一种碱性木聚糖酶突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种碱性木聚糖酶突变体及其应用，通过对来源于芽孢杆菌的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，其耐热性、最适反应pH得到显著提高，有利于其在造纸领域的广泛应用。本发明的木聚糖酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3。本发明提供的木聚糖酶突变体XynT6最适pH值为9.0，在pH7.0-10.0范围内能保持75％以上的酶活，且突变体在碱性条件下的酶活性水平明显高于野生型；木聚糖酶突变体XynT6的最适作用温度为60℃，且在65℃条件下仍能保持80％左右的酶活，比野生型具有更强的耐热性。本发明提供的木聚糖酶突变体XynT6，能有效提高纸浆的白度，有利于造纸企业改进纸浆漂白工艺，减少化学漂白剂的使用，减轻环境污染，应用前景广阔。
【专利说明】一种碱性木聚糖酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能基因改造【技术领域】，具体涉及一种碱性木聚糖酶突变体及其应 用。 技术背景
[0002] 木聚糖酶（Xylanase)是指能专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组 酶的总称。它在饲料、烘焙、啤酒、造纸、纺织、医药及能源等领域得到了日益广泛的应用。特 别在纸浆漂白工艺中，木聚糖酶的应用能够降低含氯化合物的用量，促使纸浆中残余木质 素的降解和溶解性木质素的抽除，不但可以提高纸浆的白度和白度稳定性，改善纤维的滤 水性和造纸性能，而且可以降低后续工艺化学物质的用量，减少富含氯化物的工业废水的 排放，对有效降低环境污染，解决严重困扰造纸业的污染问题具有极大的现实意义。
[0003] 目前，以无元素氯和全无氯漂白工艺为代表的纸浆漂白已经成为世界各国造纸业 纸浆漂白发展的必然趋势，木聚糖酶酶法助漂新工艺已在欧洲和北美的30余家大型纸厂 得到应用，丹麦诺维信公司等多家酶制剂厂商，纷纷推出了专门用于纸浆漂白的木聚糖酶 和纤维素酶新产品。但目前为止，工业上用的木聚糖酶主要来自细菌和真菌，报道较多及产 酶活力较高的微生物主要是黑曲霉、木霉和青霉等真菌，它们所产的酶大多为中性偏酸的 木聚糖酶，最适反应温度大多在50°C以下。而在造纸工业中，纸浆蒸煮和漂白工艺基本都是 在高温和强碱的条件下进行，使得现有的酸性或中性木聚糖酶产品受到了极大的限制。因 此，研究开发具有优良特性的碱性木聚糖酶具有重大经济效益和社会效益，具有更广的应 用前景。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种碱性木聚糖酶突变体及其应用。本发明通过对来源于芽 孢杆菌（Bacillus Sp.)的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，其耐热性、最 适反应pH得到显著提高，有利于其在造纸领域的广泛应用。
[0005] 申请人:对芽孢杆菌木聚糖酶进行突变，经过大量的筛选，发现Q65R、F80Y、E82T、 K162H、A218S、L332H这六个突变位点能引起木聚糖酶耐热性、最适反应pH的改变，从而促 成本发明。
[0006] 本发明一方面提供了一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID N0 :1的木聚 糖酶的第65位氨基酸由Gin变为Arg，第80位氨基酸由Phe变为Tyr，第82位氨基酸由 Glu变为Thr，第162位氨基酸由Lys变为His，第218位氨基酸由Ala变为Ser，第332位 氨基酸由Leu变为His。
[0007] 上述木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO :3,其一种编码基因的核酸序列 为 SEQ ID N0 :4。
[0008] 本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO :4的木聚糖酶突变体基因的 质粒。
[0009] 将上述质粒转入毕赤酵母中进行重组表达，获得的木聚糖酶突变体耐热性、最适 反应pH得到很大提高。
[0010] 本发明提供的木聚糖酶突变体XynT6最适pH值为9. 0,在PH7. 0-10. 0范围内能保 持75%以上的酶活，且突变体在碱性条件下的酶活性水平明显高于野生型；木聚糖酶突变 体XynT6的最适作用温度为60°C，且在65°C条件下仍能保持80%左右的酶活，比野生型具 有更强的耐热性。本发明提供的木聚糖酶突变体XynT6,能有效提高纸浆的白度，有利于造 纸企业改进纸浆漂白工艺，减少化学漂白剂的使用，减轻环境污染，应用前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图 1 为 SDS-PAGE 电泳图；
[0012] 其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1为转空载体对照菌，泳道2为毕赤酵母XynT6 发酵粗酶液；
[0013] 图2为木聚糖酶突变体XynT6的发酵曲线；
[0014] 图3为木聚糖酶突变体XynT6与野生型XynAl的最适作用pH比较图；
[0015] 图4为木聚糖酶突变体XynT6与野生型XynAl的最适作用温度比较图。
【具体实施方式】
[0016] 本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook,2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献 提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载 的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体 实施例的限定。
[0017] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细描述。
[0018] 实施例1木聚糖酶基因的扩增
[0019] 根据公共基因数据库中的基因序列，优化了合成基因的密码子并人工合成碱性木 聚糖酶基因XynAl (序列为SEQ ID N0 :2)，其编码的氨基酸序列为SEQ ID N0 :1。
[0020] 采用PCR反应克隆碱性木聚糖酶基因XYNA1片段，引物和反应条件如下：
[0021] 引物 1(F) :GCGCGAAITCGCTATTACTTCTAACGAGAT
[0022] 引物 2 (R) : TAAAGCGGCCGCTTATCTAAITTCCAAGTAAT
[0023] 反应条件为：94°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸lmin，30个循环后，72°C保温 10min。琼脂糖电泳结果显示，XynAl基因为大小984bp的片段。
[0024] 实施例2木聚糖酶突变体的构建及筛选
