本发明涉及用于婴儿和幼儿的营养组合物以及其在婴幼儿中的健康效应。具体地讲，其涉及包含特定益生菌的婴儿配方食品，该婴儿配方食品用于诱导与仅用人类母乳(hbm)喂养的婴幼儿的肠道微生物群接近的肠道微生物群。
背景技术：
每当母亲不能母乳喂养其婴幼儿时，婴儿配方食品可为使用人类母乳的天然母乳喂养提供合适的替代方案。用于婴儿和幼儿的营养组合物通常作为用水重构的散剂或在某些情况下作为即饮型或浓缩液体组合物出售。这些组合物旨在覆盖婴儿或幼儿的大部分或所有营养需要。
然而，已经知道人类母乳代表婴幼儿的营养方面终极的黄金标准。婴儿配方食品制造商已作出许多尝试来产生接近或类似于人类母乳的益处的营养健康影响。
建议所有婴幼儿采用母亲的乳汁喂养。然而，在一些情况下，由于某些医学原因，母乳喂养并不足够或不成功，或者母亲不选择母乳喂养。已针对这些情况研发了婴儿配方食品。还研发了用特殊成分丰富母亲的乳汁或婴儿配方食品的强化剂(fortifier)。
然而在许多实例中，研究表明，与人类母乳相比，婴儿配方食品不会对身体产生相同的影响。例如，喂予婴儿配方食品的婴幼儿和喂予人类母乳(hbm)的婴幼儿可表现出不同的肠道微生物群。
生命的婴幼儿期，尤其是头几周、头3个月、头6个月或头12个月，对于建立平衡的肠道微生物群是至关重要的。
已知婴幼儿期肠道微生物群的调节对于身体的未来健康状况可预期具有重大影响。例如肠道菌群可对以后生活中肥胖症的发展、对以后生活中强免疫系统的发育或正常的生长具有影响。
类似地，健康的肠道微生物群是婴幼儿健康的指示，肠道微生物群的改变可能是异常健康事件诸如腹泻、营养物质吸收不足、绞痛、睡眠改变和生长发育改变的指示(和/或起因)。
已知分娩方式可影响婴幼儿的初始肠道微生物群：与经阴道分娩的婴幼儿相比，经剖腹产分娩的婴幼儿具有不同的肠道微生物群。
已知，除了其它成分之外，非消化性碳水化合物(益生元)尤其会影响特定微生物群的繁殖。例如，已证实某些低聚半乳糖(gos)和/或某些低聚果糖(fos)可促进肠道尤其是婴幼儿肠道中的双歧杆菌的生长和繁衍。
然而，在婴幼儿的发育过程中，肠道微生物群及其进化是许多肠道细菌种群的存在和繁衍(数量)之间的精密平衡。关于肠道细菌对婴幼儿总体健康的影响，一些肠道细菌被分类为“通常阳性”，而另一些为“通常阴性”(或致病性)。
相比于母乳喂养的婴幼儿，某些种类的“通常阳性”细菌(诸如双歧杆菌)，在喂予常规婴儿配方食品的婴幼儿中可能不足。类似地，一些细菌种群被认为是致病性的，并且在肠道微生物群中应保持低繁衍。
的确用婴儿配方食品喂养的婴幼儿可能不能获益于仅用或主要用人类母乳喂养的婴幼儿的天然、良好平衡的肠道菌群(肠道微生物群)。母乳喂养的婴幼儿中所观察到的这种天然微生物群确实既随时间推移得到良好控制(随时间而演变)又十分复杂。许多微生物类群共存于肠道/肠内的高度复杂微环境中，每一者以依序限定的比例存在。当限定婴儿或幼儿的微生物群时，应该考虑数量维度和质量维度。此外，肠道微生物群随时间推移的变化增加了复杂性。
虽然许多研究已确定了促进特定阳性细菌在婴幼儿肠道中的生长和繁衍的方法，但对于诱导与母乳喂养的婴幼儿的微生物群相似的微生物群的方法知之甚少。
对于用婴儿配方食品的方法喂养的婴幼儿，存在促进和/或诱导与母乳喂养的婴幼儿的微生物群接近的总体微生物群的需要。
对于用婴儿配方食品喂养的婴幼儿，存在随时间推移促进和/或诱导微生物群的需要，该群落的演变方式与母乳喂养的婴幼儿的微生物群相似。
对于用婴儿配方食品喂养的婴幼儿，还存在给他们提供最好的营养的需要，这种最好营养使得能在该营养干预期间短期和/或在该营养干预后长期发展出与母乳喂养的婴幼儿的微生物群接近的微生物群。
