一种高效降解大豆异黄酮的中温中性β-葡萄糖苷酶HiBgl3B及其基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高效降解大豆异黄酮的中温中性β-葡萄糖苷酶HiBgl3B及其基因和应用。本发明提供了一种新的中温中性β-葡萄糖苷酶HiBgl3B，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述中温中性β-葡萄糖苷酶HiBgl3B的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明的中温中性β-葡萄糖苷酶最大特点在于其独特的底物特异性，其对于pNPG和染料木苷、黄豆苷具有识别能力和水解活性，但对天然底物龙胆二糖、纤维二糖和扁桃苷无活性，具有很好的研究和应用价值。
【专利说明】一种高效降解大豆异黄酮的中温中性β-葡萄糖苷酶 H i Bg 13Β及其基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高效降解大豆异黄酮的中温 中性β -葡萄糖苷酶HiBgl3B及其基因和应用。
【背景技术】
[0002] β -葡萄糖苷酶（beta-glucosidase, EC 3. 2. L 21)是纤维素酶系的一个重要组 成部分，特异性地从低聚寡糖链还原端水解下单个葡萄糖残基，是纤维素彻底降解为葡萄 糖的关键酶。同时，由于其能够有效地水解纤维二糖，消除产物积累对葡聚糖酶的抑制作 用，β-葡萄糖苷酶的水解作用也是纤维素降解过程的限速步骤。
[0003] β-葡萄糖苷酶在很多领域都有着广泛的应用。在工业上，随着生物乙醇作为新型 安全环保的替代能源受到日益重视，木质纤维素的降解也备受关注，极大地增加了能源工 业中对葡萄糖苷酶的需求。在食品行业，能够水解含有烷基和芳香基的葡萄糖苷键以 及低聚寡糖等，如将食物中的含有芳香环的糖苷类物质水解，释放出具有浓郁香味的芳香 族化合物，从而改善食品风味。在饲料和医药保健品行业中，β -葡萄糖苷酶能够高效水解 大豆异黄酮等天然糖苷，实现无生物活性的糖苷与有生物活性的苷元之间的生物转化，发 挥多种生物学功能。
[0004] β-葡萄糖苷酶来源广泛，在植物、动物、微生物中都有发现。现今微生物来源的 β -葡萄糖苷酶主要集中于丝状真菌，特别是曲霉属和木霉属，俨然成为工业用β -葡萄糖 苷酶的主要来源。本发明的β-葡萄糖苷酶HiBgl3B来源于嗜热真菌特异腐质霉，具有良 好的酶学性质，其最大特点在于其独特的底物特异性，其对于PNPG和染料木苷、黄豆苷具 有识别能力和水解活性，但对天然底物龙胆二糖、纤维二糖和扁桃苷无活性，具有很好的研 宄和应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种高效降解大豆异黄酮的中温中性β -葡萄糖苷酶。
[0006] 本发明的再一目的是提供编码上述β -葡萄糖苷酶的基因。
[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0009] 本发明的另一目的是提供一种制备上述β -葡萄糖苷酶的基因工程方法。
[0010] 本发明的另一目的提供上述β-葡萄糖苷酶的应用。
[0011] 本发明从腐质霉（Humicola insolens)中分离得到一种新的具有独特底物特异性 的中温中性β-葡萄糖苷酶HiBgl3B，并构建了能够高效表达此β-葡萄糖苷酶的重组酵母 菌株。
[0012] 本发明提供了一种中温中性β-葡萄糖苷酶HiBgl3B，其氨基碱序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] SEQ ID NO. I ：
[0014] MGHHTATVCLWLALGSLTPVSFARVVEPRDPVPQGYHAASYYPAPHGGWVSSWREAYEKAYALVSQMTL AEKVNITSGVGIYMGPCVGNTGSVDRLGFPQLCLQDSALGVASADNVTAFPAGITTGATWDKQLMYARGVAIGKEFR GKGANIHLGPSVGPLGRKPLGGRNWEGFGSDPVLQGKAAALHIRGVQEQGIIATIKHLVGNEQEMYRMYHIFQEGYS ANIDDRTLHELYLWPFAEAVRAGVGAAMTAYNAVNGSACSQNSYLINGILKDELGFQGLVMSDWLSHISGVGSALAG LDLNMP⑶TNIPLFGNSLWQYELTRAVLNGSVPVDRLNDMATRVVATWYKFGQDKNHPRPNFSSNTRSRDGPLYPGA LFSPSGQVNWFVNVQEDHYLVARQVAQDAITLLKNNDSLLPLDA⑶LTGGKLSVFGTDAQVNPDGPNSCLARACNKG TLGMGffGSGIADYPYMDDPIGAIRKRVPDVKFYNTDSFPWFFGTPENDEVAMVFISSDSGENTLTVEGNHGDRDSAK