一种利用d-乳糖醇实现重组蛋白高效诱导表达的方法
【专利摘要】一种利用D-乳糖醇代替IPTG实现重组蛋白高效诱导表达的方法，属于基因工程药物制备【技术领域】。其是取活化及扩培后的果糖苷酶工程菌的菌液按2～5％(v/v)的接菌量接种接种于LB液体培养基，37℃，180～220r/min过夜培养；当菌液的紫外吸光值OD600为0.3～0.5时，添加诱导剂D-乳糖醇，使D-乳糖醇的终浓度为0.4～1.4mmol/L，然后在32～40℃条件下诱导3～8h，从而实现重组蛋白的高效诱导表达。实验表明D-乳糖醇为诱导剂与IPTG诱导效果无差异，D-乳糖醇为食品添加剂，无毒性，不被菌体降解，不需多次添加，因此乳糖醇可以代替IPTG作为以Lac为启动子的基因工程重组蛋白的理想诱导剂。
【专利说明】一种利用D-乳糖醇实现重组蛋白高效诱导表达的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程药物制备【技术领域】，具体涉及一种利用D-乳糖醇代替IPTG实现重组蛋白高效诱导表达的方法。
【背景技术】
[0002]乳糖操纵子作为一种可诱导的负调控型操纵子，是目前研究的最为详尽的基因操纵子，已被广泛应用于大肠杆菌工程菌株的构建中。IPTG (异丙基-β-D巯基半乳糖苷)诱导条件简单，是一种高效的乳糖(Iac)及其衍生物的启动子诱导剂，是β_半乳糖苷酶的活性诱导物质，可以直接进入大肠杆菌细胞内部发挥诱导作用，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，它是一种非代谢性的诱导物，不会被菌体所消耗，只需要极少量的存在就能稳定地诱导乳糖启动子的转录。但其具有潜在的毒性，对菌体生长有一定的抑制作用，且价格较昂贵。
[0003]乳糖是一种二糖，作为原核细胞的常用碳源，是乳糖操纵子控制的细菌自身系列酶的天然底物，对乳糖操纵子具有天然的诱导作用，且价廉易得、无毒无害；但由于乳糖可以被细胞作为碳源代谢利用，其浓度是动态变化的，需要不断向培养基中添加乳糖。其诱导机制比IPTG更为复杂，需要借助于乳糖透过酶(Permase)的作用进入细胞，然后经过β_半乳糖苷酶的作用转化为异乳糖(Allolactose)才能起到诱导剂的作用，诱导条件不易掌握，同IPTG相比，乳糖作为诱导剂对于乳糖操纵子的诱导调控过程更为复杂。
[0004]乳糖醇(4-0-13_D-吡喃半乳糖基-D-葡糖醇)是一种保健型甜味剂，在自然界中并不存在，它是以乳糖为原料，经还原反应后精制纯化而得，可用作食品添加剂，而乳糖醇具有同IPTG相似的化学结构，极易溶于水，微溶于乙醇，且稳定性较强，在酸，碱，光及高温条件下仍能保持稳定性，安全性较高也可作为诱导剂，且无毒无害不被菌体所替代。乳糖醇所具有的价廉易得，无毒高效的特点，使得利用D-乳糖醇代替IPTG作为诱导剂的研究，对于各种利用原核表达系统进行重组蛋白的大规模生产，具有十分重要的现实意义和应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足之处，提供一种利用D-乳糖醇代替IPTG实现重组蛋白高效诱导表达的方法。
[0006]本发明所述的一种利用D-乳糖醇代替IPTG实现重组蛋白高效诱导表达的方法，其步骤如下:
[0007](I)取活化及扩培后的果糖苷酶工程菌的菌液按2?5% (v/v)的接菌量接种接种于LB液体培养基，370C，180?220r/min过夜培养；
[0008](2)当菌液的紫外吸光值0D_为0.3?0.5时，添加诱导剂D-乳糖醇(阿拉丁，4-0- β -D-吡喃半乳糖基-D-葡糖醇)，使D-乳糖醇的终浓度为0.4?1.4mmol/L,然后在32?40°C条件下诱导3?8h，从而实现重组蛋白的高效诱导表达。上述方法中所述的活化及扩培后的果糖苷酶工程菌的菌液，由如下步骤制备得到:
[0009](I)果糖苷酶工程菌(Escherchia.coil BL21 (DE3)(革兰氏阴性球菌))的构建:
[0010]此工程菌参照NCBI数据库中公布的Thermotoga neapolitanaDSM4359中的果糖苷酶基因序列GeneID:7378529，利用PrimerPremier5.0软件设计I对引物用于扩增果糖苷酶基因:
[0011]PI: CGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGTTCAAACCCCACTACCAC(NheI)；
[0012]P2:TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTCAAGAAATCCATACG(EcorI)。
