用于使益生菌在使细菌于肠道中定植用途的固体颗粒上生长成益生菌生物膜的系统和方法与流程

本申请要求2015年5月11日提交的美国临时专利申请系列No.62/159,846，和2015年5月11日提交的美国临时专利申请系列No.62/159,849的优先权，所述文件的全部内容以引用方式全文并入本文。

技术领域

本发明涉及用于使至少一种细菌菌株以生物膜形式生长和囊封的系统和方法，其被构造成使细菌生物膜在胃肠道中以pH依赖的形式靶向释放。

发明概述

在一个方面中，本发明提供了一种方法，其中所述的方法形成生物膜，其中所述的生物膜包含附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体，其中所述的生物膜被构造成当被有需要的受试对象吸收时，在至少5天内在所述的受试对象的肠道中定植；所述的方法包括：

a.获得包含至少一种细菌菌株的群体；

b.使用所述的包含至少一种细菌菌株的群体接种于包含颗粒的生长介质中；

c.使所述的颗粒与包含至少一种细菌菌株的群体温育足以使所述的至少一种细菌菌株的群体附着在所述的颗粒上的时间；以及

d.在生长介质上将附着在所述的颗粒上的包含至少一种细菌菌株的群体培养足以形成生物膜的时间。

在一个实施方案中，使用化合物囊封附着在颗粒上的包含至少一种细菌菌株群体的生物膜，其被构造成在动物的肠内所具有的pH下释放至少一种细菌菌株。

在一个实施方案中，所述的化合物为藻酸盐，其中所述的化合物被构造成在动物的肠内所具有的pH下释放至少一种细菌菌株。

在一个实施方案中，在生长介质中在流动条件下培养附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体。

在一个实施方案中，在生长介质中在静态条件下培养附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体。

在一个实施方案中，首先在生长介质中在静态条件下培养附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体，然后在生长介质中在流动条件下培养。

在一个实施方案中，在无氧条件下培养附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体。

在一个实施方案中，在需氧条件下培养附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体。

在一个实施方案中，所述的颗粒是多孔的，并且选自：种子、磷酸二钙、粘土、沙子和纤维素。

在一个实施方案中，包含至少一种细菌菌株的群体衍生自肠道微生物。

在一个实施方案中，包含至少一种细菌菌株的群体为胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

在一个实施方案中，包含至少一种细菌菌株的群体为果实醋杆菌(Acetobacter pomorum)。

在一个实施方案中，通过所述的方法形成的生物膜被构造成使细菌生物膜在胃肠道中以pH依赖的形式靶向释放。

在一个实施方案中，所述的生物膜包含2种或多种细菌菌株。

附图简述

图1示出本发明的示例性实施方案的示意图，其示出根据本发明的一些实施方案，根据所述的方法使用的流动系统。

图2A至2C示出通过根据本发明的一些实施方案的方法形成的一些示例性生物膜实施方案的图像。

图3示出根据本发明的一些实施方案的生物膜的耐酸性。

图4示出根据本发明的一些实施方案的另一种生物膜的耐酸性。

图5示出根据本发明的一些实施方案的生物膜对冻干的耐受性。

图6示出根据本发明的一些实施方案的另一种生物膜的耐酸性。

图7示出使用所示的组合物，根据本发明的一些实施方案的生物膜定殖于动物模型肠道的能力。

图8示出细菌由根据本发明的一些实施方案的生物膜上pH依赖性的释放。

图9示出根据本发明的一些实施方案的另一种生物膜定植于动物模型肠道的能力。

图10示出与使用另一种方法形成的其他生物膜相比，根据本发明的一些实施方案的另一种生物膜定植于动物模型肠道的能力。

发明详述

为了本发明公开的清楚起见并且不进行限定，本发明的发明详述分成以下几个小部分，其中描述或说明了本发明的某些特征、实施方案或应用。

在整个说明书和权利要求书中，以下术语采用与本发明确切相关的含义，除非内容中另外明确地指出。如本文所用，短语“在一个实施方案中”和“在一些实施方案中”不一定是指相同的实施方案，但是其可以是相同的。此外，如本文所用，短语“在另一个实施方案中”和“在一些其他的实施方案中”不一定是指不同的实施方案，但是其可以是不同的。因此，如下文所述，本发明的多个实施方案可以在不脱离本发明的范围或精神的条件下容易地结合。

