低分泌蛋白酶a酿酒酵母菌株及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种可提高啤酒的泡沫稳定性的低蛋白酶A分泌的酿酒酵母菌株及其构建方法。本发明提供的低蛋白酶A分泌的酿酒酵母菌株通过敲除编码组成型分泌途径中的关键蛋白因子Sec5p的SEC5基因全序列来获得。所述低蛋白酶A分泌的酿酒酵母菌株，在氮源缺乏麦芽汁中以16℃发酵4-5d，发酵液中蛋白酶A的酶活与出发菌株明显降低，泡持性明显增加；同时发酵性能及生长性能良好，未出现影响重组菌株生长性能或温度致死的情况。对于模式菌株W303-1A还取得了预想不到的效果，其重组菌株的生长发酵性能非但没有下降，反而提高了发酵速度，从5天缩短到4天。
【专利说明】低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株及其构建方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，特别涉及一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株及其 构建方法。
【背景技术】：
[0002] 纯生啤酒是指采用无菌酿造、无菌过滤、无菌包装生产的一种健康时尚、口感新 鲜、自然、卫生、安全营养的鲜啤酒。由于在生产过程中没有经过巴氏杀菌或瞬间杀菌，避免 了加热造成的风味物质和营养成分的破坏，保持了啤酒的新鲜口味和成分，因而与普通啤 酒相比，纯生啤酒更纯正、更爽口、更新鲜、营养更丰富。
[0003] 然而，纯生啤酒在泡沫质量方面存在着明显的质量缺陷，即随着货架时间的延长， 泡沫稳定性逐渐下降。因此，提高纯生啤酒的泡沫稳定性一直是纯生啤酒生产厂家亟待解 决的技术难题。国内外研究资料表明，蛋白酶A是导致纯生啤酒泡持性下降的主要原因。蛋 白酶A(EC 3.4.23.6)是在啤酒发酵过程中由酵母分泌的一种酸性蛋白酶。纯生啤酒因未 经巴氏杀菌而残存蛋白酶A，随着货架时间的延长，蛋白酶A会分解啤酒内的泡沫活性蛋白 而导致啤酒泡沫泡持性下降。
[0004] 目前，国内外主要从添加蛋白酶A抑制剂、优化发酵工、菌种改造等方面入手来降 低蛋白酶A，提高啤酒泡沫稳定性。添加蛋白酶A抑制剂虽可降低蛋白酶A的活性，但外源 物质的加入可能会影响啤酒的风味、稳定性和安全性。从发酵工艺来看，为了维持啤酒的风 味特征，啤酒发酵的原辅料处理、发酵温度、灌压等条件相对固定，通过调整这些条件来降 低蛋白酶A分泌，提高啤酒泡沫稳定性的空间不大。通过敲除蛋白酶A基因的方法虽可降 低蛋白酶A的分泌，但同时会影响酵母的生理生化特性。
[0005] 常规条件下，蛋白酶A定位于酵母细胞液泡内，参与液泡内多种蛋白的成熟和激 活过程。有研究表明，在氮源缺乏、CO 2浓度过高或酒精度过高等胁迫条件下，蛋白酶A可以 分泌到胞外，并推测是可能是通过缺省途径（default pathway)来完成的。研究表明常规条 件下，组成型分泌途径是细胞膜蛋白和分泌型蛋白的主要运输途径，但目前对于胁迫条件 下组成型蛋白分泌途径的研究报道很少，尤其是对于蛋白酶A在胁迫条件下外分泌途径的 研究更是空白。常规条件下，细胞内的组成型分泌途径是通过囊泡来介导完成的，包括四个 步骤：囊泡的出芽、转运、栓系和融合。而胞吐复合体在囊泡的栓系和融合过程中发挥重要 作用，由八个不同的亚基（Sec3p、Sec5p、Sec6p、Sec8p、SeclOp、Secl5p、Exo70p 和 Exo84p) 组合而成，其中Sec5p是复合体的核心因子，维持着胞吐复合体的完整性和稳定性。有研究 表明，将果蝇的SEC5基因敲除后会影响生殖细胞的生长及细胞中膜的极性运输，并使其对 温度敏感；将酵母中的SEC5基因敲除会引起菌体对温度的异常敏感。
[0006] 目前通过敲除酿酒酵母组成型分泌途径中的关键蛋白因子Sec5p来降低胁迫条 件下蛋白酶A的分泌量的方法尚未见报道。本发明通过敲除酵母中组成型分泌途径中胞吐 复合体的核心因子Sec5p的基因来选育适合啤酒发酵的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株， 从而提高啤酒的泡沫稳定性。
【发明内容】
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[0007] 本发明所解决上述技术问题所采用的技术方案是通过敲除酿酒酵母出发菌株中 编码组成型分泌途径中的关键蛋白因子Sec5p的SEC5基因全序列，获得低蛋白酶A酿酒酵 母菌株。
[0008] 所述SEC5基因其Gene ID为：851744,核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 优选的，所述酿酒酵母出发菌株为模式菌株W303-1A ;
[0010] 优选的，所述酿酒酵母出发菌株为工业菌株S6。
[0011] 所述低蛋白酶A分泌的酿酒酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0012] (1)将含有SEC5基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因 KanMX插入质粒中，得 到重组质粒；