对于用婴儿配方食品喂养的婴幼儿，存在通过营养诱导和/或促进与母乳喂养的婴幼儿的微生物群接近/类似的微生物群的发展，来诱导最佳的短期或长期健康状态的需要；这种健康状态包括随时间推移的最佳生长，和免疫系统的最佳发育，以及代谢障碍的预防。
存在补偿非母乳喂养的婴幼儿中观察到的低常微生物群的需要。存在使这种微生物群再平衡的需要。
对于用婴儿配方食品喂养的婴幼儿，存在诱导和/或促进特定的细菌科、属或种或株在他们肠内发展，例如用以获得与母乳喂养的婴幼儿的微生物群接近的微生物群的需要。
对于用婴儿配方食品喂养的婴幼儿，存在抑制和/或下调特定的细菌科、属或种或株在他们肠内发展，例如用以获得与母乳喂养的婴幼儿的微生物群接近的微生物群的需要。
需要下调婴幼儿的肠道中致病性细菌或“阴性细菌”的发育和生长。
需要选择性地影响或减少婴儿和幼儿的肠道中致病性细菌的生长，同时促进或至少不会影响阳性肠道细菌的生长。
在建立这种平衡时，需要在生命的头几周期间增强婴幼儿的总体肠道微生物群的良好平衡，尤其是通过下调或抑制致病性细菌的生长。
需要通过耐受性良好的“软冲击”(指没有或有很少的副作用)来增强这种良好平衡。
技术实现要素：
本发明涉及用于婴儿和幼儿的营养组合物，诸如婴儿配方食品或较大婴儿配方食品，优选婴儿配方食品。该组合物包含动物双歧杆菌乳酸亚种(bifidobacteriumanimalisssp.lactis)益生菌。与主要用不包含动物双歧杆菌乳酸亚种(bifidobacteriumanimalisssp.lactis)的常规婴儿配方食品喂养的婴幼儿相比，该益生菌促进或诱导与仅用人类母乳喂养的婴幼儿(所谓的纯母乳喂养婴幼儿)的肠道微生物群更接近的肠道微生物群。所述婴儿或幼儿可介于0和36个月之间，优选介于0和12个月之间。
附图说明
图1：示出了配方食品喂养组(v＝对照配方食品；o＝b.lactis配方食品)与母乳喂养组之间的平均加权unifrac距离。该距离越接近零，则与母乳喂养组越接近。
图2：示出了配方食品喂养组t和配方食品喂养组c与母乳喂养组b之间的平均加权unifrac距离。组t：有b.lactis益生菌；组c：无b.lactis益生菌的对照。该距离越接近零，则与母乳喂养组b越接近。
图3：三个喂养组在三个时间点的α多样性分析的箱线图。p值：*，＜0.05；**，＜0.01；***，＜0.001(组t：有b.lactis益生菌；组c：无b.lactis益生菌的对照；组b：母乳喂养)
图4：在招募(＜2周)时以及在六周(6周)和12周(12周)时接受指定配方食品(c＝对照；t＝有b.lactis益生菌的测试配方食品)的婴幼儿或母乳喂养(组b)的婴幼儿的粪便中通过qpcr测量的细菌等价计数。qpcr结果以每克粪便的细菌细胞的平均值+sem给出。虚线为检测限，误差棒为标准偏差。
图5：在＜2周(基线)和12周(右边分图)时在底端指明的三个喂养组中粪便具有横坐标上定义的颜色的婴幼儿的比例。(组t：有b.lactis益生菌；组c：无b.lactis益生菌的对照；组b：母乳喂养)
图6：在每个测试组(测试配方食品/阴道分娩；测试配方食品/剖腹产；对照配方食品/阴道分娩；对照配方食品/剖腹产)中，在第3、10、28和84天时婴幼儿中的双歧杆菌计数(每克粪便的双歧杆菌的logcfu)。
具体实施方式
定义：
如本文所用，下列术语具有如下含义。
术语“婴儿”是指年龄在12个月以下的小孩。
表述“幼儿”是指年龄介于一岁和三岁之间的小孩，也称为学步儿童。
“经剖腹产出生的婴儿或幼儿”是指通过剖腹产分娩的婴幼儿。这意味着婴幼儿不是经阴道分娩的。
“早产婴幼儿”或“早产儿”是指不足月生产的婴儿或幼儿。通常是指妊娠期满37周之前出生的婴幼儿。
