胁迫盐生杜氏藻积累β-胡萝卜素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种胁迫盐生杜氏藻积累β-胡萝卜素的方法，属水产养殖领域。传统上盐生杜氏藻采用开放型跑道式大池且使用Hutner培养液培养，光照强度和温度完全依赖大自然，生长慢，产量低，易污染，成本高，β-胡萝卜素含量低。为了克服目前技术的不足，本发明采用室内控光控温培养，根据盐生杜氏藻不同生长阶段的特定需要调整光照强度和温度，特别是在培养的后期，提高光照强度和温度并补充了氯化铵，人尿，磷酸钙，盐酸硫胺素等且改变了传统一次性培养的做法，在培养的后期更换培养液，去除了培养液中的氮盐和磷盐并提高盐度，大大提高了盐生杜氏藻生长速度，β-胡萝卜素含量提高70％。
【专利说明】胁迫盐生杜氏藻积累β-胡萝卜素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种胁迫盐生杜氏藻积累β -胡萝卜素的方法。
【背景技术】
[0002]盐生杜氏藻Dunaliella salina是一种双鞭毛单细胞绿藻，可耐高盐度(20-300%。)。盐生杜氏藻在胁迫条件下可大量积累β -胡萝卜素，最高可达干重的14%，为自然界所有生物之首，因此早在1966年，Massyuk就提出可大规模培养盐生杜氏藻生产β_胡萝卜素；另外盐生杜氏藻含有的甘油可达干重的40%，具有生产甘油的潜在前途；盐生杜氏藻还是一种良好的水产动物饲料。我国具有漫长的海岸线和众多的内陆盐湖，具有培养盐生杜氏藻生产β_胡萝卜素得天独厚的自然条件。
[0003]氮、磷盐种类及其比例、温度、光照、盐度、pH值等对盐生杜氏藻生长都有重要影响。氮在细胞代谢中是形成氨基酸、嘌呤、嘧啶、叶啉、氨基糖和胺化合物等的基本元素，因而氮是盐生杜氏藻生长最重要的营养元素。有研究认为硝酸态氮是盐生杜氏藻生长的最佳氮源。关于盐生杜氏藻生长的最适NaNO3浓度，各学者研究结果不一。有的认为l.0mmol/L较好(Loeblich, 1982),有的认为5.0mmol/L较合适(Amotz et al,1982)。但后来米用较低浓度的氮盐(0.75mmol/L, Amotz et al, 1989 ;1.0mmol/L, Borowiska, 1997)也获得了很好的生长效果。我的研究结果支持这个观点。我的实验表明，NaNO3浓度为1.5mm0l/L时，盐生杜氏藻生长最快；而NaNO3浓度为0.5mmol/L时,盐生杜氏藻有最高的β -胡萝卜素含量。而陈晗华、Hejazi等也认为盐生杜氏藻生长的最适条件为N 1.0mmol/L,P 0.3mmol/L。
[0004]研究者早已发现，盐生杜氏藻生长的二阶段对光照、温度、盐度、营养盐等环境因子要求显著不同。Laws等发现2.0mmol/L的氮盐对盐生杜氏藻生长最好，但氮浓度为O时，单细胞有最大的胡萝卜素含量。我的研究表明，较高的NaNO3有利于D.salina的生长，而较低的NaNO3有利于D.salinaβ -胡萝卜素的积累,这与G1rdano,Hirsch等的研究结果吻合。β_胡萝卜素的作用除光保护外，还有其它尚未搞清楚的功能。我的研究表明，三高一低(高光强、高温度、高盐度，低营养盐特别是低氮和低磷)和培养液的老化有利于
胡萝卜素的合成。很明显，盐生杜氏藻的细胞生长和胡萝卜素积累是两个矛盾的生理过程，适于细胞生长的氮、磷浓度不适合其胡萝卜素积累。对此，我们可以合理控制氮盐浓度，既能获取较大生物量，又能获得较大的β_胡萝卜素产量。据此，本发明提出了盐生杜氏藻生产的二阶段养殖法，即先用较低的盐度和光照及较高的氮盐条件使藻增殖至较理想的密度，再提高盐度和光照、温度胁迫胡萝卜素的积累。