此外，如本文所用，术语“或”是包含性的“或”操作术语(operator)，并且相当于术语“和/或”，除非内容中另外明确地指出。术语“基于……”不是包含性的，并且允许基于未描述的其他的因素，除非内容中另外明确地指出。此外，在整个说明书中，“a”、“an”和“the”的含义包括复数参照物。“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。

在一些实施方案中，本发明涉及用于使至少一种细菌菌株以生物膜形式生长和囊封的系统和方法，其被构造成细菌生物膜在胃肠道中以pH依赖的方式靶向释放。

在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述的方法形成生物膜，其中所述的生物膜包含附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体，其中所述的生物膜被构造成当被有需要的受试对象吸收时，在至少5天内在所述的受试对象的肠道中定植；所述的方法包括：

a.获得包含至少一种细菌菌株的群体；

b.使用所述的包含至少一种细菌菌株的群体接种于包含颗粒的生长介质中；

c.使所述的颗粒与包含至少一种细菌菌株的群体温育足以使所述的至少一种细菌菌株的群体附着在所述的颗粒上的时间；以及

d.在生长介质上将附着在所述的颗粒上的包含至少一种细菌菌株的群体温育足以形成生物膜的时间。

在一些实施方案中，足以使至少一种细菌菌株的群体附着在颗粒上的时间为2小时至12小时。在一些实施方案中，足以使至少一种细菌菌株的群体附着在颗粒上的时间为2小时。在一些实施方案中，足以使至少一种细菌菌株的群体附着在颗粒上的时间为4小时。在一些实施方案中，足以使至少一种细菌菌株的群体附着在颗粒上的时间为6小时。在一些实施方案中，足以使至少一种细菌菌株的群体附着在颗粒上的时间为8小时。在一些实施方案中，足以使至少一种细菌菌株的群体附着在颗粒上的时间为10小时。在一些实施方案中，足以使至少一种细菌菌株的群体附着在颗粒上的时间为12小时。

在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为12小时至48小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为12小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为14小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为16小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为18小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为20小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为22小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为24小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为26小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为28小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为30小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为32小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为34小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为36小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为38小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为40小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为42小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为44小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为46小时。在一些实施方案中，足以形成生物膜的时间为48小时。

在一些实施方案中，在生长介质中在流动条件下培养附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体。如本文所用，术语“流动条件”是指与附着于表面上的细菌有关的培养介质的移动，其中培养介质的移动在细菌上施加剪切力。

不想被任何特定的理论所限定，在流动条件下培养附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体在生长生物膜上创造了均衡的温和的剪切力，并且增加了生物膜的快速创建(例如与典型的静态生长方法相比，更短的时间)。在一些实施方案中，流动系统允许将新的培养介质引入至生长生物膜中，并且除去细菌废物。

在一些实施方案中，流动条件包括流动速率为10ml/小时至100ml/小时。在一些实施方案中，流动条件包括流动速率为20ml/小时。在一些实施方案中，流动条件包括流动速率为30ml/小时。在一些实施方案中，流动条件包括流动速率为40ml/小时。在一些实施方案中，流动条件包括流动速率为50ml/小时。在一些实施方案中，流动条件包括流动速率为60ml/小时。在一些实施方案中，流动条件包括流动速率为70ml/小时。在一些实施方案中，流动条件包括流动速率为80ml/小时。在一些实施方案中，流动条件包括流动速率为90ml/小时。在一些实施方案中，流动条件包括流动速率为100ml/小时。在一些实施方案中，流动条件包括流动速率为10ml/小时。

在一些实施方案中，流动条件包括在90至150rpm下摇动细菌的培养物。在一些实施方案中，流动条件包括在100rpm下摇动细菌的培养物。在一些实施方案中，流动条件包括在110rpm下摇动细菌的培养物。在一些实施方案中，流动条件包括在120rpm下摇动细菌的培养物。在一些实施方案中，流动条件包括在130rpm下摇动细菌的培养物。在一些实施方案中，流动条件包括在140rpm下摇动细菌的培养物。在一些实施方案中，流动条件包括在150rpm下摇动细菌的培养物。

在一些实施方案中，在流动条件下培养附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体使得与典型的方法相比，在更短的时间内(例如但不限于5,10,20,25,50％更短的时间)产生更强健的且健康的生物膜。在一些实施方案中，与其他培养方法相比时，所得的生物膜对严厉的条件具有增加的顺应力(resilience)，并且在本发明中进一步详细描述。