表述“营养组合物”是指供给受试者养分的组合物。一般情况下，营养组合物经胃肠道或不经胃肠道摄入，或者以口服或静脉注射方式摄入，并通常包含脂质或脂肪源和蛋白质源。优选地，营养组合物用于口服使用。
表述“低变应原营养组合物”是指不大可能引起变态反应的营养组合物。
表述“合成组合物”是指采用化学和/或生物方法获得的混合物，该混合物的化学性质可能与哺乳动物乳汁中天然存在的混合物相同。
表述“婴儿配方食品”是指专用于供给生命的4至6个月婴儿营养，而且本身可满足这类婴儿的多种营养需求的食品(符合欧盟委员会1991年5月14日颁发的针对婴儿配方食品和较大婴儿配方食品的第91/321/eec号指令中第1.2条的规定)。
表述“1段婴儿配方食品”是指专用于供给生命的不满4个月婴儿营养的食品。
术语“较大婴儿配方食品”是指专用于供给4个月以上大的婴幼儿营养、并且是这类婴幼儿逐渐多元化的饮食中的主要流质食物的食品。
术语“婴孩食物”是指专用于供给生命的不满1岁婴幼儿营养的食品。
表述“强化剂”是指适宜与母乳或婴儿配方食品混合的液态或固态营养组合物。
术语“断乳期”是指在婴幼儿饮食中逐步用其它食物替代母亲的乳汁的这一时期。
“母亲的乳汁”应理解为母亲的母乳或初乳(＝人类母乳＝hbm)。
本文所用的术语“低聚果糖”是指果糖低聚物。其可为长链或短链，具体取决于低聚果糖的聚合度(单体的数量)。优选地，本发明的低聚果糖为短链低聚果糖，最优选地其具有2至10的聚合度，例如2至8的聚合度。
本文所用的术语“sn-2棕榈酸酯”是指棕榈酸在甘油三酯的sn-2位与其键合。
“高sn-2棕榈酸甘油三酯”是指在sn-2位含有超过30％的棕榈酸的甘油三酯(tg)。例如，由脂类营养公司(lipidnutrition)出售的可商购获得的高sn-2棕榈酸甘油三酯成分是betapoltmb-55。其为来源于植物油的甘油三酯混合物，其中至少54％的棕榈酸处于甘油分子的sn-2位。
“α-乳白蛋白”是指高品质、易消化的乳白蛋白，其占总人类母乳(hbm)蛋白质的20-25％并且是hbm中存在的主要蛋白质。α-乳白蛋白的结构由123个氨基酸和4个二硫键组成，并且该蛋白质具有14.2k道尔顿的分子量。由于α-乳白蛋白具有高含量的必需氨基酸(具体地色氨酸)，所以它是低蛋白婴儿配方食品的理想选择。
术语“益生元”是指通过选择地刺激健康细菌(诸如人类结肠中的双歧杆菌)的生长和/或其活性而对宿主产生有利影响的非消化性碳水化合物(gibsongr，roberfroidmb.dietarymodulationofthehumancolonicmicrobiota：introducingtheconceptofprebiotics.jnutr.1995；125：1401-12)。
术语“益生菌”是指对宿主的健康或良好状态具有有益影响的微生物细胞制剂或微生物细胞组分。(salminens，ouwehanda.bennoy.etal.“probiotics：howshouldtheybedefined”trendsfoodsci.technol.1999：10107-10)。微生物细胞一般为细菌或酵母。
术语“cfu”应理解为菌落形成单位。
纯母乳喂养的婴儿或幼儿/仅用母乳喂养的婴儿或幼儿：具有通常的含义，指绝大部分营养物质和/或能量源于人类母乳的婴幼儿(“绝大部分”可以是至少90％或至少95％，或至少99％)。
主要用婴儿配方食品喂养的婴儿/幼儿：具有通常的含义，指营养物质和/或能量的营养源主要源于合成的婴儿配方食品、较大婴儿乳或成长乳。“主要”是指至少50％的那些营养物质和/或能量，或至少75％。
除非另外指明，否则所有百分比均按重量计。