[0013] (2)以重组质粒为模板扩增出含有SEC5基因的上、下游序列及标记基因 KanMX的 重组片段，将重组片段转化入酿酒酵母出发菌株中，得到重组后的基因工程菌株；
[0014] (3) KanMX抗性基因的去除；
[0015] (4) pGAPza 质粒丢失
[0016] 具体如下：
[0017] (1)重组质粒的构建
[0018] ①以出发菌株总DNA为模板，PCR扩增出SEC5基因的上、下游序列；
[0019] ②以含有Amp抗性的穿梭质粒pUC6为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因；
[0020] ③将步骤（1)-①和（1)-②获得的PCR产物依次连接到含有Amp抗性的pUC19质 粒上,获得重组质粒；
[0021] (2)SEC5基因的敲除
[0022] ①以步骤⑴中的重组质粒为模板，扩增出含有SEC5基因的上、下游序列的DNA 分子及标记基因 KanMX的重组片段；
[0023] ②用醋酸锂转化法将（2)_①中的重组片段转化入出发菌株中，得到重组菌株；
[0024] (3) KanMX抗性基因的去除
[0025] ①利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒转入步骤（2)-②中的重组菌株中，
[0026] ②用Zeocin抗性平板筛选转化子，挑选在YEH)平板上生长而在G418平板上不生 长的基因工程菌株；
[0027] (4) pGAPza 质粒丢失
[0028] 将步骤（3)_②中挑选的基因工程菌株于YEH)液体培养基中进行传代培养，选 取第一代及第十代以后各培养物提取酵母质粒并以此为模板，用引物进行PCR扩增，验证 pGAPza质粒是否丢失。
[0029] (5)工业菌株进行第二条等位基因敲除
[0030] 利用（2)-②中所述方法向⑷中得到的菌株中导入（2)-①所得的重组片段，筛 选得第二条等位基因缺失的重组工业菌株，并按照步骤（3)和（4)去除KanMX抗性基因。
[0031] 所述重组菌株可通过上述方法构建获得，这些方法已有许多文献报道，如Jos印h Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。也可用本领域已知的其它方 法来构建基因突变的酵母菌株。
[0032] 本发明同时提供了一种专门用于鉴定所述低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株的基因 序列，该基因序列是以所述低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株基因组为模板扩增的特异性片 段，该特异性片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
[0033] 本发明所述酿酒酵母菌株在其他发酵性能不受影响的情况下，在氮源缺乏麦芽汁 中以16°C发酵4-5d，发酵液中蛋白酶A的酶活与出发菌株明显降低，泡持性明显增加。
[0034] 有益效果：
[0035] 1、本发明选育的酿酒酵母菌株明显降低了蛋白酶A的胞外分泌量，能够提高纯生 啤酒的泡持性，对于模式菌W303-1A，其重组菌株的蛋白酶A酶活较出发菌株有明显降低， 降低约29%，同时，重组菌株的泡持性相较出发菌增加了 17% ;对于工业菌株S6其重组 菌株的蛋白酶A酶活有明显降低，约为16%，同时，重组菌株的泡持性相较出发菌增加了 13%。
[0036] 2、本发明选育的酿酒酵母菌株在啤酒发酵的条件下，发酵性能及生长性能良好， 未出现影响重组菌株生长性能或温度致死的情况。对于模式菌株W303-1A还取得了预想不 到的效果，其重组菌株的生长发酵性能非但没有下降，反而提高了发酵速度，从5天缩短到 4天。
[0037] 3、本发明选育的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株是通过敲除常规条件下组成型 分泌途径中胞吐复合体的核心因子Sec5p的基因来实现的，这为胁迫条件下选育低分泌蛋 白酶A的酿酒酵母菌株提供了一个新的方向。
【专利附图】
【附图说明】：
[0038] 图1为pUC-AKB质粒构建过程
[0039] 图2为pUC-AKB重组质粒验证图
[0040] a中M为DNA maker，泳道1为KpnI单酶切pUC-A质粒，泳道2为EcoRI和KpnI 双酶切pUC-19质粒
[0041] b中M为DNA maker，泳道1为BamHI单酶切pUC-AK质粒
[0042] c中M为DNA maker ;泳道1为以重组质粒pUC-AKB为模板，以SAl和SB2为引物 PCR验证；泳道2为以质粒pUC19为模板，以SAl和SB2为引物PCR验证
[0043] 图3为基因盒SA-KanMX-SB片段与酵母基因组同源重组过程
[0044] 图4为重组菌株PCR验证结果