参见图1，示出本发明的示例性实施方案的示意图，其示出根据本发明的一些实施方案的流动系统。参见图1，所述的系统包括容器，其容纳用于生物膜培养的固体颗粒，生长介质来源，将生长介质导入和导出容器的管，以及使介质移动通过管的泵。由容器得到的流体排出物可以返回至介质储存器用于再循环，或者可以排放掉。在一些实施方案中，这种流动系统可以关闭、打开或半关闭。图1中顺时针移动的箭头表示流动方向，并且仅是示意性目的。

在一些实施方案中，在生长介质中在静态条件下培养附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体。如本文所用，术语“静态条件”是指其中在细菌上未施加剪切力的培养条件。

在一些实施方案中，首先在生长介质中在静态条件下培养附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体，然后在生长介质中在流动条件下培养。

在一些实施方案中，在无氧条件下培养附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体。如本文所用，术语“无氧条件”是指包括缺乏游离或结合氧的培养条件。

在一些实施方案中，在需氧条件下培养附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体。如本文所用，术语“需氧条件”是指包括存在游离或结合氧的培养条件。

颗粒

在一些实施方案中，所述的颗粒是多孔的，并且选自：种子、磷酸二钙、粘土、沙子和纤维素。

在一些实施方案中，种子选自：石榴种子和百香果种子。在一些实施方案中，种子被压碎。

在一些实施方案中，纤维素颗粒包括以商品名出售的纤维素。在一些实施方案中，纤维素颗粒包括以商品名出售的纤维素。

在一些实施方案中，在所述的方法中大量的颗粒用于形成根据本发明的一些实施方案的生物膜。在一些实施方案中，颗粒的直径范围为5微米至1cm。在一些实施方案中，颗粒的直径为5微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为10微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为15微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为20微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为30微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为40微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为50微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为60微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为70微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为80微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为90微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为100微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为200微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为300微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为400微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为500微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为600微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为700微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为800微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为900微米。在一些实施方案中，颗粒的直径为1cm。

细菌菌株

在一些实施方案中，包含至少一种细菌菌株的群体衍生自肠道菌群。

在一些实施方案中，包含至少一种细菌菌株的群体为益生菌菌株。如本文所用，术语“益生的”是指刺激微生物有机体生长的细菌菌株，特别是具有有利性质的那些(例如肠道菌群的那些)。

在一些实施方案中，包含至少一种细菌菌株的群体为胚牙乳杆菌。

在一些实施方案中，包含至少一种细菌菌株的群体为果实醋杆菌。

在一些实施方案中，通过所述的方法形成的生物膜被构造用于使细菌生物膜在胃肠道中以pH依赖的方式靶向释放。

在一些实施方案中，所述的生物膜包含2株或多株细菌。

图2A示出通过本发明的方法形成的生物膜的一些示例性实施方案的图像。在一些实施方案中，已经测试适用于使益生菌生长的多种类型的固体颗粒，并且其中示出结果。图2A示出在不同的固体颗粒上生长的胚牙乳杆菌生物膜的电子显微图像，例如百香果种子、压碎的石榴种子、斑脱土粘土、沙子颗粒、白色粘土、SOLKA纤维、磷酸二钙(DCP)、AVICEL。除了白色粘土以外，细菌在所有类型的颗粒上生长。

图2B示出通过本发明的方法形成的生物膜的一些示例性实施方案的图像，其示出果实醋杆菌在压碎的百香果种子、压碎的石榴种子和沙子上的生物膜生长。果实醋杆菌在石榴种子上生长并形成生物膜。但是，在沙子上观察到极少的生长。果实醋杆菌在百香果种子上不生长。所测试的其他细菌物种，例如假单胞菌属的菌种，不能在所测试的固体颗粒上生长，如图2C中所示。

不被理论所束缚，不同的颗粒为在其上生长的细菌提供不同的微环境，例如孔径、表面粗糙度、颗粒中可利用的营养物、粘性、表面电荷等，其可以影响不同细菌在不同种类的颗粒上附着和生长的能力。