现在开始更详细描述本发明。应当注意，本申请描述的多个方面、特征、实施例和实施方案可以相容和/或可以组合在一起。
另外，在本发明的上下文中，术语“包含”或“包括”不排除其它可能的要素。本发明(包括本文所述的多个实施方案)提到的组合物可包含下列要素、由或基本上由下列要素组成：本文所述的基本要素和必要限制，以及本文所述的任何其它或可选(或者说视需求来定)的成分、组分或限制。
具体实施方式
通常，即食型(ready-to-consume)液体形式的婴儿配方食品(例如由粉末重构而来)提供60-70kcal/100ml。婴儿配方食品通常包含每100kcal：约1.8-4.5g蛋白质；约3.3-6.0g脂肪(脂质)；约300-1200mg亚油酸；约9-14g选自乳糖、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖浆、淀粉、麦芽糖糊精和麦芽糖以及它们的组合的碳水化合物；以及必需维生素和矿物质。乳糖可以是婴儿配方食品中的主要碳水化合物。例如，液体婴儿配方食品可含有约67kcal/100ml。在一些实施方案中，婴儿配方食品可包含每100kcal约1.8-3.3g蛋白质。婴儿配方食品可以为粉末的形式，可通过添加一定量的水将该粉末重构成即可喂养型(ready-to-feed)液体，该量的水导致例如具有约67kcal/100ml的液体。
婴儿配方食品还可以包含选自胞苷5′-单磷酸(cmp)、尿苷5′-单磷酸(ump)、腺苷5′-单磷酸(amp)、鸟苷5′-单磷酸(gmp)和肌苷5′-单磷酸(imp)以及它们的混合物的核苷酸。婴儿配方食品还可以包含叶黄素、玉米黄质、果糖低聚糖、低聚半乳糖、唾液乳糖和/或岩藻糖基-乳糖。婴儿配方食品中可以包含长链多不饱和脂肪酸，诸如二十二碳六烯酸(dha)和花生四烯酸(aa)。婴儿配方食品还可以包含游离氨基酸。婴儿配方食品还可以包含本领域熟知的其它成分。
在一个实施方案中，本发明的婴儿配方食品包含每100kcal约5-6g的脂肪(甘油三酯)，其中该脂肪的至少约7.5重量％(例如约7.5重量％至12.0重量％)由位于甘油三酯的sn-2位的棕榈酸组成。在一些实施方案中，脂肪的约7.8重量％至11.8重量％、约8.0重量％至11.5重量％、约8.5重量％至11.0重量％或约9.0重量％至10.0重量％是位于甘油三酯sn-2位的棕榈酸。
在一些实施方案中，按重量计，棕榈酸占配方食品的总脂肪酸含量的约15％至约25％，诸如约15％至约20％，并且总棕榈酸含量的至少约30％(例如，约35％)至约43％位于sn-2位。
在一些实施方案中，婴儿配方食品还包含比率为约6至约1的至少一种ω6脂肪酸和至少一种ω3脂肪酸。在一个实施方案中，至少一种ω6脂肪酸占总脂肪酸的约10重量％至约15重量％，并且至少一种ω3脂肪酸占总脂肪酸的约1.2％至约3.6％。在一些实施方案中，婴儿配方食品包含至少一种以总重量的约2％至约4％存在的ω6脂肪酸和至少一种以总重量的约0.3％至约0.6％存在的ω3脂肪酸。
本发明的婴儿配方食品中的脂肪包括在牛奶和/或婴儿配方食品中常见的各种甘油三酯。甘油三酯中最常见的脂肪酸残基是棕榈酸和油酸。除了存在的油酸和棕榈酸之外，脂肪酸残基包括但不限于亚油酸、α-亚麻酸、月桂酸、肉豆蔻酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸。
最近的婴幼儿临床研究已经表明，含有比率为约6至约1的至少一种ω6脂肪酸和至少一种ω3脂肪酸的营养配方产品增加了红细胞和血浆中dha的吸积。ω6脂肪酸与ω3脂肪酸的约6∶1的平衡比率也可以提供长期的健康益处，包括对心血管疾病的保护。这种平衡将通过用具有ω6脂肪酸含量的植物油脂肪源(诸如例如，大豆油和葵花油)和ω-3脂肪酸含量(例如，油菜籽、卡诺拉、亚麻籽、奇亚(chia)、紫苏属或核桃)配制本发明来实现。将使用具有5种不同油的独特脂肪共混物来实现改性的脂肪共混物。