[0013]引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
[0014]按照细菌基因组DNA提取试剂盒(百泰克)说明书提取Thermotoga neapolitanaDSM4359基因组DNA，以提取的DNA为模板，用引物Pl和P2进行扩增。反应程序为:94°C预变性3min ;94°C变性45s、55°C退火35s、72°C延伸90s，30个循环；72°C延伸lOmin，反应完成后PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。然后将含有目的基因的PCR产物参照柱式DNA胶回收试剂盒说明书(上海生工)进行纯化回收1305bp处条带。用限制性内切酶NheI和EcorI对回收产物进行双酶切处理，之后通过1.0 %的琼脂糖凝胶电泳对双酶切产物进行比较并切胶回收双酶切产物。酶切条件为:8 μ L纯化的PCR产物加入IyL Nhe 1、I μ L EcorI,2 μ L缓冲液、8 μ L去离子水，混合37°C下保温12小时，进行2 %的琼脂糖凝胶电泳。对表达载体pET-28a(+)质粒做上述同样的处理并切胶回收双酶切产物中的大条带产物。混合目的基因片段和pET-28a(+)质粒，加入T4DNA连接酶(TaKaRa)，16°C过夜连接。连接反应体系如下:10X 连接BufferlμL、回收的目的基因4μL、pET28a⑴表达载体I μ L、T4DNA连接酶0.4 μ L，加水补足至10 μ L，将上述试剂冰浴加入无菌PCR管中，小心混匀，瞬间离心后，16°C过夜连接。连接产物转化入Escherchia.coil BL21(DE3)感受态细胞。挑取数个菌落分别接种于5mL含卡那霉素(Kan) 10 μ g/mL的LB液体培养基中，37°C过夜震荡培养。提取重组质粒进行酶切和测序鉴定。测序由上海生工生物工程技术有限公司完成。将得到的转化入带有果糖苷酶基因的pET_28a(+)的液态阳性工程菌Escherchia.coil BL21(DE3)(革兰氏阴性球菌)-80°C保存备用。
[0015](2)果糖苷酶工程菌的活化及扩培:取-801:保存的工程菌在含1^11(10 μ g/mL)的LB固体培养基(LB液体培养基加入1.5% (m/v)琼脂粉)划线，37°C恒温箱过夜培养。然后挑经活化的工程菌单菌落接种到LB液体培养基，200?300r/min，37°C过夜培养，从而得到经扩培后的菌液。
[0016]本发明的优点在于:
[0017](I)本发明成功运用D-乳糖醇代替IPTG作为诱导剂诱导目的蛋白的表达。
[0018](2)本发明的目的蛋白表达水平高，目的蛋白的表达量与IPTG诱导蛋白量相当。
[0019](3)本发明除了可以诱导果糖苷酶外，还能诱导所有带有Lac启动子的载体工程菌所表达的目的蛋白。
[0020](4)本发明所述的发酵方法简便，发酵时间短，生产成本低，此外，无IPTG存在，无毒，后处理简单。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1:D_乳糖醇在不同浓度下对果糖苷酶诱导表达的影响曲线。
[0022]图2:D-乳糖醇在不同时间下对果糖苷酶诱导表达的影响曲线。
[0023]图3:D-乳糖醇在不同温度下对果糖苷酶诱导表达的影响曲线。
[0024]图4 =IPTG和D-乳糖醇对果糖苷酶活力的影响效果示意图。D-乳糖醇的诱导浓度为1.0mmol/L，诱导时间为5h，诱导温度为36°C ；IPTG的诱导浓度为0.8mmol/L，诱导时间为6h,诱导温度为30°C。
[0025]图5:D_乳糖醇在不同温度和IPTG诱导后的蛋白表达情况示意图:条带1:D_乳糖醇浓度为l.0mmol/L，时间5h，32°C下诱导；条带2:D_乳糖醇浓度为l.0mmol/L，时间5h,34°C下诱导；条带3:D-乳糖醇浓度为1.0mmol/L,时间5h, 36°C下诱导；条带4:D_乳糖醇浓度为1.0mmol/L,时间5h,38°C下诱导；条带5:D-乳糖醇浓度为1.0mmol/L,时间5h,40°C下诱导；条带6 =IPTG浓度为0.8mmol/L,时间6h，30°C下诱导；条带7:D-乳糖醇浓度为1.0mmol/L,时间5h,36°C下诱导；条带8:未添加诱导剂。
[0026]图6:Thermotoga neapolitana DSM4359中的果糖苷酶基因PCR产物电泳图:条带
I为PCR产物，1305bp为目的条带。
