一种耐辐射镰孢霉菌及在吸附铯生物处理中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐辐射镰孢霉菌及其在放射性核素铯吸附中应用，通过提供一种自筛选的耐辐射镰孢菌（ Fusariumsp .）F54CGMCCNo.8359及其应用，通过试验证明该耐辐射镰孢菌（ Fusariumsp .）F54CGMCCNo.8359菌种对多种金属具有耐受性，其中对Pb2+、Zn2+、Ni+的耐受浓度最大，分别可达1000mg/L、500mg/L和500mg/L；对Co2+、Cr2+、Hg2+的耐受性次之，都可达200mg/L。同时菌株在放射性核素铯吸附中应用获得显著明显的技术效果，从而证明了该菌种在吸附铯生物处理中具有良好的应用前景。CGMCC No835920131022
【专利说明】一种耐辐射镰孢霉菌及在吸附铯生物处理中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物菌种应用于生物吸附放射性核素【技术领域】，具体的，本发 明涉及一种耐辐射镰孢霉菌及其在放射性核素铯吸附中应用的【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 城市化、工业化及人口增长造成全球性能源危机，可持续发展需求使得人类越来 越依赖于新能源。核能以其极低的二氧化碳排放和巨大的发展潜力而越来越受到众多国家 的重视。核能高速发展的同时，也给全球环境造成巨大的压力，使放射性污染成为当前重大 的环境问题之一，特别是以切尔诺贝利和日本福岛核电站为代表的核事故向环境释放了大 量的放射性，造成当地及周边环境严重的放射性污染，对生态环境和人类健康造成长期巨 大的潜在威胁。
[0003] 作为生态系统的重要组成部分，微生物种群数量大、分布广、比表面积大、繁殖快， 对环境变化的适应能力强，对放射性辐射表现出高度的耐受性。利用生物作用清除、修复和 治理放射性污染具有选择性强、处理时间短、成本低，不造成二次污染和不破坏生态环境等 优点，近年来已成为放射性污染治理的热点研究技术之一。
[0004] 铯137(mCs)是重要的裂变产物之一，也是核弹、核武器试验和核反应堆内核裂 变的副产品之一，其半衰期较长，具有较高的迁移性，易通过生物链转移造成辐射危害，它 会释放伽玛射线，在环境放射性污染修复中备受关注。铯137的半衰期较长达30年，会在 环境或生态系统中存留、积累和迁移，造成严重的环境污染和生态危害。如果透过进食或呼 吸，摄入了铯137,或受到沉降在地面上的铯137所照射，都会对身体有较持久的影响。
[0005] 在治理放射性环境污染方面，传统方法是工程法、化学法。工程法是物理性地收集 和隔离放射性物质的方法，化学法是采用特殊的化学品来固定和清除放射性污染。上述方 法虽然已得到成功的应用，如日本的广岛和长崎两个城市、马绍尔群岛共和国的比基尼环 礁核试验场和澳大利亚的马拉林加核试验场的修复与重建，但其成本很高，难以用于大面 积辐射区的修复，因此，工程与化学的方法局限性很大。生物修复是利用特殊的生物富集和 固定放射性污染物的方法，主要是微生物和植物，特别是微生物功能利用最受关注，因其 成本低，适合于大面积修复，因而生物修复放射性污染成为当前研究的热点。
[0006] 研究表明：微生物不仅可通过溶解和沉淀、生物吸附和吸收、氧化还原等作用来治 理环境中的放射性核素污染，并且可以通过改变植物根际微环境，从而提高植物对重金 属离子和放射性核素的吸收、挥发或固定的效率。相关的研究也取得了积极进展，如Jana Sitte等研究证明放射性核素铀（U)在土壤中的迁移率受环境中微生物及环境因子的影 响，ifcrMart/i研究表明Fe(III)还原菌的增生有利于包括U在内的重金属离 子由土壤向地下水迁移。?和ftiforee/s等的研究表明，细菌菌群可促使可溶态 U (VI)向稳定的U (IV)转化，等研究显示硫酸盐还原菌可固定U， 等分离获得可大量积累iCs、2?24^!!等放射性核素的微生物菌株，Hu等的研究表明 许多微生物都能吸附 U，如和 cererisiae。Entry等研究发现施用AM菌根菌可促进行植物对mCs^Sr 的积累，希瓦氏菌MR-I，可以有效将可溶性浐、Cr21和Tcli还原为不溶性U气Cr 21和Tc41。
[0007] 利用微生物修复放射性环境污染已经有成功的例子，Groudev在2001年利用土著 微生物对保加利亚南部含有放射性元素铀、镭和钍同重金属铜、镉和铅污染土壤，进行原位 修复，经过8个月的时间，污染物的水平下降到人体安全范围。