[0005]传统上盐生杜氏藻的大量培养采用开放型跑道式大池且使用Hutner培养液培养，光照强度和温度完全依赖大自然，变化无常且不符合盐生杜氏藻各阶段生长和β -胡萝卜素积累的要求，无法人为控制，生长慢，产量低，易污染，成本高，基础投资大，β_胡萝卜素含量低，产品质量差。为了克服目前技术的不足，本发明采用室内控温、控光培养，根据盐生杜氏藻不同生长阶段的特定需要调整光照强度和温度，特别是在培养的后期，加大光照强度和温度，胁迫盐生杜氏藻积累β-胡萝卜素，并对传统培养基进行了调整，补充了氯化钠，氯化铵，人尿，磷酸钙，硫酸铵，氯化铁，盐酸硫胺素，烟酸，维生素B12且改变了传统一次性培养的做法，在培养的后期更换培养液，去除了培养液中的氮盐和磷盐并提高盐度，胁迫β-胡萝卜素的合成，大大提高了盐生杜氏藻的生长速度和产量，β_胡萝卜素含量提高70%。
【发明内容】
[0006]为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种胁迫盐生杜氏藻积累胡萝卜素的方法，具体方法如下:
[0007]步骤I培养液的配制I号培养液成分:煮沸冷却后的海水1000份，氯化钠15份，硝酸钠2份，氯化铵I份，人尿1.5份，磷酸钙0.04份，硫酸铵0.5份，氯化铁0.002份，盐酸硫胺素0.001份，烟酸0.002份，维生素B120.001份；取此培养液2000毫升装入一 3000毫升的三角烧瓶，保鲜膜和橡皮筋封口，放在摇床上摇匀15分钟，放入4°C冰箱保存备用。2号培养液成分:煮沸冷却后的海水1000份，氯化钠25份，氯化铁0.002份，盐酸硫胺素0.001份，烟酸0.002份，维生素B120.001份；摇匀后，放入4°C冰箱保存备用。
[0008]步骤2接种培养取一 3000毫升洁净的三角烧瓶，加入步骤I所述的I号培养液1500毫升，取生长旺盛、无污染、指数生长期的藻种接种，接种密度每毫升3万个藻细胞。轻轻摇匀30秒钟，灭菌的报纸和橡皮筋封口，室内培养，空调控温，日光灯管照明，通过控制打开灯管的数量多少来调节光照强度。调节温度至25°C，光照强度60001uX，从瓶口插入一直径4毫米的塑料管，塑料管另一端连接空气压缩机，充气培养，充入混合气体，气体成分=空气90% +纯C0210%，连续不间断充气，气量不宜太大，以让藻细胞浮起不下沉即可，光暗周期=14h/L+10h/D,即提供间歇光，14小时光照，10小时黑暗，连续培养7天。
[0009]步骤3更换培养液培养至第8天，藻细胞密度可达每毫升藻液90万个细胞，停止培养，从瓶口拔出充气管，用离心机离心采收藻细胞，离心机转速每分钟3600转，离心4分钟，可得牙膏状粘稠的藻泥，将此藻泥转入另一 3000毫升的干净的三角烧瓶中，加入步骤I所述的2号培养液1800毫升，报纸和橡皮筋封口，继续充气培养，充气方式和气量大小同步骤2。调节温度至28°C，光照强度90001uX，连续培养至第10天，从第11天开始，温度调至30°C，光照强度调至120001uX，连续培养2天，从第13天开始，温度调至32°C，光照调至150001ux ；
[0010]步骤4藻细胞采收至第15天，藻液呈砖红色，停止充气和培养，离心机采收藻细胞，将藻液加入离心机离心，离心机转速每分钟5400转，离心5分钟，得沉淀物，弃上清液，采收完毕。
[0011]有益结果