[0025] 为了提高来源于芽孢杆菌的木聚糖酶XynAl的耐热性及最适反应pH,通过定向进 化技术对该酶进行了大量突变的筛选。
[0026] 以XynAl基因为模板，以引物1、2用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒 (Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、Notl进行酶切处理后与经同样酶切 后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培养， 待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0. ImM IPTG的LB+Amp 培养基，37°C 220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用pH 8. 0的缓冲液重悬，反复冻融破 壁，获得含有木聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。
[0027] 分别取出30 ill裂解液至两块新的96孔板，其中一块于60°C处理lOmin后，稀 释到pH 9. 0的缓冲液中，另一块不处理稀释到pH 8. 0的缓冲液中，分别加入相同pH值的 30 yl底物，于37°C反应30min后，DNS法测定生成的还原糖，不同的突变子经过高温处理后 保持的活性不同，在不同pH值下保持的活性不同。结果发现有些突变对木聚糖酶的活性没 有影响，有些突变甚至使其活性降低了，对依然保持高活性的突变子进行DNA测序，最终， 申请人:获得了能提高木聚糖酶耐热性、最适反应pH的突变组合Q65R、F80Y、E82T、K162H、 A218S、L332H。
[0028] 含Q65R、F80Y、E82T、K162H、A218S和L332H六点突变的木聚糖酶突变体，其氨基 酸序列为SEQ ID NO :3,其编码核苷酸序列为SEQ ID NO :4。
[0029] 将木聚糖酶突变体基因命名为XynT6,用引物1、2进行PCR扩增，引物两端引入 EcoR I、Not I位点。PCR反应条件为：94°C变性5min ;然后94°C变性30s，56°C复性30s， 72°C延伸lmin，30个循环后，72°C保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，XynT6基因为大 小984bp的片段。
[0030] 实施例3毕赤酵母工程菌株的构建
[0031] 将上述克隆得到的木聚糖酶突变体基因XynT6片段，通过EcoR I和Not I位点与 表达载体PPIC9K相连接，构建表达载体pPIC9K-XynT6。
[0032] 将表达质粒pPIC9K_XynT6用Sal I进行线性化，表达质粒线性化片段通过电穿孔 法转化毕赤酵母GS115,在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-XynT6,然 后在含不同浓度遗传霉素的YH)平板上筛选多拷贝的转化子。
[0033] 将一个转化子命名为毕赤酵母XynT6(Pichia pastoris XynT6)，转接于BMGY培 养基中，30°C、250rpm振荡培养Id ;再转入BMM培养基中，30°C、250rpm振荡培养；每天添加 0. 5%的甲醇，诱导表达4d ;离心去除菌体，得到含木聚糖酶XynT6的发酵上清液；将其进行 SDS-PAGE电泳检测分析，结果如图1所示：发酵上清液中重组木聚糖酶突变体XynT6的分 子量大小约为36kDa，与预期一致。
[0034] 通过上述同样的酶切连接方法将野生型木聚糖酶基因XynAl克隆到毕赤酵母 GS115宿主中，构建得到重组表达野生型木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，命名为毕赤酵母 XynAl (Pichia pastoris XynAl)。摇瓶水平发酵毕赤酵母 XynAl, 30°C、250rpm 振荡培养； 每天添加0. 5%的甲醇，诱导表达4d ;离心去除菌体，得到含重组野生型木聚糖酶XynAl的 发酵上清液。
[0035] (1)木聚糖酶活单位的定义
[0036] 在50°C、pH值为8. 0的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放 1 y mol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
[0037] (2)酶活测定方法
[0038] 取2ml浓度为1 %的木聚糖底物（pH8. 0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制），加入 到比色管中，50°C平衡10min，再加入2ml经pH8. 0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液适当稀释并 经50°C平衡好的碱性木聚糖酶酶液，混匀于50°C精确保温反应30min。反应结束后，加入 5ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加水定容至 25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值Ae。
[0039] 酶活计算公式：
【权利要求】
1. 一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO :1的 木聚糖酶的第65位氨基酸由Gin变为Arg，第80位氨基酸由Phe变为Tyr，第82位氨基酸 由Glu变为Thr，第162位氨基酸由Lys变为His，第218位氨基酸由Ala变为Ser，第332 位氨基酸由Leu变为His。
2. 如权利要求1所述的木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的突变体的氨基酸序列为 SEQ ID NO :3。
3. -种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的木聚糖酶突变体。
4. 如权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核酸序列为SEQ ID NO :4。
5. -种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求3所述的基因。
6. 权利要求1所述的木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用是用于提高纸浆的白度。
【文档编号】C12N15/81GK104450650SQ201410720240
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】徐晓东, 李冬冬, 肖志壮, 王海 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司, 潍坊康地恩生物科技有限公司