抗褐飞虱主基因Bph27转育籼稻品种的分子标记方法

抗褐飞虱主基因Bph27转育籼稻品种的分子标记方法
【专利摘要】本发明公开了抗褐飞虱主基因Bph27转育籼稻品种的分子标记方法。本发明开发设计的Bph27紧密连锁分子标记引物B471和B58，能够在抗褐飞虱供体亲本Balamawee与感虫籼稻品种扩增出差异片段。通过Bph27基因位点的分子标记实现了抗褐飞虱基因Bph27的遗传转育，可准确而快速地导入所需要的片段，大大提高Bph27的选择效率，并育成抗褐飞虱籼稻新品系991RB。
【专利说明】抗褐飞虱主基因 Bph27转育籼稻品种的分子标记方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于分子遗传学领域，涉及抗褐飞虱主基因 Bph27转育籼稻品种的分子标 记方法。

【背景技术】
[0002] 褐飞風（Nilaparvata lugens Stdl )又称褐稻風，是一种世界著名的迁飞性害虫， 是水稻的主要害虫之一，严重影响水稻的产量及其品质。近年来，每年危害面积达2亿亩以 上，2005年以来更是连年大发生。2005年，我国稻飞虱危害面积达3. 86亿亩，2006、2007年 发生面积达5亿亩次。迄今，主要的防虫措施是使用化学杀虫剂，而长期大量使用化学杀虫 剂不但使环境日趋恶化，严重危害人类健康，也促使害虫对化学杀虫剂产生抗性，从而危及 到生物多样性，破坏生态平衡。因此，改变化学农药为主的防虫策略，寻求新的抗虫途径势 在必行。抗虫品种的应用通常被认为是最为经济有效的防治措施。
[0003] 二十世纪六十年代以后，亚洲各稻区相继暴发的褐飞虱为害促使遗传学家和育种 家着手筛选和利用抗褐飞虱种质资源，进行抗褐飞虱新基因的挖掘和利用，选育抗褐飞虱 水稻品种。目前，已经鉴定出28个抗褐飞虱主基因。目前发掘并定位的一些抗褐飞虱基 因，大多数都来源于野生稻或一些农艺性状相对较差的地方品种，直接利用比较困难，在一 定程度上限制了抗褐飞虱基因的育种利用。所以，首先应当将野生稻或地方品种中的抗褐 飞虱基因转育到优良的栽培品种中，创造一些优异的抗褐飞虱水稻种质，为抗褐飞虱育种 提供中间材料，才能提高抗褐飞虱育种的效率。
[0004] 虽然在过去的几十年里也相继培育了一些抗褐飞虱水稻品种，如IRRI推出了具 有Bphl基因的抗虫品种IR26,含有bph2的IR36,具有Bph3的IR56等。但由于褐飞虱对 抗虫品种具有极强的适应能力，抗虫品种推广后，褐飞虱很快就形成适应抗虫品种的种群， 导致品种抗性丧失。褐飞虱群体内存在高度的个体差异是褐飞虱对抗虫品种具有极强适 应性的关键所在，如将分布于菲律宾5个不同地理区域的褐飞虱种群分别在具有不同抗虫 基因的品种上饲养时发现，每个群体内均有一些个体能够在抗虫品种上存活和产卵。这意 味着当一个新育成的抗虫品种在田间种植时，大多数褐飞虱个体因不能适应而死亡，但有 少数个体能够正常生存和繁殖下一代，由于后代与亲本取食能力相似，群体的平均生存力 和繁殖力将随着世代的增加而增加，最终形成能够在抗虫品种上快速繁殖的褐飞虱种群。 1973年，具有Bphl基因的抗虫品种IR26推出以后，在所有种植该品种的国家和地区，褐飞 虱种群数量明显下降，然而不到两年的时间，该品种抗性退化，褐飞虱种群又显著上升，并 在IR26等具有Bphl抗性基因的品种上暴发；1976年，IRRI又推出了 IR36等具bph2抗性 基因的品种，又一次使褐飞虱种群数量下降，但数年后在具bph2抗性基因的品种上又暴发 了褐飞虱危害。因而迫切需要培育新的抗虫品种。褐飞虱生物型的变异性和抗虫性鉴定的 复杂性导致常规育种手段效率较低，抗虫育种进展缓慢。为此，利用与目标基因紧密连锁的 分子标记聚合抗虫基因并结合常规育种手段，选育持久抗性品种将成为抗褐飞虱育种的趋 势。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的是：提供了抗褐飞虱主基因 Bph27转育籼稻品种的分子标记方法， 属于分子遗传学领域。本发明开发设计的Bph27紧密连锁分子标记引物B471和B58,能够 在抗褐飞虱供体亲本Balamawee与感虫籼稻品种扩增出差异片段。通过Bph27基因位点的 分子标记实现了抗褐飞虱基因 Bph27的遗传转育，可准确而快速地导入所需要的片段，大 大提高Bph27的选择效率，促进Bph27在的利用。