LRAWHD⑶KLVQKVAEKFKNVIWVHTVGPLDLEPWIELPSVKAVLFAHLPGQEAGESLTNVLFGDVSPSGHLPYSI TRKASDLPDSIANLKGFTffGQVQDTYSEGLYIDYRYLQKHSIQPRFAFGHGLSYTNFSFTNATIRAITTPLSVTPPA PPATRPASVVAKYSTDIPPASEAYEPAGFSRIWRYLYPWLSKSDADAAHAIGTSKSKTYPYPPGYSTVQRASFPPAG GGEGGNPALWDVAYEVTVRVTNTGKRPGKASAQLYLQFPEGIEYDTPVLQLRDFEKTKELQPGESQELKLTLTRKDV SVWDVRRQNWVVPTAIDDKKGFTAWVGEASDKLKVACYTGEGRCVEGAKQPV
[0015] 其中，该酶包括891个氨基酸，N端23个氨基酸为信号肽序列 "MGHHTATVCLWLALGSLTPVSFA"（SEQ ID NO. 3)。
[0016] 因此，成熟的β-葡萄糖苷酶HiBgl3B的理论分子量为94. 58kDa，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示：
[0017] RVVEPRDPVPQGYHAASYYPAPHGGWVSSWREAYEKAYALVSQMTLAEKVNITSGVGIYMGPCVGNTGS VDRLGFPQLCLQDSALGVASADNVTAFPAGITTGATWDKQLMYARGVAIGKEFRGKGANIHLGPSVGPLGRKPLGGR NWEGFGSDPVLQGKAAALHIRGVQEQGIIATIKHLVGNEQEMYRMYHIFQEGYSANIDDRTLHELYLWPFAEAVRAG VGAAMTAYNAVNGSACSQNSYLINGILKDELGFQGLVMSDWLSHISGVGSALAGLDLNMP⑶TNIPLFGNSLWQYEL TRAVLNGSVPVDRLNDMATRVVATWYKFGQDKNHPRPNFSSNTRSRDGPLYPGALFSPSGQVNWFVNVQEDHYLVAR QVAQDAITLLKNNDSLLPLDAGDLTGGKLSVFGTDAQVNPDGPNSCLARACNKGTLGMGWGSGIADYPYMDDPIGAI RKRVPDVKFYNTDSFPWFFGTPENDEVAMVFISSDSGENTLTVEGNHGDRDSAKLRAWHD⑶KLVQKVAEKFKNVIV VVHTVGPLDLEPWIELPSVKAVLFAHLPGQEAGESLTNVLFGDVSPSGHLPYSITRKASDLPDSIANLKGFTWGQVQ DTYSEGLYIDYRYLQKHSIQPRFAFGHGLSYTNFSFTNATIRAITTPLSVTPPAPPATRPASVVAKYSTDIPPASEA YEPAGFSRIWRYLYPWLSKSDADAAHAIGTSKSKTYPYPPGYSTVQRASFPPAGGGEGGNPALWDVAYEVTVRVTNT GKRPGKASAQLYLQFPEGIEYDTPVLQLRDFEKTKELQPGESQELKLTLTRKDVSVWDVRRQNWVVPTAIDDKKGFT AWVGEASDKLKVACYTGEGRCVEGAKQPV
[0018] 本发明提供了编码上述β -葡萄糖苷酶基因 Hibgl3B。具体地，该基因的cDNA序 列如SEQ ID NO. 4所示：
[0019] atgggtcatcacactgccaccgtatgcctctggctcgccctgggctccttgacgcccgtctcctttgcc cgcgttgtcgagccccgcgatcctgttcctcaagggtatcatgctgcttcctactaccccgcgccccatggcggttg ggtcagetcgtggcgcgaggcctacgaaaaagcctatgcactggtgtcgcagatgacgctggctgagaaggtgaaca tcacatcgggcgttggcatttatatgggaccctgtgtaggaaataccgggagtgtggatcgtctcggcttcccccag ctctgcctccaagacagcgctctcggcgtcgcctccgccgacaatgtcacggcttttcccgctggcattaccaccgg tgccacctgggacaagcagttgatgtatgcccgaggcgtcgcgatcggcaaggagttccgcggcaagggcgccaata ttcacttgggtccttcggttgggcccctcggccgcaagcccttgggcggccggaactgggagggctttggctccgac