一种复合菌剂及其制产纤维素酶的方法
【专利摘要】本发明涉及一种复合菌剂及其制产纤维素酶的方法。所述复合菌剂是由缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞菌分别发酵培养后混合得到的发酵混合液。所述的复合菌剂突破细菌产胞外酶活低，真菌分解速率慢的局限，以农业废弃物-秸秆为发酵底物，采用固态发酵工艺，制备高附加值生物酶制剂，简便易行，成本低廉且可变废为宝，所得纤维素复合酶对纤维素底物的降解性能较强，为分解秸秆产纤维素酶提供关键技术，在秸秆发酵饲料及饲用酶制剂领域将有广阔的应用前景。
【专利说明】一种复合菌剂及其制产纤维素酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种复合菌剂及其制产纤维素酶的方法，属于农业发酵【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 随着畜牧业的迅猛发展，如何提高粗饲料的营养价值并增加其瘤胃消化率已成为 全球研究的热点。近年来，青贮或日粮中添加纤维素酶制剂引起了人们的广泛关注，然而受 各种因素的影响，如酶的生产成本、种类和添加量、酶的反应条件等，其推广使用尚存在一 些限制。
[0003] 对于纤维素酶的生产菌株，以往的研究多集中在纯化菌，但在以秸杆等天然木质 纤维素材料为底物时，纯化菌株定植缓慢，产酶效率低。近年来研究发现在发酵过程中将微 生物共培养能够增加纤维素酶的量，筛选构建复合系对木质纤维素进行降解和生产纤维素 酶成为研究热点。
[0004] 另外，现有的酶制剂生产工艺包括液态发酵（Submerged Fermentation, SmF)和固 态发酵（Solid-state Fermentation, SSF)。但液态发酵存在木质纤维素材料的降解难度 大，转化成本高的缺陷，因此固态发酵产酶成为具有应用前景的技术手段。
[0005] 然而现有生产纤维素酶的方法存在效率低、成本高的缺陷，远没有满足实际生产 需求,因此需要寻找一种高效的产酶菌、产酶工艺和廉价的发酵底物。
【发明内容】
[0006] 本发明第一目的是提供一种复合菌剂，以秸杆为底物，对其进行固态发酵生产木 质纤维素酶，所得纤维素酶的活力高，提高了产酶效率，降低了酶的生产成本，同时也增加 了秸杆的利用率，为秸杆等农业废弃物的利用及非常规饲料的开发和应用提供了新途径。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种复合菌剂，是由缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞菌分别接 种于培养基，发酵培养后将发酵液混合得到的发酵混合液；其中所述发酵混合液中缓纤 维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞菌的菌落形成单位数目比为20-25 :15-20 : 15-20 :40-50,菌落形成单位数目为 0· 8 X IO6-L 2 X 106CFU。
[0009] 其中，所述缓纤维梭菌（Clostridium lentocellum)，其保藏编号为ATCC 49066。
[0010] 所述解木聚糖拟杆菌（Bacteroides xylanisolvens)，其保藏编号为DSM 18836。
[0011] 所述噬细胞菌（Cytophaga sp.)，其保藏编号为ATCC13125。
[0012] 所述灰盖鬼伞菌（Coprinus cinereus)，其保藏编号为CGMCC NO. 4051。
[0013] 所述培养基为Mandels培养基，其配方如下：
[0014]
【权利要求】
1. 一种复合菌剂，其特征在于，是由缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞 菌分别接种于培养基，发酵培养后将发酵液混合得到的发酵混合液； 其中所述发酵混合液中缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞 菌的菌落形成单位数目比为20-25 :15-20 :15-20 :40-50,菌落形成单位数目为 0. 8X 106-1. 2X 106CFU； 所述发酵培养条件为：33-37°C静止培养7d。
2. 根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述缓纤维梭菌（Clostridium lentocellum)，其保藏编号为ATCC49066; 所述解木聚糖拟杆菌（Bacteroides xylanisolvens)，其保藏编号为DSM 18836; 所述噬细胞菌（Cytophaga sp.)，其保藏编号为ATCC13125; 所述灰盖鬼伞菌（Coprinuscinereus)，其保藏编号为CGMCCN0.4051。
3. 根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述培养基为Mandels培养基，其配 方如下：
同时在培养基中添加小麦結杆作为唯一的碳源，长度为2-3cm，添加量为前述培养基总 质量的1%。
4. 根据权利要求1-3任一所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂还可制成固体 剂型，所述固体复合菌剂是由上述发酵混合液与载体按〇. 8X106-1. 2X106CFU: (1 - 10)g 比例配制而得；优选所得发酵混合液与载体按IX106CFU:5g比例配制。
5. 根据权利要求4所述的复合菌剂，其特征在于，所述载体为麦饭石和/或秸杆粉。
6. -种制产纤维素酶的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 将秸杆粉碎与培养基混合，115_120°C灭菌15-30min，冷却； 2) 将权利要求1-5任一所述的复合菌剂接种到步骤1)所得体系中，每天搅拌一次， 30-35°C培养7-10天，将发酵产物真空干燥，得到固态纤维素复合酶。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述秸杆为水稻、小麦、玉米或其它木质 纤维素材料，长度< 1mm。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养基配方为（g/1):
9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述秸杆与培养基混合比例为 5-10:15-20 (g/ml)，优选为 10:15 (g/ml)。
10. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述复合菌剂接种量为每千克培养基中 菌落形成单位数目为〇. 16X106-0. 24X106CFU。
【文档编号】C12R1/645GK104403980SQ201410759440
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】王小芬, 崔宗均, 刘晶晶, 王小娟, 袁旭峰, 朱万斌 申请人:中国农业大学