从西瓜皮中纯化谷氨酸脱羧酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从西瓜皮中纯化谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：(1)取西瓜皮500g，组织破碎仪破碎，磷酸缓冲液1000-2000mL，4℃过夜浸提；(2)四层纱布过滤；(3)4000rpm/min离心10-30min，得到谷氨酸脱羧酶粗提液；(4)调节谷氨酸脱羧酶粗提液透液体至6.0-7.0，葡聚糖凝胶阴离子交换柱纯化，50mM-300mM NaCl分段洗脱，收集200mM NaCl洗脱液；(5)200mM、250mM NaCl洗脱液脱盐，得到谷氨酸脱羧酶液体。本发明得到的谷氨酸脱羧酶酶液活性最高可达1000U/mL，酶液体体积可缩小至10-16mL。
【专利说明】从西瓜皮中纯化谷氨酸脱羧酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及从西瓜皮中纯化谷氨酸脱羧酶的方法，本发明还涉及一种生产γ-氨基丁酸的方法。
【背景技术】
[0002]γ -氨基丁酸(GABA)存在于哺乳动物脑、脊髓中，是一种抑制性神经传递物质，由谷氨酸脱羧酶(GAD)催化谷氨酸得到。GABA具有调节血压与心律、营养神经细胞、促进精神安定、促进脑部供血、促进长期记忆、促进激素分泌、肾功能活化等作用。
[0003]γ -氨基丁酸的生产基本采用化学合成、植物富集法和生物合成法。其中化学合成成本高且因使用有毒试剂，存在安全性差，且反应中间产物多，产物纯度难保证。生物合成法下游分离纯化难度高且难获得谷氨酸脱羧酶活性高的微生物菌株。植物富集法含量低，反应液天然成分复杂，同样存在纯化问题。
[0004]目前，筛选具有相对高活力的谷氨酸脱羧酶的微生物并扩大培养使其过量或高表达谷氨酸脱羧酶，进而催化谷氨酸底物生成γ -氨基丁酸，即酶催化方法。
[0005]西瓜皮广泛易获得，目前还没有文献报道从其中纯化高比活谷氨酸脱羧酶以用于催化反应。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种从西瓜皮中纯化谷氨酸脱羧酶的方法和生产γ-氨基丁酸的方法，解决现有技术中西瓜皮谷氨酸脱羧酶提取液比活低、体积大、难保存、难商业化的问题，为西瓜皮二次利用提供新的技术方案。
[0007]本发明所采用的技术方案为:
[0008]从西瓜皮中纯化谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤:(I)取西瓜皮500g，4°C pH5.5-7.0的50-100mM磷酸缓冲液1000_2000mL，组织破碎仪破碎，4 °C过夜浸提；(2)四层纱布过滤；(3)4000rpm/min离心10_30min，得到谷氨酸脱羧酶粗提液；(4)调节谷氨酸脱羧酶粗提液透液体至6.0-7.0，葡聚糖凝胶阴离子交换柱纯化，50mM、100mM、200mM、250mM、300mM NaCl分段洗脱，收集200mM NaCl洗脱液；(5) 200mM NaCl洗脱液脱盐，得到谷氨酸脱羧酶液体。
[0009]优选的，葡聚糖凝胶阴离子交换柱平衡液的为pH6.0，离子强度为50mM的磷酸缓冲液。
[0010]优选的，葡聚糖凝胶阴离子交换柱上样之前先用平衡液平衡10-20个柱体积。
[0011]优选的，葡聚糖凝胶阴离子交换柱纯化分段洗脱的NaCl浓度为50mM、75mM、100mM、200mM、250mMo
[0012]优选的，葡聚糖凝胶阴离子交换柱纯化分段洗脱的NaCl浓度为100mM、200mM、250mMo
[0013]本发明还提供从上述方法纯化得到的谷氨酸脱羧酶。
[0014]本发明还提供一种保存所述谷氨酸脱羧酶的保存液，包括:50mM磷酸缓冲液，pH5.5，5%聚乙二醇辛基苯基醚，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10mM NaCl,0.01% NaN3，50%甘油。
[0015]本发明还提供以一种利用上述方法纯化得到的谷氨酸脱羧酶产Y-氨基丁酸的方法，5-20mg/mL谷氨酸为底物，加入0.lg/L的维生素B6，反应ρΗ5.5，37°C反应30_60min，得到GABA产品。
[0016]谷氨酸脱羧酶酶活采用比色法测定，I个GAD活力单位(U)定义为:在37°C，pH5.5条件下，每分钟每毫升酶液中催化谷氨酸脱羧酶发生脱羧反应生成I ymol的GABA所需酶量。
[0017]目前还没有关于通过阴离子交换柱从西瓜皮中纯化谷氨酸脱羧酶的报道。本发明提取得到的谷氨酸脱羧酶酶液的活性高达1000U/mL，可利用此酶液生产GABA，谷氨酸转化率高达96%以上。
[0018]本发明的有益效果是:1、所得谷氨酸脱羧酶酶液活性非常高，可进一步商业利用；2、离子交换柱流速快，适合扩大生产，提高产量，为西瓜皮二次利用提供可能性。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。
[0020]实施例一
[0021]谷氨酸脱羧酶纯化方法
