含有miRNA‑34的饲料、制作方法及其抗病毒抗癌作用与流程

本发明涉及了一种饲料、制作方法及其作用，尤其是涉及了一种含有miRNA-34的饲料、制作方法及其抗病毒抗癌作用。

背景技术：

目前主要通过注射microRNA模拟物及前体的方式，使microRNA维持过表达水平。这两种方法价格昂贵，所需剂量高，不适用于实际应用。近年来，已有报道表明，人通过食入大米，在血液中可以检测出大米特有的microRNA，并且此microRNA可以调控人低密度脂蛋白受体衔接蛋白1基因。另外，通过灌胃方式把中药金银花汤剂中的金银花microRNA灌入小鼠循环系统，可以有效抑制小鼠体内的流感病。但是，目前还没有制做出来一种产品能有效地通过喂食microRNA的方式来对抗疾病。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供了一种含有miRNA-34的饲料、制作方法及其抗病毒抗癌作用，具体是利用microRNA可以跨物种调控的机制来制作含有microRNA的饲料，方便、经济、安全，通过喂食该饲料达到抗病毒抗癌症的目的，从而有效地通过喂食microRNA的方式来对抗疾病。

本发明解决上述问题所采用的技术方案包括以下步骤：

一、一种含有miRNA-34的对虾饲料制作方法，包括以下步骤：

1)把用于表达成熟miRNA-34的DNA序列构建到LITMUS 38i载体质粒上，构建成功的质粒转入RNAse III缺陷型的大肠杆菌菌株HT115中，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTTG)诱导大量转录获得miRNA-34；

所述的LITMUS 38i载体质粒为2814个碱基，可转录双链RNA的载体。

2)把步骤1)产生miRNA-34的菌体灭活，把灭活的菌体拌入对虾饲料中，加入鱼饵饲料粘合剂；

3)均匀搅拌饲料后，置于烘箱中烘干，获得对虾饲料。

所述的用于表达成熟miRNA-34的DNA序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，miRNA-34的碱基序列为SEQ ID NO.3。

所述步骤2)菌体灭活是在60℃水浴下灭活约90min，所述步骤3)烘箱中烘干是在60℃烘箱中烘干1h。

所述步骤1)的大肠杆菌菌株HT115是在37℃下培养，加入IPTTG的工作浓度为1mM。

所述步骤2)灭活的菌体拌入对虾饲料后，菌含量为每克虾饲料中含有的菌个数是3×10¹²数量级，鱼饵饲料粘合剂加入量为虾饲料质量的3％。

二、一种含有miRNA-34的对虾饲料，是采用上述方法制备获得的虾饲料。

三、所述含有miRNA-34的对虾饲料在抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)中的应用。

四、一种含有miRNA-34的鼠饲料制作方法，包括以下步骤：

步骤一、用权利要求1-4任一所述方法制备获得的虾饲料持续喂食对虾，对虾采用日本对虾，是在27℃养殖；

步骤二、收集对虾肌肉，加热2min后，拌入到裸鼠饲料中，烘箱中烘干约2-3h，完成获得鼠饲料。

所述步骤二中的收集对虾肌肉是在喂食对虾的3-5天后收集。

所述步骤二中对虾肌肉拌入到裸鼠饲料后，对虾肌肉与裸鼠饲料的质量比为1:1。

五、一种含有miRNA-34的鼠饲料，是采用上述方法制备获得的鼠饲料。

六、所述含有miRNA-34的鼠饲料在抗乳腺癌中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

本发明发现了miR-34可跨物种调控的机制，并且建立了方便、经济、安全的制备方法，使日本对虾及乳腺癌细胞中维持miR-34的过表达水平，从而达到既可以抗病毒又可以治疗癌症的目的，本发明解决了现有传统的注射microRNA模拟物及前体的方式所带来的经济压力。

附图说明

图1是实施例1通过Northern blot检测miR-34在菌里的表达水平。

图2是实施例1通过Northern blot检测miR-34在对虾中的表达水平。

图3是实施例1对白斑综合征病毒(WSSV)复制的影响结果检测图。

图4是实施例1检测喂食对虾含有miR-34的对虾饲料后，对对虾死亡率的影响结果检测图。

图5是实施例2检测miR-34对乳腺癌细胞迁移的影响结果检测图。

图6是实施例2动物活体成像以及化学荧光信号结果图。

大肠杆菌菌株HT115已于2016年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.13128。分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明的实施例如下：