[0008] 利用微生物修复放射性的污染环境必须考虑到以下两个方面：第一，必须是强耐 辐射的微生物；第二，微生物修复环境时不能威胁到公共安全，也不能产生二次污染。由 于大多数的细菌对放射性比较敏感，因此它们修复放射性污染环境的能力会受到较大的限 制。因此，需要从自然环境中去分离具有辐射抗性的微生物，或者通过基因工程技术来改造 一些微生物使之获得辐射抗性。目前尚无有关耐辐射镰孢霉菌及其在放射性核素吸附中应 用的报导。
【发明内容】
[0009] 针对目前国内外尚无关于镰孢菌及其在放射性核素吸附中应用的相关报道，特 别是没有耐辐射镰孢霉菌在铯生物处理中的应用相关报道。本发明目的旨在于提供一 种耐辐射镰孢霉菌及在吸附放射性铯生物处理中的应用，特别是本发明提供一种镰孢菌 5/7. )F54 CGMCC No. 8359在吸附铯生物处理中的应用。
[0010] 本发明采用的主要技术方案： 本发明从新疆某地辐射污染环境中取样，以不同的培养温度、PH值、培养基为富集条 件，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出一株编号为F54的菌株，经过微生物菌 种的生理生化特性、菌落形态、菌种的分子水平等系列试验验证确定，该菌种是一种耐辐射 镰孢菌5/7. )F54,经菌种指定保藏机构保藏，保藏号为CGMCC No. 8359,利用该菌 种在放射性铯生物处理中应用。通过试验证明该耐福射镰孢菌5/7. ) F54 CGMCC No. 8359菌种对多种金属具有耐受性，其中对Pb2+、Zn 2+、Ni+的耐受浓度最大，分别可达1000 mg/L、500 mg/L 和 500 mg/L;对 Co2+、Cr2+、Hg2+的耐受性次之，都可达 200 mg/L。同时菌 株在放射性核素铯吸附中应用获得显著明显的技术效果，从而证明了该菌种在吸附铯生物 处理中具有良好的的应用前景。
[0011] 本发明具体提供一种利用耐福射镰孢菌(/7W1Sariiffl? 5/7. ) F54 CGMCC No. 8359及 在吸附放射性铯生物处理中的应用。本发明所使用的耐福射镰孢菌5/7.)由新 疆农业科学院微生物应用研究所从新疆某地放射性污染土壤中取样分离，以不同的培养温 度、PH值、培养基为富集条件，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出一株编号为 F54的菌株保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心（CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所，邮编：1〇〇1〇1，保藏日期为2013年10月22日，菌种保藏号为CGMCC No. 8359,该菌 株培养温度28-30°C，最适培养温度28°C左右；该菌种生长于PDA培养基（马铃薯200g、葡 萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水1L，pH自然)，经28°C、48h培养，F54初生菌落白色，绒毛状，生长 繁茂。4天后呈灰白色荔肉白色，背面蛘肉白色。在培养基表面逐渐形成丝束交织的厚膜， 高低不平呈点片状，用接种针不易挑下。显微镜下菌丝分隔，老菌丝内有许多球形孢子。6 天后气丝顶端开始膨大成形状不规整的孢囊，囊内有许多大小不一的孢子，孢囊无囊轴，无 外壁及囊被。根据以上形态特征，初步鉴定该菌株为半知菌纲丛梗孢目瘤座孢科鲜色多孢 族镰孢霉属的一个种。参照《真菌鉴定手册》进行鉴定，结合对F54菌株进行形态学、生理 生化鉴定，命名为镰孢5/7.)，是一种耐福射镰孢霉菌5/7.)。
[0012] 经biolog实验，该菌株可利用N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺，核糖醇，杏苷，L-阿拉 伯糖，D-阿拉伯醇，熊果苷，D-纤维二糖，糊精，D果糖，D-半乳糖，龙胆二糖，D-葡萄糖胺， a-D-葡萄糖，a-D-葡萄糖-1-磷酸盐，D-葡萄醛酸，丙三醇，肝糖，纤维醇，2-酮-D-葡萄 糖酸，a-D-乳糖，麦芽糖醇，麦芽糖，麦芽三糖，D-甘露醇，D苷露糖，D-松三糖，D-蜜二糖， a-甲基-D-半乳糖苷，β-甲基-D-半乳糖苷，a-甲基-D-葡萄糖苷，β-甲基-D-葡萄糖 