[0006] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0007] 抗褐飞虱主基因 Bph27转育籼稻品种的分子标记方法，用分子标记引物B471或者 分子标记引物B58对抗褐飞虱位点Bph27进行分子标记：用分子标记引物B471扩增抗褐飞 風水稻品种Balamawee及其转育的抗褐飞風材料的DNA，获得Bph27位点标记片段大小约为 130bp ;扩增感虫籼稻品种DNA，获得标记片段大小约为120bp ;用分子标记引物B58扩增抗 褐飞風水稻品种Balamawee及其转育的抗褐飞風材料的DNA，获得Bph27位点标记片段大小 约为88bp ;扩增感虫籼稻品种DNA，获得标记片段大小约为118bp ;其中分子标记引物B471 左端引物序列如SEQ ID NO. 1所示，右端引物序列如SEQ ID NO. 2所示；分子标记引物B58 左端引物序列如SEQ ID NO. 3所示，右端引物序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0008] 用于标记抗褐飞虱主基因 Bph27的分子标记引物，选自分子标记引物B471或分子 标记引物B58中的任意一种，分子标记引物B471左端引物序列如SEQ ID NO. 1所示，右端 引物序列如SEQ ID NO. 2所示；分子标记引物B58左端引物序列如SEQ ID NO. 3所示，右端 引物序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0009] 本发明所述的分子标记引物在培育抗褐飞虱的新品系中的应用。
[0010] 所述的应用优选包括以下步骤：
[0011] 用抗褐飞風地方品种Balamawee与籼稻品种9311杂交，得到杂交F1，以杂种F 1作 母本，用9311作轮回亲本，得到回交群体BC1F1，从BC 1F1开始在苗期就用权利要求2所述的 引物对Bph27位点的标记B471和B58进行检测，BC 1F1含有Bph27位点的株系，在开花期就 作母本与背景亲本9311杂交，在每一个世代都用同样的方法，一直到BC 5F1世代，自交获得 BC5F2群体，通过分子标记方法，获得B471和B58位点纯合的单株，由该单株自交得到一个 稳定的籼稻新品系，进一步通过苗期及全生育期的褐飞虱抗性鉴定，获得携带抗褐飞虱基 因 Bph27并稳定抗褐飞風的新品系。
[0012] 所述的应用还优选包括：将获得携带抗褐飞虱基因 Bph27并稳定抗褐飞虱的新品 系与籼稻、粳稻以及育种上正在利用的常规品种配制杂交种及选育常规品种的应用方法。
[0013] 有益效果
[0014] (1)通过本发明获得与来源于籼稻品种Balamawee抗褐飞風位点Bph27紧密连锁 的分子标记。并通过大量标记的开发与筛选，获得了 Balamawee与9311等籼稻品种间具有 多态性的分子标记B471和B58。
[0015] (2)通过本发明可对Bph27抗褐飞虱位点进行籼稻品种的分子标记转育，选择的 片段位置明确，鉴定方便，准确可靠。该方法检测方便快速，不受环境影响。
[0016] (3)本发明开发设计的Bph27紧密连锁分子标记引物B471和B58,能够在抗褐飞 虱供体亲本Balamawee与感虫籼稻品种扩增出差异片段。通过Bph27基因位点的分子标 记实现了抗褐飞虱基因 Bph27的遗传转育，可准确而快速地导入所需要的片段，大大提高 Bph27的选择效率，促进Bph27在的利用。
