分型诊断四种感染人疟原虫的探针、试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于诊断四种感染人疟原虫的探针、试剂盒及其使用方法。其中，恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫分别采用对应的种特异性探针，探针5’端均加有10个T尾，紫外交联固定于尼龙杂交膜。所述试剂盒由PCR和反向斑点杂交反应试剂及材料构成，可在室温下进行恶性疟原虫、问日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫或者其中的两种或者三种或者四种疟原虫的分型诊断，提供了一种简便、快速的疟原虫分型诊断技术。
【专利说明】分型诊断四种感染人疟原虫的探针、试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于疟原虫分型诊断的探针、试剂盒及其使用方法，尤其涉及一 种用于诊断恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫的探针及其试剂盒和使用方 法，属于疟原虫检测领域。
【背景技术】
[0002] 疟原虫是原生动物门、孢子虫纲（Sporozoa)，球虫目（Cocciidea)，血孢子虫亚目 (Haemosporidiidea)，原虫科（Plasmadiidea)中的一个属，即痕原虫属（plasmodiam)的总 称。寄生于人体者包括恶性疱原虫（Plasmodium falciparum)、间日疱原虫（Plasmodium vivax)、卵形痕原虫（Plasmodium ovals)、三日痕原虫（Plasmodium malariae)四种。我 国以间日疟分布最广，除青藏高原外，遍及全国。恶性疟次之，分布于秦岭一淮河以南，以云 贵、两广与海南为最。三日疟在长江南北各省均有散在病例。卵形疟只在云南和广东有少 数病例报告。
[0003] 疟疾是对人类健康危害最严重的传染病之一，我国自2000年以来疟疾疫情出现 回升，其中云南、海南两省较为严重，许多省受到输入性恶性疟的威胁，尤其是境外输入性 恶性疟的威胁。随着经济全球化和国际交往的增多，近年来劳务输出人数逐年增加，输入性 疟疾病例逐年增多，呈逐年上升趋势。输入性病例大多源于非洲、缅甸等恶性疟高发区劳务 输出的归国人员，2008年我国疟疾死亡病例全部为境外劳务回国人员，2009年有21个省 (市、区）有输入性恶性疟病例报告，且疟疾死亡也全部为输入病例。2010年报告输入性恶 性疟1161例，占恶性疟报告病例数的92. 3%，较2009年（897例）上升29. 4%。2012年全 国31个省（市、区）有报告疟疾病例，与2011年相比，本地感染疟疾病例明显下降，输入性 疟疾病例比例明显上升，尤其是境外输入性疟疾病例比例从2011年的66. 4 % (2974/4479) 上升到2012年的91.0% (2474/2718)，其中以恶性疟为主。因此，关注疟疾疫情，特别是境 外输入性恶性疟疫情十分重要。
[0004] 目前，疟疾诊断方法主要分3类：一是以传统的镜检法为基础的病原学诊断，通过 增加血样中的原虫数目、改进染色方法或两者结合来提高检测效率，如荧光染色技术等；二 是上世纪70年代发展起来的免疫学诊断方法，如间接荧光抗体法、酶联免疫吸附法等，其 中免疫层析技术因其快速、简便等特点已成为疟疾诊断的研宄热点；三是上世纪80年代兴 起的分子生物学诊断方法，通过检测疟原虫种、株特异性的基因片段来确定疟原虫感染，如 基因探针和PCR技术等。PCR技术因其高度的敏感性、特异性以及对虫种、虫株的鉴别力 在疟疾诊断中发挥越来越重要的作用，套式PCR等方法可进一步提高诊断的敏感性和准确 性。但PCR方法仍费力耗时，需要多次试验确定混合感染。如何在一次反应中检测多个虫 种、虫株、甚至基因型成为近年来研宄的热点。
[0005] 反向斑点杂交（reverse dot blot，RDB)是1989年由Saiki等提出的一种斑点 杂交技术，并将其应用于血液病和Beta地中海贫血的检测，该方法操作简便，在膜上添加 针对不同亚型或突变的探针，可以在一张膜上同时检测多个样品，有利于降低成本，节省时 间。RDB只需要相对较短的寡核苷酸探针就能提供明显的杂交信号，通过调整杂交条件可以 鉴别出模板中一个碱基的差异。该技术较正向斑点杂交和凝胶电泳转印杂交具有快速、简 便、敏感性高、特异性强的特点，尤其是在基因分型、基因突变检测、病原体的检测等方面有 其独特的优势。
【发明内容】