[0012]我的研究表明，盐生杜氏藻的细胞生长和胡萝卜素积累是两个矛盾的生理过程，适于细胞生长的氮、磷浓度不适合其胡萝卜素积累。三高一低(高光强、高温度、高盐度，低营养盐特别是低氮和低磷)及培养液的老化有利于β_胡萝卜素的合成。对此，我们可以合理控制氮盐浓度，既能获取较大生物量，又能获得较大的β_胡萝卜素产量。据此，本发明提出了盐生杜氏藻生产的二阶段养殖法，即先用较低的盐度和光照、温度及较高的氮盐条件使藻增殖至较理想的密度，再提高盐度和光照、温度胁迫胡萝卜素的积累。传统上盐生杜氏藻的大量培养采用开放跑道式大池且使用Hutner培养液培养，光照强度和温度完全依赖大自然，变化无常且不符合盐生杜氏藻各阶段生长和胡萝卜素积累的要求，无法人为控制，生长慢，产量低，易污染，成本高，基础投资大，β-胡萝卜素含量低，产品质量差。为了克服目前技术的不足，本发明采用室内控温、控光培养，根据盐生杜氏藻不同生长阶段的特定需要调整光照强度和温度，特别是在培养的后期，加大光照强度和温度，胁迫盐生杜氏藻积累胡萝卜素，并对传统培养基进行了调整，补充了氯化钠，氯化铵，人尿，磷酸钙，硫酸铵，氯化铁，盐酸硫胺素，烟酸，维生素B12且改变了传统一次性培养的做法，在培养的后期更换培养液，去除了培养液中的氮盐和磷盐并提高盐度，胁迫胡萝卜素的合成，大大提高了盐生杜氏藻的生长速度和产量，β_胡萝卜素含量提高70%。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为盐生杜氏藻的生长情况图；
[0014]其中横坐标为培养时间(天)，纵坐标为细胞密度，单位是万个细胞/每毫升藻液。
【具体实施方式】
[0015]①步骤I培养液的配制I号培养液成分:煮沸冷却后的海水1000份，氯化钠15份，硝酸钠2份，氯化铵I份，人尿1.5份，磷酸钙0.04份，硫酸铵0.5份，氯化铁0.002份，盐酸硫胺素0.001份，烟酸0.002份，维生素B120.001份；取此培养液2000毫升装入一 3000毫升的三角烧瓶，保鲜膜和橡皮筋封口，放在摇床上摇匀15分钟，放入4°C冰箱保存备用。2号培养液成分:煮沸冷却后的海水1000份，氯化钠25份，氯化铁0.002份，盐酸硫胺素0.001份，烟酸0.002份，维生素B120.001份；摇匀后，放入4°C冰箱保存备用。
[0016]②步骤2接种培养取一 3000毫升洁净的三角烧瓶，加入步骤I所述的I号培养液1500毫升，取生长旺盛、无污染、指数生长期的藻种接种，接种密度每毫升3万个藻细胞。轻轻摇匀30秒钟，灭菌的报纸和橡皮筋封口，室内培养，空调控温，日光灯管照明，通过控制打开灯管的数量多少来调节光照强度。调节温度至25°C，光照强度60001uX，从瓶口插入一直径4毫米的塑料管，塑料管另一端连接空气压缩机，充气培养，充入混合气体，气体成分=空气90% +纯C0210%，连续不间断充气，气量不宜太大，以让藻细胞浮起不下沉即可，光暗周期=14h/L+10h/D,即提供间歇光，14小时光照，10小时黑暗，连续培养7天。
[0017]③步骤3更换培养液培养至第8天，藻细胞密度可达每毫升90万，停止培养，从瓶口拔出充气管，用离心机离心采收藻细胞，离心机转速每分钟3600转，离心4分钟，可得牙膏状粘稠的藻泥，将此藻泥转入另一 3000毫升的干净的三角烧瓶中，加入步骤I所述的2号培养液1800毫升，报纸和橡皮筋封口，继续充气培养，充气方式和气量大小同步骤2。调节温度至28°C，光照强度90001uX，连续培养至第10天，从第11天开始，温度调至30°C，光照强度调至12000Iux，连续培养2天，从第13天开始，温度调至32°C，光照调至150001ux ；