在本发明的方法的一些实施方案中，该方法形成了包含至少2种益生菌菌株的生物膜(例如但不限于2,3,4,5,6,7,8,9,10等)，其中所述的生物膜是使用至少2种不同的颗粒的组合而形成的(例如但不限于百香果种子、压碎的石榴种子等)。在一些实施方案中，为了创建这种组合，根据用于形成生物膜的菌株(多种)来选择生长条件(例如但不限于颗粒(多种)的类型)。在示例性实施方案中，如果2种细菌菌株最终结合而形成生物膜，则使用最适用于各种菌株生长的颗粒使各种细菌菌株生长。在一些实施方案中，当2种或多种细菌菌株分开生长时，细菌菌株在囊封过程中结合。

处理

在一些实施方案中，将生物膜给予有需要的动物，从而使用生物膜定殖于动物的肠道。

在一些实施方案中，使用化合物囊封生物膜，其中所述的生物膜包含附着在颗粒上的至少一种细菌菌株的群体，其被构造成在动物的肠内所具有的pH下释放至少一种细菌菌株。

在一些实施方案中，被构造成在动物的肠内所具有的pH下释放至少一种细菌菌株的化合物为藻酸盐。

在一些实施方案中，动物的肠内所具有的pH为pH 8。

在一些实施方案中，将生物膜以足以定植于肠道的量给予有需要的动物。在一些实施方案中，定植是通过在给予后至少5天，在动物的粪便中存在细菌的至少一个群体证实的。

在一些实施方案中，由生物膜衍生的定植的细菌可以抑制哺乳动物肠道达至少1周(例如但不限于2,3,4,5,6,7,8,9,10等周)。在一些实施方案中，衍生自生物膜的定植的细菌保持在哺乳动物的肠道中，即，在3天后不会死亡。

在一些实施方案中，在1至5天内足以定植肠道中的量为2x10⁴至2x10⁹细菌/天。在一些实施方案中，在1至5天内足以定植肠道中的量为2x10⁴至2x10⁶细菌/天。

在一些实施方案中，5天内足以定植于肠道的量为2x10⁴细菌/天。在一些实施方案中，5天内足以定植于肠道的量为2x10⁵细菌/天。在一些实施方案中，5天内足以定植于肠道的量为2x10⁶细菌/天。在一些实施方案中，5天内足以定植于肠道的量为2x10⁷细菌/天。在一些实施方案中，5天内足以定植于肠道的量为2x10⁸细菌/天。在一些实施方案中，5天内足以定植于肠道的量为2x10⁹细菌/天。

在一些实施方案中，4天内足以定植于肠道的量为2x10⁴细菌/天。在一些实施方案中，4天内足以定植于肠道的量为2x10⁵细菌/天。在一些实施方案中，4天内足以定植于肠道的量为2x10⁶细菌/天。在一些实施方案中，4天内足以定植于肠道的量为2x10⁷细菌/天。在一些实施方案中，4天内足以定植于肠道的量为2x10⁸细菌/天。在一些实施方案中，4天内足以定植于肠道的量为2x10⁹细菌/天。

在一些实施方案中，3天内足以定植于肠道的量为2x10⁴细菌/天。在一些实施方案中，3天内足以定植于肠道的量为2x10⁵细菌/天。在一些实施方案中，3天内足以定植于肠道的量为2x10⁶细菌/天。在一些实施方案中，3天内足以定植于肠道的量为2x10⁷细菌/天。在一些实施方案中，3天内足以定植于肠道的量为2x10⁸细菌/天。在一些实施方案中，3天内足以定植于肠道的量为2x10⁹细菌/天。

在一些实施方案中，2天内足以定植于肠道的量为2x10⁴细菌/天。在一些实施方案中，2天内足以定植于肠道的量为2x10⁵细菌/天。在一些实施方案中，2天内足以定植于肠道的量为2x10⁶细菌/天。在一些实施方案中，2天内足以定植于肠道的量为2x10⁷细菌/天。在一些实施方案中，2天内足以定植于肠道的量为2x10⁸细菌/天。在一些实施方案中，2天内足以定植于肠道的量为2x10⁹细菌/天。

在一些实施方案中，1天内足以定植于肠道的量为2x10⁴细菌/天。在一些实施方案中，1天内足以定植于肠道的量为2x10⁵细菌/天。在一些实施方案中，1天内足以定植于肠道的量为2x10⁶细菌/天。在一些实施方案中，1天内足以定植于肠道的量为2x10⁷细菌/天。在一些实施方案中，1天内足以定植于肠道的量为2x10⁸细菌/天。在一些实施方案中，1天内足以定植于肠道的量为2x10⁹细菌/天。