[0017] (4)辅助育种选择目标明确，节约成本。在抗褐飞虱传统育种方法中，首先要种植 较大的次级分离群体，需要投入大量的人力，物力和财力。其次，育种的周期长，一个常规品 种的选育需要8-10年。再次，褐飞虱抗性鉴定的工作量大，可靠性差。而通过早期的育性 位点的分子标记选择，可以在较小的分离群体中，通过紧密连锁分子标记的检测，在苗期就 能鉴定出携带抗褐飞虱基因的的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高选 择效率。通过此方法，抗褐飞虱籼稻品系991RB只用了 4年时间就被选育出来了，较常规的 育种方法提前4年时间。

【专利附图】

【附图说明】
[0018] 图1利用Bph27位点紧密连锁分子标记B471进行单株选择。M为Marker ;1 :抗虫 亲本Balamawee ;2,感虫受体亲本9311 ;3-12,感褐飞虱单株；13-24 :抗褐飞虱单株。
[0019] 图2利用Bph27位点紧密连锁分子标记B58进行单株选择。M为Marker ;1 :抗虫 亲本Balamawee ;2,感虫受体亲本9311 ;3-12,感褐飞虱单株；13-24 :抗褐飞虱单株。
[0020] 图3抗褐飞虱籼稻品系991RB的苗期褐飞虱抗性鉴定。
[0021] 图4抗褐飞虱籼稻品系991RB的全生育期褐飞虱抗性鉴定。

【具体实施方式】
[0022] 材料与方法：
[0023] ( -）材料及群体构建
[0024] 抗褐飞虱品种Balamawee与02428杂交获得的F1，自交获得一个包含135个单株 的F 2初级分离群体，以及每个F2单株通过自交获得的相应的F2:3家系。进一步扩大遗传群 体，利用一个包含有18308个单株的Balamawee/02428的F 2分离群体进行Bph27的精细定 位。
[0025] (二）表型鉴定
[0026] 虫源最初采自南京近郊的水稻田，并已在台中本地1号（TNl)上饲养了 10代以 上。在本研究中，褐飞虱在TNl上繁殖，以提供鉴定所需虫源。饲养在南京农业大学的温室 内。注意防天敌和蚂蚁。
[0027] 采用苗期集团测定法进行BalamaweejZAZSJi单株和135个F2:3家系的抗虫性测 定。为确保各家系生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个家系分别播种于一 个直径8cm、高8cm，盛满实验用土的营养钵中（营养钵底部有一小孔，便于渗透吸水）。每 28个营养钵（包括亲本、抗虫对照和感虫对照各一钵）置于一个65cmX44cmX 14cm的塑料 箱内（箱内保持水层2cm左右）。每个营养钵播种35粒发芽种子。7天左右间苗，淘汰病弱 苗，保留30株整齐划一的水稻苗。每个家系种植两个重复。待苗长到两叶一心时，按8-10 头/苗的比例接入2?3龄褐飞虱若虫。当感虫亲本TNl全部枯死时，参照IRRI(1988)和 Athwal et al. (1971)的方法，对每个单株进行0-9级评级。通过加权平均计算各家系（品 种）抗虫指数。
[0028](二）分子标记分析及连锁分析
[0029] DNA样品的制备参照Dellaporta等（1983)的方法。提取的DNA溶解在TE缓冲液 里（IOmM Tris base, 0· ImM EDTA)，用 MBA 2000UV/VIS 分光光度计（Perkin Elemer Co.) 进行DNA质量和浓度检测。每份DNA均用dd H20稀释成20ng/ μ 1的浓度，作为PCR分析 的模板。