ccggtgctccagggcaaggccgctgctctgcacatccgcggcgttcaggagcagggcattattgccaccattaagca ccttgtcggcaatgagcaggagatgtaccgcatgtaccacatttttcaggagggttacagcgccaacattgacgacc gtactctgcatgagctctacctctggcccttcgcggaggcagttcgtgctggagtgggagccgccatgacggcctac aatgccgtcaatggctccgcttgttcccagaacagttatctcatcaatggcattctcaaagacgaactcggcttcca gggattggtcatgtcggactggctcagtcacatctcaggcgtgggctcggctctggccggtcttgacctcaacatgc cgggcgatacaaacattcccttgtttggtaacagtctgtggcagtacgagctgactcgtgccgtcctgaacggctcc gtgcctgtagacagactgaacgacatggccacgcgcgttgtggccacctggtacaagtttgggcaggataagaacca cccacggcccaacttctcatccaacactcgcagccgtgacgggcccctgtaccccggcgcccttttttctcccagcg gtcaggtgaattggttcgtcaacgtccaggaggatcactatcttgtcgcccgccaggtggctcaagatgccatcacg ctgctcaagaataacgacagcctcttgcctctggacgctggggatcttactggcggcaagctcagcgtcttcggcac tgacgctcaagtcaaccccgatgggcccaactcctgcctagcacgggcttgtaacaaaggcactcttggcatgggtt ggggctcgggtatcgcggactatccgtacatggacgatcccatcggagccatccgcaagcgcgtccccgacgtcaag ttctacaacacggacagctttccgtggttctttggcacgccggagaatgacgaggttgctatggtgttcatcagctc cgactcgggagagaatacgctgacagtcgagggcaaccatggcgaccgcgactcggccaagctgagggcatggcacg acggtgacaagctcgtgcagaaggtggctgagaaattcaagaacgtaatcgtcgtcgtgcatacggttggtcccctg gaccttgagccatggattgaacttccctcggtcaaagccgtcctctttgcccaccttcccggccaagaagccggcga gtctctgaccaacgtcctcttcggcgacgtctcgccgagtggccacctcccctactccatcactcgcaaggcctccg atctgcccgacagcatcgccaacctgaagggtttcacctggggccaagtccaagacacctactccgaagggctctac atcgactaccgctacctgcaaaagcactcgatccagccccgcttcgccttcggccacggcttgagetacaccaactt ctccttcaccaatgccaccatccgcgccatcactacccccctatccgtcaccccgccagccccgccagccaccaggc ccgcctcagtcgtcgctaaatactccaccgacatcccgcccgccagcgaagcctacgagcctgcaggcttctccagg atctggcgctacctctacccctggctgtccaaatccgacgccgacgccgcccacgctatcggcacgagcaagtccaa aacctacccctaccctcccggctattccaccgtgcagcgcgcgtctttccctcccgctggcggcggcgagggcggca accccgcgctctgggacgtggcatacgaggtgacggtgcgcgtcaccaacacgggcaagaggcccgggaaagcctcg gcgcagctgtatctgcagttcccggaggggatcgagtacgatacccccgtactgcagctccgggatttcgagaagac caaggagctccagccgggcgagagccaggagctgaagctgacattgacgaggaaggatgtcagcgtgtgggacgtga ggaggcagaactgggttgttccgacggcgattgacgacaagaaggggttcacggcgtgggtgggcgaggcgagcgat aagttgaaggtggcgtgctacacgggtgaggggaggtgtgtggagggggcgaagcagccggtttga