[0006] 本发明的主要目的是提供一套用于分型诊断疟原虫的探针，可用于恶性疟原虫、 间曰疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫或者其中的两种或者三种或者四种疟原虫的聚合酶 链反应-反向斑点杂交分型诊断。
[0007] 所述探针针对各疟原虫的种特异性片段设计，探针5'端均加有10个T尾，其核苷 酸序列为：
[0008]
【权利要求】
1. 一套用于分型诊断四种感染人疟原虫的探针，其特征在于，所述探针系针对恶性疟 原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的种特异性片段设计，探针5'端均加有10个 T尾，其核苷酸序列为：
所述探针可用于恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫或者其中的两种或 者三种或者四种疟原虫的聚合酶链式反应-反向斑点杂交分型诊断。
2. -种用于分型诊断四种感染人疟原虫的试剂盒，其特征在于，包括聚合酶链式反 应通用引物溶液（PM)和聚合酶链式反应预混合液（RM)，固定有各型疟原虫探针的尼龙杂 交膜（chip)，室温杂交液（Hyb)，洗液I(Wl)，洗液II(W2)，链霉亲和素标记的碱性磷酸酶 (AP)，碱性磷酸酶缓冲液（Bufferl)，显色缓冲液（Buffer2)，显色底物（NBT/BCIP)，其特征 在于，所述试剂盒可以在室温条件下进行恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、间日疟原 虫或者其中的两种或者三种或者四种疟原虫的分型诊断； 所述的聚合酶链式反应通用引物溶液（PM)，其特征在于，引物5'端均以 生物素标记，上游引物（5' -3' ：GAGGGCAAGTCTGGTGCCAG)与下游引物（5' -3' ： CATCTGAATACGAATGTCCCCAAGC)按照I: 1的比例配制而成的，引物浓度为10mol/L;所述 的固定有各虫种疟原虫探针的尼龙杂交膜（chip)，其特征在于，固定有如权利要求1所述 的四种分型诊断感染人疟原虫探针（SEQNo. 1、SEQNo. 2、SEQNo. 3、SEQNo. 4)中至少一 种探针，各型疱原虫探针的点样浓度为25-100μmol/L，优选浓度为50μmol/L，点样量为 0. 3~0, 5uL0
3. -种如权利要求2所述的用于分型诊断四种感染人疟原虫的试剂盒的使用方法，其 特征在于，包括聚合酶链式反应扩增和室温反向斑点杂交两个主要步骤，反向斑点杂交可 在室温下完成； 所述的聚合酶链式反应扩增，其特征在于，其50μL的反应体系包括：聚合酶链式反应 预混合液（RM) 25μL，DEPC水22μL，引物混合液（PM) 2μL，DNA模板1μL，阴性对照中以 DEPC水代替DNA模板；扩增程序为：94°C，3min;94°C，30s，53°C，30s，72°C，30s，共30个循 环；最后在72°C下5min延伸； 所述的室温反向斑点杂交方法，其特征在于，使用如权利要求2所述的室温杂交液 (Hyb)进行杂交，具体步骤为： (1) 将固定有分型诊断四种感染人疟原虫探针的尼龙杂交膜置于杂交袋或杂交管内， 加入300μL杂交液； (2) 带有生物素标记的扩增产物于95°C变性5min，迅速冰浴2min; (3) 向杂交液中加入30μL变性扩增产物，室温杂交3hr; (4) 弃去杂交液，用洗液I、洗液II各洗涤2次，每次5min; (5) 弃去洗液，加入1000倍稀释的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，于室温反应30min; (6) 弃去酶液，用底物缓冲液洗涤2次，每次5min; (7) 弃去底物缓冲液，加入新配制的底物，避光反应5-15min; (8) 将底物弃去，用去离子水终止反应，待膜干燥后判定结果，出现明显蓝紫色斑点的 判定为阳性结果，无斑点的判定为阴性结果。
4.如权利要求1所述的探针、如权利要求2所述的试剂盒和如权利要求3所述的用于 疟原虫诊断的聚合酶链式反应-反向斑点杂交分型诊断方法包括但不限定于采用微全分 析技术；其特征在于，待测试样浸提液的细胞裂解、核酸提取纯化、核酸扩增和检测均集成 在微全分析系统上自动完成，该微全分析系统由微膜片泵（阀）驱动，通过程序控制微膜片 泵（阀）的开启与闭合实现微流体样品的驱动控制。
【文档编号】C12Q1/68GK104450903SQ201410717439
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】邹明强, 薛强, 殷宏, 王飞, 刘翌, 马吉湘 申请人:中检国研(北京)科技有限公司