[0030] SSR分析参照 Chen et al (1997)的程序。10 μ 1 反应体系包括：IOmM Tris-HCl pH 8·3,50mMKCl，l·5mMMgC12,50μMdNTPs，0·2μM引物，0·5UTaqpolymerase(TaKaRa，大 连）和 20ng DNA模板。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc. )PCR仪上进行：94°C 4min ; 94°C lmin, 55°C lmin，72°C I. 5min，35 个循环；72°C 7min。扩增产物用 8% 的非变性 PAGE 胶分离，通过银染显色。
[0031] 利用本实验室现有的均勻分布于水稻12条染色体上的SSR标记对亲本Balamawee 和02428进行多态性检测，然后用在亲本间具有多态性差异的标记对F2群体进行初步连 锁分析，初筛得到的连锁标记进一步利用F 2定位群体进行分子标记基因型的分析，并对所 得数据利用MAPMAKER/3. 0分析软件进行褐飞虱抗性与SSR标记的分离分析（Lander et al. 1987)。并将Kosambi函数转换为遗传距离（cM)，绘制连锁图谱。根据重组单株的信息 将基因定位在位置固定的分子标记之间，实现基因的染色体的初步定位。
[0032] (三）Bph27的分子标记辅助选择利用
[0033] 用抗褐飞虱地方品种Balamawee与籼稻品种9311杂交，得到杂交Fl，以杂种Fl作 母本，用9311作轮回亲本，得到回交群体BC 1F1，从BC1F1开始在苗期就用Bph27位点的标记 B471和B58进行检测，BC1F1含有Bph27位点的株系，在开花期就作母本与背景亲本9311杂 交，在每一个世代都用同样的方法，一直到BC5F1世代，自交获得BC 5F2群体，通过分子标记 方法，获得B471和B58位点纯合的单株，由该单株衍生得到一个稳定的籼稻新品系，进一步 通过苗期及全生育期的褐飞虱抗性鉴定。
[0034] 结果与分析：
[0035] 苗期集团测定显示Balamawee和02428的危害级别分别为0和8. 3,这表明 Balamawee极抗褐飞虱而02428感褐飞虱。F1植株的危害级别为0. 7,对褐飞虱表现高抗。 这表明Balamawee的抗虫性由显性基因控制。
[0036] 135个F2:3家系进行抗褐飞虱表型鉴定，危害级别频率分布呈连续分布，最小为0， 最大为9,危害级别〈3为高抗，>7为高感，大于等于3小于等于7为中抗。135个F 2:3家系 表现型可以根据其对褐飞虱的危害级别分为抗虫、抗感分离和感虫三种类型，而相应的F2 单株的基因型则由相应F2:3家系的表型值推测得到，分别为记为RR(纯合抗虫）、Rr (杂合 抗虫）和rr (纯合感虫）三种。135个F2:3家系的抗感分离为32:67:36。卡方测验表明,F2 群体对褐飞風的抗感分离符合1:2:1的比例（X2atl5 = 0. 249 < 5. 99)。这表明Balamawee 的抗褐飞虱的表型是由一个显性单基因控制的。
[0037] 连锁分析发现位于第四染色体长臂上的SSR标记B5742与褐飞虱抗性表型显著相 关。进一步选用位于B5742周围且在亲本间具有多态的其他SSR标记进行连锁分析，构建连 锁图谱。将Balamawee中的抗褐飞虱基因定位在B471和B5742之间，分别与之相距18. 2cM 和 4. 7cM。
[0038] 进一步在初定位区间根据Nipponbare和93-11的序列自行开发了一些基于PCR 的InDel标记共有13个。先利用1172个F2单株在B471和B5742SSR标记间筛选到了 46 个交换单株，结合表型数据和重组数据进一步将该基因锁定在j20690和B13之间。利用这 两个标记对17136个&群体进行PCR分析，得到了 117株重组个体。利用这117株重组个 体，结合表型数据和重组数据该基因锁定在B52和B20之间，两侧分别有4和7株交换。根 据Nipponbare的序列，该区间物理距离约63Kb。