苷，6-0-D-吡喃葡萄糖酰-D-呋喃果糖，D-蜜三糖，L-鼠李糖，D-核糖，水杨苷，D-山梨 醇，L-山梨糖，水苏糖，蔗糖，D-海藻糖，松二糖，木糖醇，D-木糖，Y-氨基丁酸，溴代琥珀 酸，反丁烯二酸，β-羟基丁酸，Y-羟基丁酸，P-羟苯乙酸，a-酮戊二酸，D-乳酸甲基酯， L-乳酸，D-苹果酸，苹果酸，奎尼酸，D-葡萄糖二酸，琥珀酸，琥珀酸甲基酯，L-丙胺酸酰 胺，L-丙胺酸，L-丙胺酰氨基乙酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，甘氨酰-L-谷氨 酸，鸟氨酸，L-苯基柄氨酸，脯氨酸，焦谷氨酸，L-丝氨酸，L-苏胺酸，2-氨基乙醇，腐苷，腺 苷，尿苷，腺苷 _5磷酸盐。
[0013] 本发明通过总DNA的提取、ITS序列的PCR扩增和测序，根据测序结果，用Blast 搜索软件从GenBank、EMBL等数据库中调出相似性较高的相关菌株的ITS基因序列，用 Clustal X 2.0进行多序列比对，用MEGA 5.0软件选取Saitou和Nei的邻接法(yVfcigAAor 进行系统进化树的构建和同源性比较。经测定，镰孢菌(/7W1Sariiffl? 577. )F54 CGMCC No. 8359的ITS基因序列长度为442bp。通过上述结果及ITS基因同源分析、系统 发育分析结果，将纯化的菌株镰孢菌沙.）F54 CGMCC No. 8359进行系统进化 树的构建及多样性分析，菌种编号为F54与ATCC MYA-3931 同源性最高，将菌种编号为F54菌株鉴定为镰孢菌577.)。将增殖培养的镰孢 菌謂5/7. )F54 CGMCC No. 8359 接种于 PDA 培养基中（添加 CsCl 终浓度 20mg/L)， 180-200rpm、28°C、培养70h，以达到吸附溶液中铯离子的目的，最大去除率达到80%以上。
[0014] 同时，本发明具体提供一种利用耐福射镰孢菌5/7. ) F54 CGMCC No. 8359进行放射性铯生物处理中应用技术方案： 本发明所用的菌株键抱菌(/^Asariurn 5/?. ) F54 CGMCC No. 8359 对于 Ni+, Cr2+'、Zn2+、 Co2+、Pb2+、Hg2+六种离子均具有耐受特性，其中对Pb 2+、Zn 2+、Ni+的耐受浓度最大，分别可 达 1000 mg/L、500 mg/L 和 500 mg/L;对 Co2+、Cr2+、Hg2+的耐受性次之，都可达 200 mg/L。 同时在放射性核素铯吸附中应用获得显著明显的技术效果，从而证明了该菌种在吸附铯生 物处理中具有良好的的应用前景。
[0015] 本发明进而提供耐福射镰孢菌(/7W1Sariiffl? 5/7. )F54 CGMCC No. 8359的分离和培养 方法。
[0016] 1.分离培养基采用：PDA培养基为马铃薯200g，葡萄糖20g，pH自然。
[0017] 2.分离和筛选条件：采取梯度稀释法，称取IOg 土壤样品于90mL无菌生理盐水 中，30° C活化30min后进行梯度稀释，选取10-2、10-3、10-4稀释液分别涂布于分离培养 基PDA培养基平板，每个处理3个重复，置28° C培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色 等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。经培养筛选确定的耐辐射镰孢 菌斤118&1^111118?.)?54 061〇：此.8359在？04培养基初生菌落白色，绒毛状，生长繁茂。4 天后呈灰白色荔肉白色，背面蛘肉白色。在培养基表面逐渐形成丝束交织的厚膜，高低不平 呈点片状，用接种针不易挑下。显微镜下菌丝分隔，老菌丝内有许多球形孢子。6天后气丝 顶端开始膨大成形状不规整的孢囊，囊内有许多大小不一的孢子，孢囊无囊轴，无外壁及囊 被。