[0020] 本发明基于PCR的方法分离克隆了 β -葡萄糖苷酶基因 Hibgl3B，DNA全序列分析 结果表明，去除内含子后的β-葡萄糖苷酶基因 Hibgl3B cDNA全长2676bp。其中，信号肽 的喊基序列为：
[0021] atgggtcatcacactgccaccgtatgcctctggctcgccctgggctccttgacgcccgtctcctttgcc (SEQ IDNO. 6) 〇
[0022] 成熟的β -葡萄糖苷酶基因 HiBgl3B的基因序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0023] SEQ ID NO. 5
[0024] cgcgttgtcgagccccgcgatcctgttcctcaagggtatcatgctgcttcctactaccccgcgccccat ggcggttgggtcagetcgtggcgcgaggcctacgaaaaagcctatgcactggtgtcgcagatgacgctggctgagaa ggtgaacatcacatcgggcgttggcatttatatgggaccctgtgtaggaaataccgggagtgtggatcgtctcggct tcccccagctctgcctccaagacagcgctctcggcgtcgcctccgccgacaatgtcacggcttttcccgctggcatt accaccggtgccacctgggacaagcagttgatgtatgcccgaggcgtcgcgatcggcaaggagttccgcggcaaggg cgccaatattcacttgggtccttcggttgggcccctcggccgcaagcccttgggcggccggaactgggagggctttg gctccgacccggtgctccagggcaaggccgctgctctgcacatccgcggcgttcaggagcagggcattattgccacc attaagcaccttgtcggcaatgagcaggagatgtaccgcatgtaccacatttttcaggagggttacagcgccaacat tgacgaccgtactctgcatgagctctacctctggcccttcgcggaggcagttcgtgctggagtgggagccgccatga cggcctacaatgccgtcaatggctccgcttgttcccagaacagttatctcatcaatggcattctcaaagacgaactc ggcttccagggattggtcatgtcggactggctcagtcacatctcaggcgtgggctcggctctggccggtcttgacct caacatgccgggcgatacaaacattcccttgtttggtaacagtctgtggcagtacgagctgactcgtgccgtcctga acggctccgtgcctgtagacagactgaacgacatggccacgcgcgttgtggccacctggtacaagtttgggcaggat aagaaccacccacggcccaacttctcatccaacactcgcagccgtgacgggcccctgtaccccggcgcccttttttc tcccagcggtcaggtgaattggttcgtcaacgtccaggaggatcactatcttgtcgcccgccaggtggctcaagatg ccatcacgctgctcaagaataacgacagcctcttgcctctggacgctggggatcttactggcggcaagctcagcgtc ttcggcactgacgctcaagtcaaccccgatgggcccaactcctgcctagcacgggcttgtaacaaaggcactcttgg catgggttggggctcgggtatcgcggactatccgtacatggacgatcccatcggagccatccgcaagcgcgtccccg acgtcaagttctacaacacggacagctttccgtggttctttggcacgccggagaatgacgaggttgctatggtgttc atcagetccgactcgggagagaatacgctgacagtcgagggcaaccatggcgaccgcgactcggccaagctgagggc atggcacgacggtgacaagctcgtgcagaaggtggctgagaaattcaagaacgtaatcgtcgtcgtgcatacggttg gtcccctggaccttgagccatggattgaacttccctcggtcaaagccgtcctctttgcccaccttcccggccaagaa gccggcgagtctctgaccaacgtcctcttcggcgacgtctcgccgagtggccacctcccctactccatcactcgcaa