[0022]提取缓冲液配方:50mM磷酸缓冲液，pH5.5，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10%甘油。
[0023]葡聚糖凝胶阴离子交换柱平衡液配方:50mM磷酸缓冲液，pH5.5，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10%甘油，50mM NaCl。
[0024]葡聚糖凝胶阴离子交换柱分段洗脱液配方1:50mM磷酸缓冲液，pH5.5，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10%甘油，10mM NaCl。
[0025]葡聚糖凝胶阴离子交换柱分段洗脱液配方2:50mM磷酸缓冲液，pH5.5，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10%甘油，200mM NaCl。
[0026]葡聚糖凝胶阴离子交换柱分段洗脱液配方2:50mM磷酸缓冲液，pH5.5，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10%甘油，250mM NaCl。
[0027]葡聚糖凝胶阴离子交换柱分段洗脱液配方3:50mM磷酸缓冲液，pH5.5，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10%甘油，300mM NaCl。
[0028]透析液(即保存液)体配方:50mM磷酸缓冲液，ρΗ5.5,5% Triton X100，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10mM NaCl,0.01% NaN3，50%甘油。
[0029]纯化步骤:
[0030]谷氨酸脱羧酶粗提:(I)取西瓜皮500g，4 °C pH5.5的50_100mM磷酸缓冲液100mL,组织破碎仪破碎，4°C过夜浸提；(2)四层纱布过滤；(3) 4000rpm/min离心lOmin，得到谷氨酸脱羧酶粗提液；(4)调节谷氨酸脱羧酶粗提液调pH至5.5。
[0031]葡聚糖凝胶阴离子交换柱纯化:取葡聚糖凝胶sepharose CL4B50mL装柱，柱直径(内径)2.4CM ;葡聚糖凝胶阴离子交换柱平衡液平衡10-20个柱体积，流速5-10mL/min ;将pH为5.5的谷氨酸脱羧酶粗提液以5-6mL/min上样；平衡液平衡10个柱体积；50mM、100mM、200mM、250mM、300mM NaCl分段洗脱，分别收集洗脱液并测定酶活力大小。
[0032]5-20mg/mL谷氨酸为底物，加入0.lg/L的维生素B6，反应pH5.5，37 °C反应30-60min，得到 GABA 产品。
[0033]谷氨酸脱羧酶酶活测定方法:采用比色法测定；1个GAD活力单位⑶定义为:在37°C，pH5.5条件下，每分钟每毫升酶液中催化谷氨酸脱羧酶发生脱羧反应生成I ymol的GABA所需酶量。
[0034]比色法测得50mM、100mM、200mM、250mM、300mM NaCl分段洗脱洗脱液谷氨酸脱羧酶酶液活性为 0.5U/mL (洗脱液 20mL)，lU/mL (洗脱液 20mL)，1003U/mL (洗脱液 20mL)，10U/mL (洗脱液 20)、12U/mL (洗脱液 1mL)。
[0035]合并200mM、250mMNaCl分段洗脱洗脱液，截留分子量为8000-14000的透析袋透析10倍洗脱液体积透析2次，得到1mL高纯度高浓缩度谷氨酸脱羧酶酶液，-20°c低温保存。。
[0036]实施例二
[0037]谷氨酸脱羧酶纯化方法
[0038]提取缓冲液配方:50mM磷酸缓冲液，pH5.5，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10%甘油。
[0039]葡聚糖凝胶阴离子交换柱平衡液配方:50mM磷酸缓冲液，pH6.0，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10%甘油，50mM NaCl。
[0040]葡聚糖凝胶阴离子交换柱分段洗脱液配方1:50mM磷酸缓冲液，pH6.0，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10%甘油，10mM NaCl。
[0041]葡聚糖凝胶阴离子交换柱分段洗脱液配方2:50mM磷酸缓冲液，pH6.0，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10%甘油，200mM NaCl。
[0042]葡聚糖凝胶阴离子交换柱分段洗脱液配方2:50mM磷酸缓冲液，pH6.0，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10%甘油，250mM NaCl。
[0043]葡聚糖凝胶阴离子交换柱分段洗脱液配方3:50mM磷酸缓冲液，pH6.0，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10%甘油，300mM NaCl。