[0027]由图1可以看出，D-乳糖醇浓度在0.4?1.0mmol/L范围内，酶活力随浓度的增加而不断增加，1.0mmol/L时酶活百分比最大，当浓度继续增大时,酶活力下降,所以确定D-乳糖醇的最佳诱导浓度为1.0mmol/L ；
[0028]由图2可以看出，D-乳糖醇在诱导时间3?5h范围内，酶活力随时间的增加而不断增加，5h时酶活百分比最大，当时间继续增加时，酶活力下降，所以确定D-乳糖醇的最佳诱导时间为5h ；
[0029]由图3可以看出，D-乳糖醇在诱导温度30?36°C范围内，酶活力随温度的增加而不断增加，36°C时酶百分比最大，当温度继续增加时，酶活力下降，所以确定D-乳糖醇的最佳诱导温度为36°C。
[0030]由图4可以看出，D-乳糖醇在诱导浓度为1.0mmol/L，诱导时间为5h，诱导温度为36°C与IPTG在诱导浓度为0.8mmol/L，诱导时间为6h，诱导温度为30°C诱导的酶活百分比无差异。
[0031]由图5可以看出，D-乳糖醇诱导浓度为1.0mmol/L，诱导时间为5h，分别在32°C、34°〇、361:、381:、401:诱导时，361:时相对较好(条带1-5);同时用IPTG在诱导浓度为
0.8mmol/L，诱导时间6h，诱导温度30°C下诱导与D-乳糖醇在诱导浓度为1.0mmol/L，诱导时间为5h，诱导温度为36°C诱导相差不大(条带6、7)，未添加诱导剂的(条带8)。因此可以用D-乳糖醇替代IPTG作为以乳糖(Iac)及其衍生物启动子的基因工程重组蛋白的理想诱导剂。
[0032]由图6可以看出，Thermotoga neapolitana DSM4359中的果糖苷酶基因经PCR方法扩增成功。
【具体实施方式】
[0033]实施例1
[0034]菌种的活化及扩培:取经本发明构建的_80°C保存的果糖苷酶工程菌在LB固体培养基(Ig胰蛋白胨，0.5g酵母提取物，Ig NaCl，1.5g琼脂，加水补至10mL)划线活化，在37°C恒温箱过夜培养。然后挑活化后的单菌落到LB液体培养基(Ig胰蛋白胨，0.5g酵母提取物，Ig NaCl，加水补至10mL)，200r/min, 37°C恒温箱过夜扩大培养，培养后其OD6tltl值
2.0左右。
[0035]实施例2
[0036]工程菌最适诱导浓度的确定:取实施例1所述经37°C过夜扩培后的菌液，以2%(v/v)的接菌量接种到LB液体培养基，37°C培养，待菌体生长到OD6tltl为0.4时，分别加入不同浓度的D-乳糖醇，使其终浓度分别达到0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmoI/L、l.2mmol/L、l.4mmol/L, 32 °C下诱导6h。结果如图1所不，从而确定最佳诱导浓度为
1.0mmol /I,η
[0037]实施例3
[0038]工程菌最适诱导时间的确定:取实施例1所述经37°C过夜扩培后的菌液，以2%(v/v)的接菌量接种到LB液体培养基，37°C培养，待菌体生长到OD6tltl为0.4时，加入D-乳糖醇，使其终浓度为1.0_)1/1，分别诱导311、411、511、611、711、811，321:。结果如图2所示，从而确定最佳诱导时间为5h。
[0039]实施例4
[0040]工程菌最适诱导温度的确定:取实施例1所述经37°C过夜扩培后的菌液，以2%(v/v)的接菌量接种到LB液体培养基，37°C培养，待菌体生长到OD6tltl为0.4时，加入D-乳糖醇，使其终浓度为1.011111101/1，分别在321:、341:、361:、381:、401:下诱导511。结果如图3所示，从而确定最佳诱导温度为36°C。
[0041]实施例5
[0042]D-乳糖醇在诱导浓度为1.0mmol/L，诱导时间为5h，诱导温度为36°C与IPTG在诱导浓度为0.8mmol/L，诱导时间为6h，诱导温度为30°C诱导的酶活百分比无差异。结果如图4所示，所以可以用D-乳糖醇替代IPTG作为诱导剂。
[0043]实施例6
[0044]果糖苷酶活力测定
[0045]诱导后(分别采用实施例2、实施例3、实施例4产物进行酶活力测定)的菌液经7000r/min离心机离心，弃上清，取离心后菌体沉淀，经过3次反复冻融后，用pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解(0.3mol/L的乙酸200mL与0.2mol/L的乙酸钠200mL均匀混合)并超声波破碎，然后把经超声波破碎后的菌液离心取上清液，得粗酶液。制样的反应体系为:60 μ L的ρΗ5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、20 μ L的50mmol/L果糖底物和20 μ L粗酶液均匀混合，水浴2h。依据葡萄糖测定试剂盒(南京建成)测酶活，计算酶活百分比。