ggcctccgatctgcccgacagcatcgccaacctgaagggtttcacctggggccaagtccaagacacctactccgaag ggctctacatcgactaccgctacctgcaaaagcactcgatccagccccgcttcgccttcggccacggcttgagetac accaacttctccttcaccaatgccaccatccgcgccatcactacccccctatccgtcaccccgccagccccgccagc caccaggcccgcctcagtcgtcgctaaatactccaccgacatcccgcccgccagcgaagcctacgagcctgcaggct tctccaggatctggcgctacctctacccctggctgtccaaatccgacgccgacgccgcccacgctatcggcacgagc aagtccaaaacctacccctaccctcccggctattccaccgtgcagcgcgcgtctttccctcccgctggcggcggcga gggcggcaaccccgcgctctgggacgtggcatacgaggtgacggtgcgcgtcaccaacacgggcaagaggcccggga aagcctcggcgcagctgtatctgcagttcccggaggggatcgagtacgatacccccgtactgcagctccgggatttc gagaagaccaaggagctccagccgggcgagagccaggagctgaagctgacattgacgaggaaggatgtcagcgtgtg ggacgtgaggaggcagaactgggttgttccgacggcgattgacgacaagaaggggttcacggcgtgggtgggcgagg cgagcgataagttgaaggtggcgtgctacacgggtgaggggaggtgtgtggagggggcgaagcagccggtttga
[0025] 成熟蛋白理论分子量为94. 58kDa，将β -葡萄糖苷酶基因 Hibgl3B成熟编码序列 及推导出的氨基酸序列进行BLAST比对，确定HiBgl3B是一种新的β-葡萄糖苷酶。
[0026] 本发明提供了包含上述β-葡萄糖苷酶基因 Hibgl3B的重组载体，选为 pPIC-Hibgl3B。将本发明的β-葡萄糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之 间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方 案，优选为将本发明的β -葡萄糖苷酶基因插入到质粒PPIC9上的EcoR I和Not I限制性 酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质 粒 pPIC9-Hibgl3B。
[0027] 本发明还提供了包含上述β -葡萄糖苷酶基因 Hibgl3B的重组菌株，优选所述菌 株为大肠杆菌、酵母菌，优选为重组菌株Hibgl3B。
[0028] 本发明还提供了一种制备β -葡萄糖苷酶基因 HiBgl3B的方法，包括以下步骤：
[0029] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0030] 2)培养重组菌株，诱导重组β -葡萄糖苷酶基因 HiBgl3B表达；
[0031] 3)回收并纯化所表达的β -葡萄糖苷酶基因 HiBgl3B。
[0032] 其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选 将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞（Pichia pastoris)GS115,得到重组菌株GS115/ Hibgl3B。
[0033] 本发明还提供了上述葡萄糖苷酶HiBgl3B的应用。对大豆异黄酮的降解实验， 表明β -葡萄糖苷酶HiBgl3B可高效降解大豆异黄酮，将其转化为三种活性苷元，降解率达 90%以上。在添加同等酶单位的β-葡萄糖苷酶的情况下，HiBgl3B效果明显远优于其他 真菌来源的β -葡萄糖苷酶，其特殊的底物选择性使其更适合降解大豆异黄酮。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1 β -葡萄糖苷酶的最适pH。
[0035] 图2重组β -葡萄糖苷酶的pH稳定性。
[0036] 图3重组β -葡萄糖苷酶的最适温度。
[0037] 图4重组β _葡萄糖苷酶的热稳定性。
【具体实施方式】
[0038] 试验材料和试剂
[0039] 1、菌株及载体：本发明从腐质霉（Humicola insolens Y1CGMCC 4573)中分离 得到一种新的β-葡萄糖苷酶HiBgl3B。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于 Invitrogen 公司。