在一些实施方案中，在单一颗粒上给予足够的量。备选地，在多个颗粒上给予足够的量。

在一些实施方案中，将足够的量与食物混合并吸收。

在一些实施方案中，在生物膜经培养后即刻将该生物膜给予动物。备选地，生物膜在给予之前可以储存。生物膜可以冷冻储存，或者备选地以冻干的形式储存。

现在参见以下实施例，这些实施例与上文的描述以非限定性的方式示意了本发明的一些实施方案。

实施例

实施例1：根据本发明的一些实施方案的生物膜的耐酸性

检测在一些系统中在固体颗粒上生长的生物膜的顺应性。具体而言，所检测的第一个参数是耐酸性，结果示于图3中。

将胚牙乳杆菌的过夜培养物接种于处于基质容器中浸渍于25％MRS介质中的石榴基质中(为了确保生物膜形成，使用饥饿条件(即，低于100％浓度的生长介质))，并且保持静置2.5小时(即，未混合)，然后启动流动系统。在5天过程中，使用蠕动泵以12ml/小时的速度将介质由介质储存器移动至基质容器中。介质未再循环。新的介质进入培养物中，并且出口排放掉使用过的介质。作为对照，使用浮游生长的细菌(即，未附着在颗粒上)，使得缺乏生物膜的形成。对于浮游对照而言，将4-5个集落的胚牙乳杆菌接种于6ml 100％MRS肉汤中，并且在37℃下在恒温箱中保持静置过夜。

为了测试耐酸性，使用一系列具有PBS的小瓶，其中使用事先制备的HCl(原液0.5M)调节PBS以增加pH，从而创建pH 1、2、3，并且将具有生物膜的2克颗粒转移至小瓶中，再温育1hr。然后，在PBS中洗涤细菌，再如图3所示，将5微升平铺于平板中。

对于浮游对照而言，将100μl的过夜培养物装入pH小瓶中，并温育1hr，然后在PBS中洗涤细菌，再如图3所示，将5微升平铺于平板中。如图3所示，由于生物膜细菌在pH 2下良好地生存，显示更高的耐酸性，而浮游细菌不生存。

无意于受限于任何特定的理论，胃中的pH为大约pH 2。因此，在将生物膜给予受试对象时，生物膜将生存于受试对象的胃部环境(即，pH 2)并且定植于受试对象中。

实施例2：根据本发明的一些实施方案的另一种生物膜的耐酸性

实施第二组试验，并且证明细菌对酸性的顺应性(即，生物膜形式)描述于图4中并示于下表1和2中。

将胚牙乳杆菌的过夜培养物接种于浸渍于25％MRS介质(饥饿条件)中的7克石榴(POM)种子颗粒中，并保持静置2.5小时。接着，使用蠕动泵实施5天的流动系统，其中所述的蠕动泵以最大速度(大约380ml/小时)移动介质。在该试验中，使介质再循环，从而与非流动的/静态对照比较。对于浮游对照而言，将4个集落的胚牙乳杆菌接种于6ml 100％MRS肉汤中，并且在37℃下在恒温箱中保持过夜+5小时。结果示于表1和2中。

表1：细胞生长

表2：如图4的数据(结果的对数)

如图4所示，浮游细菌显示当暴露于降低的pH时，生存减少。

实施例3：根据本发明的一些实施方案的生物膜的再构建

在干燥后回收生长并陷于(entrapped)藻酸盐中的生物膜。胚牙乳杆菌在室温下在25ml 100％MRS+2gr POM中生长4天，从而形成生物膜。对于浮游对照而言，胚牙乳杆菌在室温下在25ml 100％MRS中生长4天。将POM+生物膜和对照的一个样品平铺于系列稀释的MRS平板上。POM+生物膜和对照的另一个样品短暂离心，再次悬浮于5ml冷冻干燥的缓冲剂中，并在24小时内冻干，并悬浮于25ml MRS中。在该阶段(在冻干之后，但是在进一步生长之前)，通过系列稀释将样品平铺于平板上。剩余的样品保持再生长48小时，并再次平铺于平板上。如图5所示，在固体颗粒上以生物膜形式生长的细菌显示增强的顺应性，并且生存于冻干过程(即，在干燥后再构建)。