[0046]酶活百分比的计算方法:在实验条件下酶液催化果糖生成葡萄糖，经葡萄糖测定试剂盒得到的吸光度(A)，空白对照测定的吸光度值为(Atl),则相应酶活百分比为(A-Atl)/(A最大-A。)X 100%，结果如图5所示。
【权利要求】
1.一种利用D-乳糖醇代替IPTG实现重组蛋白高效诱导表达的方法，其步骤如下: (1)取活化及扩培后的果糖苷酶工程菌的菌液按2?5%(v/v)的接菌量接种接种于LB液体培养基，370C，180?220r/min过夜培养； (2)当菌液的紫外吸光值OD_为0.3?0.5时，添加诱导剂D-乳糖醇，使D-乳糖醇的终浓度为0.4?1.4mmol/L，然后在32?40°C条件下诱导3?8h，从而实现重组蛋白的高效诱导表达。
2.如权利要求1所述的一种利用D-乳糖醇代替IPTG实现重组蛋白高效诱导表达的方法，其特征在于:活化及扩培后的果糖苷酶工程菌的菌液由如下步骤制备得到， (1)果糖苷酶工程菌的构建: 参照NCBI数据库中公布的Thermotoga neapolitana DSM4359中的果糖苷酶基因序列GeneID:7378529，利用PrimerPremier5.0软件设计I对引物用于扩增果糖苷酶基因:
Pl:CGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGTTCAAACCCCACTACCAC(NheI)；
P2:TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTCAAGAAATCCATACG(EcorI)； 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取Thermotoga neapolitana DSM4359基因组DNA，以提取的DNA为模板，用引物Pl和P2进行扩增；反应程序为:94°C预变性3min ；94°C变性45s、55°C退火35s、72°C延伸90s，30个循环；72°C延伸lOmin，反应完成后PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测；然后将含有目的基因的PCR产物参照柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行纯化回收1305bp处条带，用限制性内切酶NheI和EcorI对回收产物进行双酶切处理，之后通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳对双酶切产物进行比较并切胶回收双酶切产物；酶切条件为8 μ L纯化的PCR产物加入IyL Nhe IUuL Ecor1、2 μ L缓冲液、8 μ L去离子水，混合37°C下保温12小时，进行2%的琼脂糖凝胶电泳，对表达载体pET-28a(+)质粒做上述同样的处理并切胶回收双酶切产物中的大条带产物；混合目的基因片段和pET-28a(+)质粒，加入T4DNA连接酶(TaKaRa)，16°C过夜连接；连接反应体系为1X连接Buffer I μ L、回收的目的基因4 μ L、pET28a(+)表达载体I μ L、T4DNA连接酶0.4 μ L，加水补足至10 μ L，将上述试剂冰浴加入无菌PCR管中，小心混匀，瞬间离心后，16°C过夜连接；连接产物转化入Escherchia.coil BL21 (DE3)感受态细胞,挑取数个菌落分别接种于5mL含卡那霉素(Kan) 10 μ g/mL的LB液体培养基中，37°C过夜震荡培养；提取重组质粒进行酶切和测序鉴定，将得到的转化入带有果糖苷酶基因的pET-28a(+)的液态阳性工程菌Escherchia.coil BL21 (DE3))_80°C保存； (2)果糖苷酶工程菌的活化及扩培:取_80°C保存的工程菌在含Kan(10μ g/mL)的LB固体培养基划线，37°C恒温箱过夜培养，然后挑经活化的工程菌单菌落接种到LB液体培养基，200?300r/min，37°C过夜培养，从而得到经扩培后的菌液。
【文档编号】C12N1/21GK104357423SQ201410692025
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】毕云枫, 姜仁凤, 沈明浩, 徐琳琳, 陈萍 申请人:吉林农业大学