[0040] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。 桦木木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0041] 3、培养基：
[0042] (1)腐质霉（Humicola insolens Y1CGMCC 4573)培养基为马铃薯汁培养基： IOOOmL马铃薯汁，IOg葡萄糖，25g琼脂，pH自然。
[0043] (2)大肠杆菌培养基LB(1 %蛋白胨、0.5%酵母提取物、1 % NaCl，pH自然）。
[0044] (3)BMGY 培养基：1%酵母提取物，2% 蛋白胨，1.34% YNB，0.00004% Biotin，1 % 甘油（V/V)。
[0045] ⑷BMMY培养基：除以0. 5 %甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH自然。
[0046] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0047] 实施例1腐质霉（Humicola insolens) β -葡萄糖苷酶编码基因 bgl3B的克隆
[0048] 设计基因特异性引物：
[0049] PF:GGGGAATTCCGCGTTGTCGAGCCCCGCGATC
[0050] PR:GGGGCGGCCGCTCAAACCGGCTGCTTCGCCCCCTC
[0051] 提取腐质霉 Humicola insolens Y1CGMCC 4573RNA，反转录得到 cDNA。以 Humicola insolens Y1CGMCC 4573cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94°C变性5min;然后 94°C变性 30sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 2min30s，35 个循环后 72°C保温 lOmin。得到一 约2600bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送睿博兴科生物技术有限公司测序。
[0052] 测序结果为β -葡萄糖苷酶基因 Hibgl3B基因2607bp (去除信号肽），编码868个 氨基酸和一个终止密码子。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为94. 58kDa。
[0053] 实施例2重组木聚糖酶的制备
[0054] 将表达载体pPIC9进行双酶切（EcoR I+Not I)，同时将编码β -葡萄糖苷酶Bgl3B 的基因 bgl3B双酶切（EcoR I+Not I)，切出编码成熟β-葡萄糖苷酶的基因片段（不包含信 号肽序列）与表达载体PPIC9连接，获得含有腐质霉（Humicola insolens Y1CGMCC 4573) β -葡萄糖苷酶基因 Hibgl3B的重组质粒pPIC-Hibgl3B并转化毕赤酵母GS115,获得重组 毕赤酵母菌株GS115/Hibgl3B。
[0055] 以同样的方法构建含有信号肽序列的表达载体，并转化毕赤酵母。
[0056] 取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30°C 250rpm振荡培 养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30°C 250rpm振荡培养。诱导 48h后，离心收集上清。测定β-葡萄糖苷酶的活力。SDS-PAGE结果表明，重组β-葡萄糖 苷酶在毕赤酵母中得到了表达。
[0057] 实施例3重组β -葡萄糖苷酶的活性分析
[0058] β -葡萄糖苷酶活性的测定：在405nm下测定酶水解底物pNPG所生成的产物对硝 基苯酚（pNP)的量。
[0059] 反应步骤：125 μ I 2mM pNPG底物与125 μ 1缓冲液混勾，加入250 μ 1适当稀释的 酶液，于60°C反应IOmin，加入I. 5mL IM的Na2COjS止反应，使用分光光度计测定OD 4(15值。
[0060] 酶活单位的定义个β -葡萄糖苷酶活性单位（U)定义为在给定反应条件下，每 分钟分解底物PNPG生成1 μ mol对硝基苯酚（pNP)所需的酶量。
[0061] 实施例4重组β -葡萄糖苷酶的性质测定
[0062] 测定实施例2获得重组β -葡萄糖苷酶HiBgl3B的性质
[0063] 1、重组β -葡萄糖苷酶HiBgl3B的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