利用biolog实验，发现该菌可利用N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺，核糖醇，杏苷，L-阿拉 伯糖，D-阿拉伯醇，熊果苷，D-纤维二糖，糊精，D果糖，D-半乳糖，龙胆二糖，D-葡萄糖胺， a-D-葡萄糖，a-D-葡萄糖-1-磷酸盐，D-葡萄醛酸，丙三醇，肝糖，纤维醇，2-酮-D-葡萄 糖酸，a-D-乳糖，麦芽糖醇，麦芽糖，麦芽三糖，D-甘露醇，D苷露糖，D-松三糖，D-蜜二糖， a-甲基-D-半乳糖苷，β-甲基-D-半乳糖苷，a-甲基-D-葡萄糖苷，β-甲基-D-葡萄糖 苷，6-0-D-吡喃葡萄糖酰-D-呋喃果糖，D-蜜三糖，L-鼠李糖，D-核糖，水杨苷，D-山梨 醇，L-山梨糖，水苏糖，蔗糖，D-海藻糖，松二糖，木糖醇，D-木糖，Y-氨基丁酸，溴代琥珀 酸，反丁烯二酸，β-羟基丁酸，Y-羟基丁酸，P-羟苯乙酸，a-酮戊二酸，D-乳酸甲基酯， L-乳酸，D-苹果酸，苹果酸，奎尼酸，D-葡萄糖二酸，琥珀酸，琥珀酸甲基酯，L-丙胺酸酰 胺，L-丙胺酸，L-丙胺酰氨基乙酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，甘氨酰-L-谷氨 酸，鸟氨酸，L-苯基柄氨酸，脯氨酸，焦谷氨酸，L-丝氨酸，L-苏胺酸，2-氨基乙醇，腐苷，腺 苷，尿苷，腺苷 _5' -磷酸盐。
[0018] 通过实施本发明具体的技术指标，实现本
【发明内容】
，可以达到以下有益效果： 本发明提供的耐辐射镰孢菌（Fusarium sp. )F54 CGMCC No. 8359及其在铯吸附中的 应用，对对于Ni+、Cr2+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Hg2+六种离子均具有耐受特性，其中对Pb2+、 2112+、附+的耐受浓度最大，分别可达100〇11^/1、50〇11^/1和50〇11^/1;对(：〇2+、02+、 Hg2+的耐受性次之，都可达200 mg/L。通过本法可以利用菌体的生长吸附稳定性铯和放射 性铯。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图 1 所示为镰孢菌5/7. ) F54 CGMCC No. 8359 水压片图。
[0020] 图2所示为镰孢菌5/7. ) F54 CGMCC No. 8359系统发育树状图。
[0021] 图 3 所示为镰孢菌5/7. ) F54 CGMCC No. 8359 在 20mg/L Cs+压力下生 长曲线及吸附特性图。
[0022] 图4所示为pH对镰孢菌5/7. )F54 CGMCC No. 8359生长吸附Cs+的影 响图。
[0023] 图5所示为不同金属离子对镰孢菌(/7W1Sariiffl? 5/7. )F54 CGMCC No. 8359生长吸附 Cs+影响图。
[0024] 图6所示为不同菌体量对镰孢菌5/7. )F54 CGMCC No. 8359吸附Cs+的 影响图。
[0025] 图7所示为吸附时间对镰孢菌5/7. ) F54 CGMCC No. 8359菌体吸附Cs+ 的影响图。
[0026] 图8所示为温度对镰孢菌(/7W1Sariiffl? 5/7. )F54 CGMCC No. 8359菌体吸附Cs+的影 响图。
[0027] 图9所示为镰孢菌沙.）F54 CGMCC No. 8359对稳定铯和放射性铯的吸 附图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例进一步阐明本发明，当然，这些实施例仅用于说明本发明，而 不用于限制本发明要求保护的范围。
[0029] 本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备： 培养基选用：PDA培养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水lL，pH自然。
[0030] 主要仪器与试剂：MSSPX-250型生化培养箱，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，SW-CJ-IF B型单人双面净化工作台，E360K离心机，恒温摇床HWY-KKLPCR仪Eppendorf No:5345,电 泳仪 Bio-Rad Mode 200/2.0,凝胶成像仪 United-Bio, GK-330C plus，PCR 预混液（TaKaRa Biotechnology),其余试剂均为分析纯。超声波破碎仪为美国Sonics，VC130。Xseries II 型电感耦合等离子体质谱（ICP-MS)，美国THERMO公司；Seven Easy Plus S20P型精密pH 计，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学 仪器有限公司；THZ-82气浴恒温振荡箱，江苏金坛诚辉仪器厂；GMSX-280压力蒸汽灭菌器， 北京永光明医疗仪器有限公司。试剂均为分析纯，水为超纯水，18.2 ΜΩ ?cm。
