大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞的培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞的培养方法：1)取状态良好的对数生长期细胞；2)以10-30万细胞/ml培养基的比例接种于培养板内；3)间隔培养一天后，以4℃1000 rpm离心5min，弃一半上清液，重新加入等量的新干细胞培养基；4)干细胞培养2-3天后，培养基出现细胞碎片，继续隔天半量换液；5)培养一周，可见状态好的小细胞球出现；6)培养一周，待干细胞球初步形成，细胞增殖停滞；7)继续培养二周，使干细胞球基本形成。本发明从大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株中分离出来肿瘤干细胞样细胞，从而解决了肿瘤干细胞样细胞来源少的问题，能大量提供用于进一步研究。
【专利说明】大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种肿瘤干细胞样细胞的培养方法，尤其涉及一种大鼠垂体泌乳素腺 瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002] 垂体腺瘤为颅内良性肿瘤，按照内分泌激素水平分为：泌乳素腺瘤 (prolactinoma)，生长激素腺瘤（GH adenoma)，促肾上腺皮质激素释放激素腺瘤（ACTH adenoma)，促甲状腺激素腺瘤（TSH adenoma)，促性腺激素腺瘤（LH/FSH adenoma)和无功能 腺瘤（NFPA)。
[0003] 肿瘤干细胞报道主要关注恶性肿瘤，对于良性肿瘤干细胞样细胞（tumor stem-like cell)报道很少。
[0004] 目前SCI收录论文关于垂体腺瘤干细胞样细胞培养的报道有4篇，3篇从人垂体腺 瘤标本中分离培养，其中2篇为同一个课题组发表的类似结果，另一篇是从小鼠垂体腺瘤 中分离培养，但上述报道均未区分或考虑垂体腺瘤的类型。国内论文报道有2篇，但按照目 前肿瘤干细胞鉴定标准来看并不完全符合规范，均未做裸鼠种植成瘤实验。目前尚未有从 垂体腺瘤细胞株中成功分离培养肿瘤干细胞样细胞的报道。
[0005] 垂体泌乳素腺瘤约占垂体瘤的30%，大部分首选药物治疗（国际垂体协会泌 乳素腺瘤诊疗指南，Guidelines of the Pituitary Society for the diagnosis and management of prolactinomas. Cl in Endocrinol (Oxf), 2006, 65:265-273.)，接受手术的 病例相对少，同时垂体泌乳素腺瘤为良性肿瘤，手术中获取的标本体外培养，细胞生长缓 慢，且一般传3-4代后就出现生长停滞，而垂体泌乳素腺瘤干细胞样细胞需从肿瘤细胞分 离培养，这样就出现标本来源少且培养困难的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明就是针对上述问题，提出一种大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细 胞的培养方法，该方法从垂体泌乳素腺瘤细胞株中分离出肿瘤干细胞样细胞，从而为肿瘤 干细胞样细胞的进一步大量研宄奠定基础。
[0007] 为达到上述技术目的，本发明采用了大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细 胞的培养方法，具体包含下列步骤：
[0008] 1)取状态良好的对数生长期细胞，用PBS洗涤2-3次，用上述干细胞培养基重悬；
[0009] 2)以10-30万细胞/ml培养基的比例接种于培养板内，使用24孔板培养；
[0010] 3)间隔培养一天后，以4°C lOOOrpm离心5min，弃一半上清液，重新加入等量的新 干细胞培养基；
[0011] 4)干细胞培养2-3天后，培养基出现细胞碎片，继续隔天半量换液；
[0012] 5)培养一周，使状态好的小细胞球出现；
[0013] 6)继续培养一周，等干细胞球初步形成，细胞增殖停滞；
[0014] 7)继续培养二周，使干细胞球基本形成。
[0015] 在本发明的步骤2)中，以10-30万细胞/ml培养基的比例接种于培养板内，使用 6孔板培养。
[0016] 在本发明的一个优选实施方式中，所述的培养基以去内毒素型DMEM/F-12培养基 为基础培养基，含有无维生素A型B-27添加剂、青霉素-链霉素抗生素、碱性重组大鼠成纤 维细胞生长因子以及重组大鼠表皮细胞生长因子。
[0017] 在一个优选的实施方式中，其特征在于每500mL基础培养基中加入8-12mL无维生 素A型B-27添加剂、20000-3000U青霉素-链霉素抗生素、5000-15000ng碱性重组大鼠成 纤维细胞生长因子以及5000-15000ng重组大鼠表皮细胞生长因子。
[0018] 本发明从垂体泌乳素腺瘤细胞株中分离出来肿瘤干细胞样细胞，解决了来源的问 题，能大量提供用于进一步研宄。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1 :大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞培养过程中细胞形态变化
[0020] (图A)状态良好的对数生长期细胞；（图B)细胞行干细胞培养2-3天后；（图C) 细胞行干细胞培养1周后；（图D)细胞行干细胞培养2周后；（图E)细胞行干细胞培养4 周后。
[0021] 图片2大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞鉴定
[0022] (图A)细胞行干细胞培养后，流式鉴定结果显示，-SC细胞⑶133干细胞标志物阳 性比例较细胞增加；（图B)蛋白免疫印迹法结果显示，-SC细胞⑶133以及NESTIN干细胞 标志物蛋白表达水平较细胞有所增加；（图C)免疫荧光染色结果显示，-SC细胞CD133蛋白 主要表达在细胞膜上，且表达量较细胞有所增加。
【具体实施方式】
[0023] 下面采用【具体实施方式】对本发明作进一步详细地说明。
[0024] 实施例1
[0025] 1、干细胞培养基配方：
[0026]
【权利要求】
1. 一种大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞的培养方法，其特征在于，包括 如下步骤：1)取状态良好的对数生长期细胞；2)以10-30万细胞/ml培养基的比例接种于 培养板内；3)间隔培养一天后，以4°C lOOOrpm离心5min，弃一半上清液，重新加入等量的 新干细胞培养基；4)干细胞培养2-3天后，培养基出现细胞碎片，继续隔天半量换液；5)培 养一周，可见状态好的小细胞球出现；6)培养一周，待干细胞球初步形成，细胞增殖停滞； 7)继续培养二周，使干细胞球基本形成。
2. 根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤2)中，以10-30万细胞/ml培养 基的比例接种于培养板内，使用6孔板培养。
3. 根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的培养基以去内毒素型DMEM/ F-12培养基为基础培养基，含有无维生素 A型B-27添加剂、青霉素-链霉素抗生素、碱性重 组大鼠成纤维细胞生长因子以及重组大鼠表皮细胞生长因子。
4. 根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，每500mL基础培养基中加入8-12mL 无维生素 A型B-27添加剂、20000-3000U青霉素-链霉素抗生素、5000-15000ng碱性重组 大鼠成纤维细胞生长因子以及5000-15000ng重组大鼠表皮细胞生长因子。
【文档编号】C12N5/095GK104450619SQ201410759556
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】苏志鹏, 蔡霖, 陈贤斌, 陈健, 卢江龙, 王成德, 李群 申请人:温州医科大学附属第一医院