实施例4：E.coli DH5α细胞的耐酸性

在3种条件下测试菌株E.coli DH5α的耐酸性：

1.浮游的-在23℃下在5天内，E.coli在混合器中在20ml LB起始物中生长。

2.生物膜静态-在37℃下E.coli在具有2gr不同基质的20ml LB中生长5天。

3.生物膜流动-在室温下，E.coli在大约12ml/小时的速度下(新的25％LB)在具有CDP的柱流动系统中生长5天。由柱的顶部(接近于空气表面)和柱的底部取得样品。

E.coli菌株DH5α在37℃下在摇动条件下过夜生长。得自起始物的100μl转移至：

1. 2gr微晶粉末纤维素+20ml LB-用于生物膜静态培养

2. 2gr Solka纤维+20ml LB-用于生物膜静态培养

3. 3gr DCP+20ml LB-用于生物膜静态培养

4. 20ml LB-用于浮游培养

将2ml过夜起始物转移至20ml LB中，并接种于流动系统的柱中。在2个小时内停止流动，从而使E.coli附着在DCP上。在2个小时后，在室温下，开始流动5天。

在温育5天后，由静态试验得到的各种基质的样品(DCP、微晶粉末纤维素和solka)以及由DCP得到的样品形成柱的顶部，并且取自DCP的样品形成柱子的顶部，并从柱子的底部取得DCP，再插入至5种不同的Eppendorf管(“Eppendorfs”)中。使用PBS温和地洗涤样品1次。

由各样品取得以下量的基质至2个小瓶中：

1.静态DCP-0.02gr

2.静态微晶粉末纤维素-0.03gr

3.静态Solka-0.02gr

4.流动DPC顶部-0.03gr

5.流动DCP底部-0.03gr

使用PBSXl温和地洗涤各Eppendorf内容物1次。对于各对eppendorfs(得自各样品)而言，加入1ml PBSXl(pH＝7.4)或1ml PBS(pH＝2)。在室温下将eppendorfs在其一侧上温育1小时。然后将eppendorfs在13000rpm下离心2min，弃去上清液。将1ml PBSX1加入各Eppendorf种，并将eppendorfs在全功率下涡流处理30秒，从而使细菌由基质上游离。

浮游培养物的处理：将1ml培养物转移至Eppendorf中，并在全速下离心2min。弃去上清液，并加入1ml PBS。将得自所得物的100μl加入：

1.具有1ml PBSX1的Eppendorf中(pH＝7.4)

2.具有1ml PBS的Eppendorf中(pH＝2)

在室温下将eppendorfs在其一侧上温育1小时，温育后在13000rpm下离心2min。将100μl PBSX1加入各Eppendorf中。

活菌数：

将得自各eppendorf的100μl转移至90μl PBSX1中。实施7次1:10的系列稀释。将3μl各稀释物平铺于LB平板上，并在恒温箱中过夜。

如下计算以保留细菌/ml(用于浮游的)或细菌/gr：

对于基质而言：集落数x10^稀释数x333.33x(所取的1/gr)

对于浮游而言：集落数x10^稀释数x333.33

本试验中所有的材料均经过高压处理灭菌。下表和图6中所示的结果证明生物膜在静态条件下增加了细菌的耐酸性，并且在流动条件下展示更高的增长。

表3：结果(E.coli DH5α)：

表4：对数级别

实施例5：使用根据本发明的一些实施方案的组合物在鼠科肠道的定植

为了测试以生物膜生长的细菌是否显示增强的定植肠道的能力，如上文所述制备生物膜，并且将该生物膜喂食给裸鼠。测试小鼠粪便中细菌的存在情况。结果示于图7中。

方法：

1. 1.6克-游离小鼠

2.在基质上生长的胚牙乳杆菌生物膜

3.仅与无菌基质(一起磨碎)混合的小鼠的磨碎的食物

4.与基质上的胚牙乳杆菌生物膜(一起磨碎)混合的小鼠的磨碎的食物

5.与藻酸盐珠子中的胚牙乳杆菌生物膜混合的小鼠的磨碎的食物

6.活-死细胞染色试剂盒(测定活细菌的存在情况)

7.用于对照小鼠的高压处理的基质

8.将小鼠分成3组(每组2只小鼠)：

a.对照-喂食食物+仅基质的小鼠

b.生物膜-喂食食物+基质上的生物膜的小鼠

c.生物膜藻酸盐-喂食食物+藻酸盐珠子中基质上生物膜的小鼠

9.使用相应的食物喂食小鼠7天(D1-D7)