[0045] a 中 M 为 DL5000DNA maker (从上至下依次为：5000、3000、2000、1500、1000、750、 500、250和IOObp);泳道1为以重组菌株WS5K为模板，以SlU和SlD为引物PCR验证；泳 道2为重组菌株SS5K-1为模板，以SlU和SlD为引物PCR验证；泳道3为出发菌株W303-1A 为模板，以SlU和SlD为引物PCR验证；泳道4为出发菌株S6为模板，以SlU和SlD为引物 PCR验证
[0046] b 中 M 为 DL5000DNA maker (从上至下依次为：5000、3000、2000、1500、1000、750、 500、250和IOObp);泳道1为重组菌株WS5K为模板，以S2U和S2D为引物PCR验证；泳道2 为重组菌株SS5K-1为模板，以S2U和S2D为引物PCR验证；泳道3为出发菌株W303-1A为 模板，以S2U和S2D为引物PCR验证；泳道4为出发菌株S6为模板，以S2U和S2D为引物 PCR验证
[0047] 图5为重组菌株WS5K KanMX抗性基因剔除及pGAPza质粒丢失验证
[0048] a中M为DNA Marker ;泳道1为以重组菌株WS5K基因组为模板，Kl和K2为引物 进行PCR扩增的产物；泳道2为以去除KanMX抗性基因的重组菌株基因组为模板，Kl和K2 为引物进行PCR扩增；
[0049] b中M为DNA Marker ;泳道1为以去除KanMX抗性基因重组菌株的第一代酵母质 粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物；泳道2为以去除KanMX抗性基因重组菌 株的第十代酵母质粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物；
[0050] 图6为重组菌株SS5K-lKanMX抗性基因剔除及pGAPza质粒丢失验证
[0051] a中M为DNA Marker ;泳道1为为以去除KanMX抗性基因的重组菌株基因组为模 板，Kl和K2为引物进行PCR扩增；泳道2为以重组菌株SS5K-1基因组为模板，Kl和K2为 引物进行PCR扩增的产物；
[0052] b中M为DNA Marker ;泳道1以去除KanMX抗性基因重组菌株的第十代酵母质粒 为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物；泳道2为以去除KanMX抗性基因重组菌株 的第一代酵母质粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物；
[0053] 图7为敲除第二个等位基因的重组菌株PCR验证结果
[0054] a中M为DNA maker ;泳道1为以重组菌株SS5-1为模板，以SlU和SlD为引物PCR 验证；泳道2为重组菌株SS5K-2为模板，以SlU和SlD为引物PCR验证；
[0055] b中M为DNA maker ;泳道1为以重组菌株SS5-1为模板，以S2U和S2D为引物PCR 验证；泳道2为重组菌株SS5K-2为模板，以S2U和S2D为引物PCR验证；
[0056] 图8为重组菌株SS5K_2KanMX抗性基因剔除及pGAPza质粒丢失验证
[0057] a中M为DNA Marker ;泳道1为以重组菌株SS5K-2基因组为模板，Kl和K2为引 物进行PCR扩增的产物；泳道2为以去除KanMX抗性基因的重组菌株基因组为模板，Kl和 K2为引物进行PCR扩增；；
[0058] b中M为DNA Marker ;泳道1为以去除KanMX抗性基因重组菌株的第一代酵母质 粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物；泳道2为以去除KanMX抗性基因重组菌 株的第十代酵母质粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物；
[0059] 图9为出发菌株W303-1A及重组菌株WS5二氧化碳累积失重
[0060] 图10为出发菌株S6及重组菌株SS5-2二氧化碳累积失重
【具体实施方式】：
[0061] 下面通过具体的实施方案叙述本发明的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株及其构 建方法。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0062] 实施例1 :低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株WS5的构建
[0063] 出发菌株W303-1A通过两次同源重组的方法构建重组基因工程菌株。
[0064] 根据Genebank中的酵母基因组数据和整合质粒序列，设计了下述实施例中各引 物。
[0065] 表1本实施例中所用到的引物
[0066]
【权利要求】