[0064] 将实施例2纯化的重组β -葡萄糖苷酶HiBgl3B在不同的pH下进行酶促反应以测 定其最适pH。底物pNPG用不同pH的0. lmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中50°C下进行 β-葡萄糖苷酶活力测定。结果（图1)表明，β-葡萄糖苷酶HiBgl3B的最适pH为6.0。 β -葡萄糖苷酶于上述各种不同pH的缓冲液中37°C处理60min，再在pH6. 0缓冲液体系中 50°C下测定酶活性，以研宄酶的pH稳定性。结果（图2)表明β -葡萄糖苷酶HiBgl3B的 pH耐受性。
[0065] 2、β -葡萄糖苷酶HiBgl3B的最适温度及热稳定性测定方法如下：
[0066] β -葡萄糖苷酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH6. 0)缓冲 液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为β-葡萄糖苷酶在不同温度下处理不同 时间，再在最适温度下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果（图3)表明其最适温度 为50°C。酶的热稳定性性试验表明（图4)，β -葡萄糖苷酶HiBgl3B有良好的热稳定性， 在50°C下温育lh，能保持酶活不降低。
[0067] 3、β -葡萄糖苷酶HiBgl3B的酶动力学测定方法如下：
[0068] 用不同浓度的pNPG为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH4. 5)缓冲液体系 中，50°C下测定酶活性，计算出其在50°C下的1值。经测定，以pNPG为底物时的Km值为 I. 51mM，最大反应速度 VmaxS 25. 53 μ mol/min · mg。
[0069] 4、不同金属离子化学试剂对β -葡萄糖苷酶HiBgl3B酶活的影响测定如下：
[0070] 在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研宄其对酶活性 的影响，各种物质终浓度为5mmol/L。在50°C、pH6. 0条件下测定酶活性。结果表明，大多 数离子和化学试剂对重组β -葡萄糖苷酶的活力没有影响，但SDS和Ag+严重抑制其酶活 力，分别表现出最适条件下5%和24%的酶活力。
[0071] 5、重组β -葡萄糖苷酶HiBgl3B的底物特异性
[0072] 对多种多糖、天然糖苷和合成物pNPG等底物，在最适条件下测定酶活力，研宄 β-葡萄糖苷酶HiBgl3B的底物特异性。结果如表2所示。相比大多数β-葡萄糖苷酶， 腐质霉（Humicola insolens)来源的HiBgl3B具有非常独特的底物特异性，它不能水解该 类水解酶的天然底物纤维二糖、龙胆二糖和扁桃苷等。经氨基酸序列分析发现，HiBgl3B在 多个与底物+1位葡萄糖分子存在分子间相互作用的关键芳香族氨基酸残基位点发生了突 变，所以猜测其底物特异性的改变是由于底物不能正确结合。
[0073] 表1. β -葡萄糖苷酶HiBgl3B底物特异性分析
[0074]
【权利要求】
1. 一种高效降解大豆异黄酮的中温中性￠-葡萄糖苷酶HiBgl3B，其特征在于，其氨基 碱序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示。
2. -种高效降解大豆异黄酮的中温中性￠-葡萄糖苷酶基因 Hibgl3B，其特征在于，编 码权利要求1所述的0 -葡萄糖苷酶HiBgl3B。
3. 如权利要求2所述的0 -葡萄糖苷酶基因 Hibgl3B，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
4. 包含权利要求2所述0 -葡萄糖苷酶基因 Hibgl3B的重组载体。
5. 包含权利要求2所述0 -葡萄糖苷酶基因 Hibgl3B的重组载体pPIC-Hibgl3B。
6. 包含权利要求2所述0 -葡萄糖苷酶基因 Hibgl3B的重组菌株。
7. -种制备重组0 -葡萄糖苷酶HiBgl3B的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2) 培养重组菌株，诱导重组0 -葡萄糖苷酶HiBgl3B表达； 3) 回收并纯化所表达的0 -葡萄糖苷酶HiBgl3B。
8. 权利要求1所述0 -葡萄糖苷酶HiBgl3B的应用。
【文档编号】C12N9/42GK104498455SQ201410717927
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】姚斌, 石鹏君, 夏伟, 罗会颖, 黄火清, 苏小运, 柏映国, 杨培龙, 王亚茹, 孟昆, 师霞, 马锐 申请人:中国农业科学院饲料研究所