实施例的LITMUS 38i载体质粒购买于New England Biolabs公司。其制备过程如下：

a)在上海捷瑞公司合成带有酶切位点(Hind III及EcoRI)的成熟miRNA-34的单链DNA序列，两条序列分别是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，使用购买于日本Takara公司的退火缓冲液，合成双链的成熟miRNA-34的序列。

b)使用购买于New England Biolabs公司的Hind III及EcoRI内切酶37℃处理LITMUS 38i载体质粒1个小时。即在SEQ ID NO.1的序列5’-GTAAAGCTTTGGCAGTGTGGTTAGCTGGTTGTGAATTCCTG-3’及SEQ ID NO.2的序列5’-CAGGAATTCACAACCAGCTAACCACACTGCCAAAGCTTTAC-3’进行酶切，下划线为Hind III及EcoRI的酶切位点。

c)将步骤a)和b)中得到的带有酶切位点的成熟的双链miRNA-34以及酶切后的LITMUS 38i载体在T4DNA连接酶(Takara,日本)的作用下连接。

d)将步骤c)中连接成功的载体转入大肠杆菌菌株HT115中。

以下实施例的大肠杆菌菌株HT115已于2016年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.13128。并且也可以从BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买获得，菌株为CGC菌株为#4597，BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心的CGC菌株为#4597对外开放可通过公众渠道购买获得。

实施例1

1、把如SEQ ID NO.1的用于表达成熟miRNA-34的DNA序列构建到LITMUS 38i载体质粒上，构建成功的质粒转入在37℃下培养的RNAse III缺陷型的大肠杆菌菌株HT115中，加入浓度为1mM的IPTTG诱导大量转录获得miRNA-34，miRNA-34的碱基序列为SEQ ID NO.3；

通过Northern blot检测miR-34在菌里的表达水平如图1所示，图中结果表明，构建成功的质粒转入在37℃下培养的RNAse III缺陷型的大肠杆菌菌株HT115中，加入浓度为1mM的IPTTG可以诱导转录大量miR-34。

2、把步骤1)产生miRNA-34的菌体在60℃水浴下灭活约90min，把灭活的菌体拌入对虾饲料中，拌入后每克虾饲料中含有的菌个数是3×10¹²数量级，加入3％虾饲料质量的鱼饵饲料粘合剂；

3、均匀搅拌饲料后，在60℃烘箱中烘干1h，获得对虾饲料。

在持续3天喂食对虾含有miR-34的对虾饲料后，检测miR-34在对虾中的表达水平。对虾体内的表达量结果如图2所示，图中显示出miR-34在对虾体内的表达量随着喂食时间的延长而增加。

检测获得对白斑综合征病毒(WSSV)复制的影响如图3所示，图中表明喂食对虾含有miR-34的对虾饲料后，可以显著抑制白斑综合征病毒(WSSV)的复制。

检测获得对对虾死亡率的影响如图4所示，图中表明喂食对虾含有miR-34的对虾饲料后，可以显著降低对虾死亡率。

实施例2

1、用实施例1制备获得的虾饲料持续喂食对虾，对虾采用日本对虾，是在27℃养殖；

2、喂食3-5天后收集对虾肌肉，加热2min后，拌入到裸鼠饲料中，对虾肌肉与裸鼠饲料的质量比为1:1，烘箱中烘干约2-3h，完成获得鼠饲料。

通过Northern blot检测miR-34在对虾肌肉里的表达水平如图5所示，图中显示，用实施例1制备获得的虾饲料持续喂食对虾3天后，日本对虾体内的miR-34水平与直接注射miR-34的方法相比，可以更有效地使miR-34在对虾体内表达水平升高。

3、检测miR-34对乳腺癌细胞迁移的影响。

自裸鼠尾静脉注射乳腺癌细胞开始，乳腺癌细胞采用MDA-MB-231，持续喂食加工后的裸鼠饲料(拌入miR-34过表达的对虾肌肉的裸鼠饲料)，约5-7周。

裸鼠尾静脉注射乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞个数为3×10⁵，MDA-MB-231是迁移能力较强的乳腺癌细胞，且动物实验中把荧光素酶(luciferase)构建到MDA-MB-231细胞的基因组上。动物活体成像以及化学荧光信号结果如图6所示，结果显示miR-34能显著抑制乳腺癌的迁移。

本发明涉及的遗传序列如下：

SEQ ID NO.1：用于表达成熟miRNA-34的DNA序列第一琏

来源：人工合成

序列：5’-GTAAAGCTTTGGCAGTGTGGTTAGCTGGTTGTGAATTCCTG-3’

SEQ ID NO.2：用于表达成熟miRNA-34的DNA序列第二琏

来源：人工合成

序列：5’-CAGGAATTCACAACCAGCTAACCACACTGCCAAAGCTTTAC-3’

SEQ ID NO.3：miRNA-34的碱基序列

来源：miRNA-34

序列：5’-UGGCAGUGUGGUUAGCUGGUUGU-3’。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 含有miRNA-34的饲料、制作方法及其抗病毒抗癌作用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtaaagcttt ggcagtgtgg ttagctggtt gtgaattcct g 41

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

caggaattca caaccagcta accacactgc caaagcttta c 41

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> miRNA-34

<400> 3

uggcagugug guuagcuggu ugu 23