[0044]透析液体配方:50mM磷酸缓冲液，pH5.5，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10mM NaCl，50%甘油。
[0045]纯化步骤:
[0046]谷氨酸脱羧酶粗提:(I)取西瓜皮500g，4 °C pH6.0的50-100mM磷酸缓冲液100mL,组织破碎仪破碎，4°C过夜浸提；(2)四层纱布过滤；(3) 4000rpm/min离心lOmin，得到谷氨酸脱羧酶粗提液；(4)调节谷氨酸脱羧酶粗提液调pH至6.0。
[0047]葡聚糖凝胶阴离子交换柱纯化:取葡聚糖凝胶sepharose CL4B50mL装柱，柱直径(内径)2.4CM ;葡聚糖凝胶阴离子交换柱平衡液平衡10-20个柱体积，流速5-10mL/min ;将pH为6.0的谷氨酸脱羧酶粗提液以5-6mL/min上样；平衡液平衡10个柱体积；50mM、100mM、200mM、250mM、300mM NaCl分段洗脱，分别收集洗脱液并测定酶活力大小。
[0048]5-20mg/mL谷氨酸为底物，加入0.lg/L的维生素B6，反应pH5.5，37 °C反应30-60min，得到 GABA 产品。
[0049]谷氨酸脱羧酶酶活测定方法:采用比色法测定；1个GAD活力单位(U)定义为:在37°C，pH5.5条件下，每分钟每毫升酶液中催化谷氨酸脱羧酶发生脱羧反应生成I ymol的GABA所需酶量。
[0050]比色法测得50mM、100mM、200mM、250mM、300mM NaCl分段洗脱洗脱液谷氨酸脱羧酶酶液活性为 0.5U/mL (洗脱液 20mL)，lU/mL (洗脱液 20mL)，800U/mL (洗脱液 20mL)，964U/mL(洗脱液 20)、21U/mL(洗脱液 1mL)。
[0051]合并200mM、250mMNaCl分段洗脱洗脱液，截留分子量为8000-14000的透析袋透析10倍洗脱液体积透析2次，得到16mL高纯度高浓缩度谷氨酸脱羧酶酶液，_20°C低温保存。
[0052]实施例三
[0053]γ -氨基丁酸生产方法
[0054]取pH为5.5、浓度为10mg/mL谷氨酸溶液，取0.lg/L的维生素B6，取实施例I中的谷氨酸脱羧酶酶液，使谷氨酸脱羧酶酶液、谷氨酸底物、维生素B6的体积比为l:4000:2000o 37°C反应60min，煮沸灭活谷氨酸脱羧酶活性，比色法测定反应液中的GABA浓度为4.43mg/mL，谷氨酸的转化率为93.5%。
[0055]以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围。
【权利要求】
1.从西瓜皮中纯化谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)取西瓜皮500g，4°CpH5.5-7.0的50-100mM磷酸缓冲液1000-2000mL,组织破碎仪破碎，4 °C过夜浸提； (2)使用四层纱布过滤上述物质； (3)4000rpm/min离心10_30min，得到谷氨酸脱羧酶粗提液； (4)调节谷氨酸脱羧酶粗提液透液体至6.0-7.0，葡聚糖凝胶阴离子交换柱纯化，50mM-300mM NaCl 分段洗脱，收集 200mM、250mM NaCl 洗脱液； (5)200mM NaCl洗脱液脱盐，得到谷氨酸脱羧酶液体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，葡聚糖凝胶阴离子交换柱平衡液的pH为6.0，离子强度为50mM的磷酸缓冲液。
3.根据根据权利要求2所述的方法，其特征在于，葡聚糖凝胶阴离子交换柱上样之前先用平衡液平衡10-20个柱体积。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，葡聚糖凝胶阴离子交换柱纯化分段洗脱的 NaCl 浓度为 50mM、75mM、100mM、200mM、250mM。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，葡聚糖凝胶阴离子交换柱纯化分段洗脱的 NaCl 浓度为 100mM、200mM、250mM。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法从西瓜皮中纯化谷氨酸脱羧酶。
7.一种保存权利要求6所述谷氨酸脱羧酶的保存液，包括:50mM磷酸缓冲液，pH5.5，5%聚乙二醇辛基苯基醚，ImM 二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸二钠，10mM NaCl, 0.01%NaN3, 50% 甘油。
8.利用权利要求6所述的谷氨酸脱羧酶生产Y-氨基丁酸的方法，其特征在于，5-20mg/mL谷氨酸为底物，加入0.lg/L的维生素B6，反应pH为5.5，37°C反应30_60min，得到GABA产品。
【文档编号】C12N9/88GK104450658SQ201410707099
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】金京勋 申请人:苏州嘉禧萝生物科技有限公司