[0018]④步骤4藻细胞采收至第15天，藻液呈砖红色，停止充气和培养，离心机采收藻细胞，将藻液加入离心机离心，离心机转速每分钟5400转，离心5分钟，得沉淀物，弃上清液，米收完毕。
[0019]⑤步骤2中接种用的盐生杜氏藻预先进行提纯(本领域常规方法，只要可实现提纯即可，例如高氏提取法)，以确保接种时藻种为纯种且处于生长旺盛的指数生长期；
[0020]⑥步骤I中各种营养盐要按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
[0021]⑦步骤I中各种无机营养盐和维生素可预先配成母液且置于4°C冰箱冷藏保存备用，放置时间不要超过30天；
[0022]⑧步骤I和2中所用三角烧瓶等玻璃仪器均需洗刷干净放在70°C烘箱中烘干后使用；
[0023]⑨步骤2所述接种过程需在无菌操作台上进行；
[0024]⑩步骤I中所用化学药品纯度均需化学纯级别。
[0025]最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
【权利要求】
1.一种胁迫盐生杜氏藻积累β-胡萝卜素的方法，其特征在于具体步骤如下: 步骤I)培养液的配制； I号培养液成分:煮沸冷却后的海水1000份，氯化钠15份，硝酸钠2份，氯化铵I份，人尿1.5份，磷酸钙0.04份，硫酸铵0.5份，氯化铁0.002份，盐酸硫胺素0.001份，烟酸.0.002份，维生素B120.001份；取此培养液2000毫升装入-3000毫升的三角烧瓶，保鲜膜和橡皮筋封口，放在摇床上摇匀15分钟，放入4°C冰箱保存备用；2号培养液成分:煮沸冷却后的海水1000份，氯化钠25份，氯化铁0.002份，盐酸硫胺素0.001份，烟酸0.002份，维生素B120.001份；摇匀后，放入4°C冰箱保存备用； 步骤2)接种培养 取一 3000毫升洁净的三角烧瓶，加入步骤I所述的I号培养液1500毫升，取生长旺盛、无污染、指数生长期的藻种接种，接种密度每毫升3万个藻细胞；轻轻摇匀30秒钟，灭菌的报纸和橡皮筋封口，室内培养，空调控温，日光灯管照明，通过控制打开灯管的数量多少来调节光照强度；调节温度至25°C，光照强度60001uX，从瓶口插入一直径4毫米的塑料管，塑料管另一端连接空气压缩机，充气培养，充入混合气体，气体成分=空气90% +纯C0210%，连续不间断充气，气量不宜太大，以让藻细胞浮起不下沉即可，光暗周期=14h/L+10h/D，即提供间歇光，14小时光照，10小时黑暗；连续培养7天； 步骤3)更换培养液培养至第8天，藻细胞密度可达每毫升90万，停止培养，从瓶口拔出充气管，用离心机离心采收藻细胞，离心机转速每分钟3600转，离心4分钟，可得牙膏状粘稠的藻泥，将此藻泥转入另一 3000毫升的干净的三角烧瓶中，加入步骤I所述的2号培养液1800毫升，报纸和橡皮筋封口，继续充气培养，充气方式和气量大小同步骤2 ;调节温度至28°C，光照强度90001uX，连续培养至第10天，从第11天开始，温度调至30°C，光照强度调至12000lux，连续培养2天，从第13天开始，温度调至32°C，光照调至15000Iux ； 步骤4)藻细胞采收 至第15天，藻液呈砖红色，停止充气和培养，离心机采收藻细胞，离心机转速每分钟5400转，离心5分钟，得沉淀物，弃上清液，采收完毕。
【文档编号】C12P23/00GK104450849SQ201410680311
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】王培磊 申请人:临沂大学