[0039] 为了利用分子标记辅助选择将Bph27转入籼稻品种9311，首选对自行开发的20对 与Bph27紧密连锁的分子标记进行Balamawee与9311间的多态性筛选，其中位于Bph27两 侧的精密连锁标记B471与B58在Balamawee与9311间的具有明显的多态性（图1，图2)。 随后确定利用B471与B58开展Bph27在籼稻中的分子标记辅助选择应用。同时利用抗褐 飞虱地方品种Balamawee与籼稻品种9311杂交，得到杂交F 1，以杂种F1作母本，用9311作 轮回亲本，得到回交群体BC1F 1，从BC1F1开始在苗期就用Bph27位点的标记B471和B58进行 检测，BC 1F1含有Bph27位点的株系，在开花期就作母本与背景亲本9311杂交，在每一个世代 都用同样的方法，一直到BC 5F1世代，自交获得BC5F2群体，通过分子标记方法，获得B471和 B58位点纯合的单株，由该单株衍生得到一个稳定的籼稻新品系，进一步通过苗期及全生育 期的褐飞虱抗性鉴定，表明该品系无论苗期还是全生育期均具有较高的褐飞虱的抗性（图 3,图4)，将该品系暂定名为991RB。
【权利要求】
1. 抗褐飞虱主基因Bph27转育籼稻品种的分子标记方法，其特征在于，用分子标记引 物B471或者分子标记引物B58对抗褐飞風位点Bph27进行分子标记：用分子标记引物B471 扩增抗褐飞風水稻品种Balamawee及其转育的抗褐飞風材料的DNA，获得Bph27位点标记片 段大小约为130bp ;扩增感虫籼稻品种DNA，获得标记片段大小约为120bp ;用分子标记引物 B58扩增抗褐飞虱水稻品种Balamawee及其转育的抗褐飞虱材料的DNA，获得Bph27位点标 记片段大小约为88bp ;扩增感虫籼稻品种DNA，获得标记片段大小约为118bp ;其中分子标 记引物B471左端引物序列如SEQ ID NO. 1所示，右端引物序列如SEQ ID NO. 2所示；分子 标记引物B58左端引物序列如SEQ ID NO. 3所示，右端引物序列如SEQ ID NO. 4所示。
2. 用于标记抗褐飞虱主基因Bph27的分子标记引物，其特征在于选自分子标记引物 B471或分子标记引物B58中的任意一种，分子标记引物B471左端引物序列如SEQ ID NO. 1 所示，右端引物序列如SEQ ID NO. 2所示；分子标记引物B58左端引物序列如SEQ ID NO. 3 所示，右端引物序列如SEQ ID NO. 4所示。
3. 权利要求2所述的分子标记引物在培育抗褐飞虱的新品系中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于包括： 用抗褐飞虱地方品种Balamawee与籼稻品种9311杂交，得到杂交Fi，以杂种Fi作母本， 用9311作轮回亲本，得到回交群体BCR，从BC^开始在苗期就用权利要求2所述的引物 对Bph27位点的标记B471和B58进行检测，BC^含有Bph27位点的株系，在开花期就作母 本与背景亲本9311杂交，在每一个世代都用同样的方法，一直到BC^世代，自交获得BC5F2群体，通过分子标记方法，获得B471和B58位点纯合的单株，由该单株自交得到一个稳定的 籼稻新品系，进一步通过苗期及全生育期的褐飞虱抗性鉴定，获得携带抗褐飞虱基因Bph27 并稳定抗褐飞虱的新品系。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于还包括：将获得携带抗褐飞虱基因Bph27 并稳定抗褐飞虱的新品系与籼稻、粳稻以及育种上正在利用的常规品种配制杂交种及选育 常规品种的应用方法。
【文档编号】C12N15/11GK104388576SQ201410759318
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】万建民, 刘裕强, 陈亮明, 江玲, 何俊, 刘艳玲, 仇泽宇, 赵志刚, 王益华, 刘喜, 刘世家, 田云录 申请人:南京农业大学