium)、枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)或苏云金芽抱杆菌 (Bacillusthuringiensis)特别是枯草芽孢杆菌的葡糖脱氢酶。
[0024] 在本发明的一个特别优选的实施方案中，突变的葡糖脱氢酶是通过来自枯草芽孢 杆菌的野生型葡糖脱氢酶的突变获得的葡糖脱氢酶，其具有SEQ ID NO. :l(GlucDH_E96G_ E170K)中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO. :2(GlucDH_E170K_K252L)中所示的那种。
[0025] 稳定辅酶是通过与天然辅酶相比较已进行化学修饰，并且具有比天然辅酶更高的 稳定性（例如，水解稳定性）的辅酶。稳定辅酶优选在测试条件下对水解是稳定的。与天 然辅酶相比较，稳定辅酶可以具有对于酶减少的结合常数，例如减少二分之一或更多的结 合常数。
[0026] 稳定辅酶的优选例子是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD/NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸磷酸（NADP/NADPH)的稳定衍生物，或截短的NAD衍生物，例如不含AMP部分或具有非 核苷残基，例如疏水残基。在本发明的背景中同样优选作为稳定辅酶的是式（I)的化合物
[0027]
【权利要求】
1.用于使酶稳定的方法，其特征在于所述酶在稳定辅酶的存在下进行贮藏，其中所 述酶是选自下述的脱氢酶：葡糖脱氢酶（E.c.I. 1. 1.47)、乳酸脱氢酶（E.C.I. 1. 1.27、 I.I. 1. 28)、苹果酸脱氢酶（E.C.I.I. 1. 37)、甘油脱氢酶（E.C.I.I. 1. 6)、醇脱氢酶 (E.C.I.I. 1. 1)、α-羟丁酸脱氢酶、山梨糖醇脱氢酶或氨基酸脱氢酶，例如L-氨基酸脱氢 酶（E.C. 1. 4. 1. 5)，且所述稳定辅酶是通式（II)的化合物
其中 A=腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂腺嘌呤或7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤，其中所述7-脱 氣变体可以任选在位置7中由齒素、C1-C6-块基、C1-C6-链稀基或C1-C6-烧基取代， T=在每种情况下是0， U=在每种情况下是0Η， V =OH或磷酸基，或形成环状磷酸基的2个基团； W=。0順2或COCH3， X1= 0， X2= 0， Y = 0,且 Z=通式（III)的化合物，
其中在If和R5"之间存在单键，其中R4 =在每种情况下独立地是H、F、Cl、CH3， R5=CH2, R5i =CH2、CHOH或NH， R5" =C(R4)2、CHOH或CHOCH3, R6=CH或CCH3，且R6' =CH或CCH3。
2. 根据权利要求1的方法，其特征在于将葡糖脱氢酶用作酶。
3. 根据权利要求1或2的方法，其中RY和R5"各自是CHOH。
4. 根据权利要求1-3中任一项的方法，其中RY是NH，并且R5"是CH2。
5. 根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于所述稳定辅酶是carbaNAD。
6. 根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于用稳定辅酶稳定的酶贮藏至少2周 的时间段。
7. 根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于用稳定辅酶稳定的酶贮藏于至少 20 °C的温度下。
8. 根据权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于用稳定辅酶稳定的酶无需干燥试剂 进行贮藏。
9. 根据权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于用稳定辅酶稳定的酶贮藏于至少 50 %的相对湿度下。
10. 根据权利要求1-9中任一项的方法，其特征在于用稳定辅酶稳定的酶的贮藏作为 干物质发生。
11. 根据权利要求1-9中任一项的方法，其特征在于用稳定辅酶稳定的酶的贮藏在液 相中发生。
12. 根据权利要求1-11中任一项的方法，其特征在于用稳定辅酶稳定的酶在测试元件 上发生。
13. 用稳定辅酶稳定的酶，其特征在于它显示在至少20°C的温度下，在合适时连同至 少50%的相对湿度且无需干燥试剂，贮藏至少2周后，与最初水平相比较，所述酶促活性中 的下降小于50%，其中所述酶是突变的葡糖脱氢酶，且所述突变的葡糖脱氢酶与相应的野 生型葡糖脱氢酶相比具有增加的热或水解稳定性，其中所述突变的葡糖脱氢酶包括在相应 的野生型葡糖脱氢酶的氨基酸序列的位置96、170和252中至少一个处的突变，且其中所述 稳定辅酶是通式（II)的化合物
其中 A=腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂腺嘌呤或7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤，其中所述7-脱 氣变体可以任选在位置7中由齒素、C1-C6-块基、C1-C6-链稀基或C1-C6-烧基取代， T=在每种情况下是0， U=在每种情况下是0H， V=OH或磷酸基，或形成环状磷酸基的2个基团； W=。0順2或COCH3， X1= 0， X2= 0， Y= 0,且 Z=通式（III)的化合物，
其中在If和R5"之间存在单键，其中R4 =在每种情况下独立地是H、F、Cl、CH3， R5=CH2, R5i =CH2、CHOH或NH， R5" =C(R4)2、CHOH或CHOCH3, R6=CH或CCH3，且R6' =CH或CCH3。
14. 用于测定分析物的检测试剂，其包括根据权利要求13的稳定的酶。
15. 测试元件，其特征在于它包括根据权利要求13的稳定的酶或根据权利要求14的检 测试剂。
【文档编号】C12N9/06GK104450659SQ201410680334
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2009年2月19日 优先权日:2008年2月19日
【发明者】海因德尔 D., 霍恩 C., 加斯勒迪切 C., 霍内斯 J. 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司