[0031] 本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实 施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0032] 实施例一：鎌抱菌5/7. ) F54 CGMCC No. 8359 的分离、培养 1.分离 本发明所使用的耐辐射镰孢菌5/7.)由新疆农业科学院微生物应用研究所 从新疆某地放射性污染土壤中取样分离，利用传统的平板培养法分离出土层中的微生物， 平板划线法纯化菌株，以不同的培养温度、PH值、培养基为富集条件，筛选出一批生长良好 的微生物菌株，从中优选出一株编号为F54的菌株。
[0033] 分离步骤：依据梯度稀释法，称取IOg 土壤样品于90mL无菌生理盐水中，30° C活 化30min后进行梯度稀释，选取10=2、ΙΟ=、IO=4稀释液分别涂布于PDA培养基的平板，每个处 理3个重复，置28° C培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接 种于新的分离培养基PDA培养基，直至无杂菌落。将纯化后的菌株一部分采用冻干安瓿管、 甘油管和液氮等方式保藏，一部分保存于4° C直接用于后续研究。
[0034] 2.培养条件 将纯化的菌株镰孢菌5/7. )F54接种到马铃薯固体培养基斜面上，于28°C培 养2天，放入4°C冰箱中保存备用。
[0035] 具体的：该菌株培养温度28-30°C，最适培养温度28°C左右；该菌种生长于PDA培 养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水lL，pH自然，经28°C、48h培养。
[0036] 本发明所使用的镰抱菌(/^sarium 5/7. )F54由新疆农业科学院微生物应用研究所 从新疆某地放射性污染土壤中取样筛选分离获得，该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国 际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)保藏，地址：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为2013年 10月22日'菌种保藏号为CGMCC No. 8359,该菌株培养温度28-30°C，最适培养温度28°C左 右；该菌种生长于PDA培养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水IL，pH自然， 经28°C、48h培养，菌种F54初生菌落白色，绒毛状，生长繁茂。4天后呈灰白色荔肉白色，背 面蛘肉白色。在培养基表面逐渐形成丝束交织的厚膜，高低不平呈点片状，用接种针不易挑 下。显微镜下菌丝分隔，老菌丝内有许多球形孢子。6天后气丝顶端开始膨大成形状不规整 的孢囊，囊内有许多大小不一的孢子，孢囊无囊轴，无外壁及囊被。参见附图1。根据以上形 态特征，初步鉴定该菌株为半知菌纲丛梗孢目瘤座孢科鲜色多孢族镰孢霉属的一个种。参 照《真菌鉴定手册》（菌种初步鉴定依据的参考书）进行鉴定，结合对F54菌株进行形态学、 生理生化分析，鉴定为镰孢菌5/7.)，经过性能、菌落形态菌种属性等因素分析， 该菌种镰孢菌5/7. ) F54是一种耐福射镰孢霉菌(/7W1Sari-- 5/7.)。
[0037] 菌株镰孢菌(/7W1Sariiffl? 5/7. ) F54的生理生化指标结果见表1。
[0038] 表1 :温度、pH等因素对菌株F54生长的影响 3.菌种描述：本发明所述的耐福射镰孢菌
【权利要求】
1. 一种耐福射镰孢菌5/7. ) F54,其特征在于，所述的耐福射镰孢菌 即.）F54 的保藏编号为 CGMCC No. 8359。
2. 如权利要求1所述的耐福射镰孢菌577. )F54在吸附铯生物处理中的应 用。
【文档编号】C12R1/77GK104403951SQ201410688785
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】张丽娟, 王玮, 张志东, 谢玉清, 韩小元, 赖成霞, 唐琦勇, 朱静, 楚敏 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所