10.第8(D8),第9(D9),第10(D 10),第11(Dl l),第12(D12),第13(D13)和第14(D14)天的大便样品

11.检测大便样品中胚牙乳杆菌的存在情况

12.由内部的肠取得切片，使肠上的胚牙乳杆菌生物膜成像，并使用设计的染色试剂盒对活-死细胞染色

图7示出细菌定植于小鼠的肠道。超过3天，由生物膜衍生的细菌定植于小鼠的肠道，事实上至多但不限于14天。

实施例6：由根据本发明的一些实施方案的组合物使细菌以pH依赖的方式释放

通过将DCP与生物膜在4％藻酸盐中混合，并使用所述的材料的液滴滴入2％CaC溶液中将DCP上包含E.coli的生物膜囊封于藻酸盐中，并使包含胚牙乳杆菌的生物膜在藻酸盐珠子的顶部生长。然后根据上述实施例1处理所得的组合物。结果示于图8中。

当将所述的珠子插入pH＝2的溶液中时，仅胚牙乳杆菌释放。在pH＝8下，E.coli和胚牙乳杆菌均由珠子上释放。

实施例7：使用根据本发明的一些实施方案的包含C.minuta的组合物在鼠科肠道中的定植

在试验的第1天，将在石榴种子上包含C.minuta的生物膜(浓度为2*10⁷细菌)与食物混合给予SPF小鼠1次。在第1(在益生菌处理之前),2,4,7,11和15天检查粪便，用于计算粪便中C.minuta的％。

如下方式处理动物(每组3只动物)：

1.对照-仅食物(6gr)

2.对照-仅与石榴籽粒(3gr)混合的食物(3rg)

3.试验-与石榴籽粒(3gr)上的C.minuta生物膜混合的食物(3rg)

在试验的第1天，向SPF小鼠给予在石榴籽粒(C.minuta)、石榴籽粒(仅POM)上生物膜形式的2*10⁷C.minuta细胞，或者只是饮食(FIFD)。在益生菌处理之前(第1天)，在益生菌处理后第2天、4天、7天、11天和15天取得粪便样品，并送至16S测序。计算各粪便样品中整个细菌群体中C.minuta的百分率。结果示于图9中。这些数据显示在试验结束时，包含C.minuta的生物膜能够在小鼠的肠道中定植至多15天，如通过粪便样品中C.minuta的存在情况证明。

实施例8：使用根据本发明的一些实施方案的组合物在鼠科肠道中的定植-与其他方法比较

使包含胚牙乳杆菌的生物膜根据下文概括的条件生长，并在5天中以浓度2*10⁹细菌/天给予SPF小鼠1次。在此之后，仅使用食物喂食再喂食小鼠5天。

对动物进行如下处理(每处理组2只小鼠)：

1.对照-仅食物

2.对照-仅具有颗粒的食物(石榴籽粒POM)

3.浮游的。使胚牙乳杆菌在37℃下在摇动条件下在MRS肉汤中过夜生长

4.在石榴籽粒(POM)上静态的生物膜-具有细菌的5gr颗粒(大约10⁶细菌/天)(根据DE202013103204中所述的方法)

5.在石榴籽粒(POM)上流动的生物膜-具有细菌的1.5gr颗粒

6.在石榴籽粒(POM)上流动的生物膜并且冻干-具有细菌的1.5gr颗粒(根据Biomacromolecules 2013,14,3214-3222中所述的方法)

7.市售的益生菌补充剂-5天内，每天2丸

使用在第5天(在样品给予后的最后一天)、第3天和第5天(在停止样品给予后的第3天和第5天)取得的小鼠粪便的集落计数来定量乳杆菌的数量。结果示于图10中。这些数据显示根据本发明的方法形成的包含L.plantarm的生物膜在试验结束时，能够在至多5天内定植于小鼠的肠道中，通过粪便样品中胚牙乳杆菌的存在情况所证明。但是，根据DE202013103204或Biomacromolecules 2013,14,3214-3222中所述的方法形成的组合物不能在至多5天内定植于小鼠的肠道中。

在整个文件中所述的公开内容以引用方式全文并入本文。尽管本发明的多个方面在上文中已经通过参照实施例和优选的实施方案说明，但是应该理解的是本发明的范围不是通过上述说明书定义的，而是通过专利法原则下适当解释的以下权利要求书定义的。