1. 一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株，其特征在于，所述菌株通过敲除出发菌株中编 码组成型分泌途径中的关键蛋白因子Sec5p的SEC5基因全序列获得。
2. 如权利要求1所述的一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株，其特征在于，所述SEC5基 因其 Gene ID 为：851744。
3. 如权利要求1所述的一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株 为模式菌W303-1A。
4. 如权利要求1所述的一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株 为工业菌株S6。
5. -种构建权利要求1所述低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株的方法，包括如下步骤： (1) 将含有SEC5基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX插入质粒中，得到重 组质粒； (2) 以重组质粒为模板扩增出含有SEC5基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因 KanMX的重组片段，将重组片段转化入出发菌株中，得到重组后的基因工程菌； (3) 采用Cre-LoxP报告基因挽救系统剔除重组后的基因工程菌中的KanMX抗性基因， 并丢失以此引入的pGAPza质粒； (4) 多倍体工业菌株则重复步骤（2)-(3)。
6. 根据权利要求5所述的一种构建低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株的方法，其特征在于， 包括如下步骤： (1) 重组质粒的构建 ① 以出发菌株总DNA为模板，PCR扩增出SEC5基因的上、下游序列； ② 以含有Amp抗性的穿梭质粒pUC6为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因； ③ 将步骤（1)-①和（1)-②获得的PCR产物连接到质粒载体上，获得重组质粒； (2) SEC5基因的敲除 ① 以步骤（1)中的重组质粒为模板，扩增出含有SEC5基因的上、下游序列的DNA分子 及标记基因KanMX的重组片段； ② 用醋酸锂转化法将（2)-①中的重组片段转化入出发菌株中，得到重组菌株； (3) KanMX抗性基因的去除 ① 利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒转入步骤（2)-②中的重组菌株中， ② 用Zeocin抗性平板筛选转化子，挑选在YEH)平板上生长而在G418平板上不生长的 基因工程菌株； (4) pGAPza质粒丢失 将步骤（3)-②中挑选的基因工程菌株于YEH)液体培养基中进行传代培养，选取第一 代及第十代以后各培养物提取酵母质粒并以此为模板，用引物进行PCR扩增，验证pGAPza 质粒是否丢失； (5) 工业菌株进行第二条等位基因敲除 利用（2)_②中所述方法向（4)中得到的菌株中导入（2)-①所得的重组片段，筛选得 第二条等位基因缺失的重组工业菌株，并按照步骤（3)和（4)去除KanMX抗性基因。
7. 根据权利要求5或6所述的一种构建低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株的方法，其特征 在于：用于构建所述重组质粒的载体为含有Amp抗性的pUC19质粒。
8. 权利要求1所述的一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株在啤酒发酵中的应用。
9. 一种检测如权利要求1所述低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，以重 组菌株的总DNA为模板，通过引物对： 上游引物：5 ' -GGAGTTGCTTCCAGTGGCTTAG-3 ' 下游引物：5' -CGTCAAGACTGTCAAGGAGGGT-3' 进行PCR扩增，可获得一条长度为1276bp的特异性条带，所述特异性条带核苷酸序列 如序列表SEQ ID NO:2所示； 通过引物对： 上游引物：5' -TCGCAGACCGATACCAGGATC-3' 下游引物：5' -CCCAAGACGCAAGCAAGAGGT-3' 进行PCR扩增，可获得一条长度为1715bp的特异性条带，所述特异性条带核苷酸序列 如序列表SEQ ID NO:3所示； 出现上述两条特异性条带则证明被检测菌株为权利要求1所述的低分泌蛋白酶A酿酒 酵母菌株。
【文档编号】C12N1/18GK104403954SQ201410717477
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月2日 优先权日:2014年12月2日
【发明者】陈叶福, 肖冬光, 刘明明, 郭学武, 董健, 张翠英, 杜丽平, 马立娟 申请人:天津科技大学