在一个实施方案中，本发明的婴儿配方食品包含每100kcal约1.8g至约2.2g的总蛋白质，例如每100kcal约1.8g至约2.1g、或约1.9g至约2.1g蛋白质，其中约0.3g/100kcal至约0.4g/100kcal的蛋白质是α-乳白蛋白。本发明的婴儿配方食品可为即喂型液体的形式，或者可为可通过加入一定量的水来重构成即食型液体从而产生具有约67kcal/100ml的液体的液体浓缩物或粉末状配方食品。本发明的婴儿配方食品包含美国或欧盟法律要求的所有成分，包括但不限于某些维生素、矿物质和必需氨基酸。它还可以包含核苷酸(诸如cmp、ump、amp、gmp和imp)、叶黄素、玉米黄质和本领域已知的其它成分。
低聚糖
在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含至少一种低聚糖或多种低聚糖。低聚糖可以是一种单一的低聚糖或者(不同)低聚糖的混合物。低聚糖的混合物在本文中称为“低聚糖”或“寡糖”或“低聚糖混合物”。这种低聚糖可例如为多聚果糖、果糖低聚糖(fos)、长链果糖低聚糖、短链果糖低聚糖(例如聚合度(dp)介于2和8之间)、菊粉、低聚半乳糖、唾液酸化低聚糖、岩藻糖基化低聚糖、n-乙酰化低聚糖以及它们的混合物。
低聚糖混合物：
在一个实施方案中，本发明的低聚糖以介于0.5g/100kcal和10g/100kcal之间、优选介于1g/100kcal和5g/100kcal之间、最优选介于2g/100kcal和4g/100kcal之间的量存在于组合物中。在一些具体实施方案中，营养组合物可包含0.5g/100kcal至3.1g/100kcal的量、或0.6g/100kcal至3.1g/100kcal的量、或0.6g/100kcal至2.0g/100kcal的量、或0.7g/100kcal至2.0g/100kcal的量、或0.8g/100kcal至1.8g/100kcal的量、或0.9g/100kcal至1.7g/100kcal的量、或1.0g/100kcal至1.5g/100kcal的量、或1.0g/100kcal至1.6g/100kcal的量的低聚糖混合物。
在一个实施方案中，低聚糖以至少0.5重量％、1重量％、至少5重量％或至少10重量％的量存在于组合物中。在一个实施方案中，低聚糖以介于0.5重量％和10重量％之间或者介于1重量％和5重量％之间的量存在于组合物中。
在本发明的一个方面，营养组合物包含1重量％或2.5重量％至15重量％的量的低聚糖混合物。另选地，营养组合物包含3重量％至15重量％的量、或3重量％至10重量％的量、或3.5重量％至9.5重量％的量、或4重量％至9重量％的量、或4.5重量％至8.5重量％的量、或5.0重量％至7.5重量％的量、或5重量％至8重量％的量的低聚糖混合物。
在一个优选的实施方案中，低聚糖为唾液酸化低聚糖和低聚半乳糖(gos)的混合物。
在一个实施方案中，低聚糖混合物包含n-乙酰化低聚糖、低聚半乳糖(gos)和唾液酸化低聚糖。
在一个实施方案中，该组合物包含：
·介于0.001重量％至1重量％之间、优选介于0.003重量％和0.3重量％之间的n-乙酰化低聚糖
·介于1重量％和10重量％之间、优选介于3重量％和6重量％之间的低聚半乳糖
·介于0.005重量％和1重量％之间、优选介于0.01重量％和0.4重量％之间的唾液酸化低聚糖
n-乙酰化低聚糖：在一个最优选的实施方案中，本发明的组合物中的低聚糖由至少一种n-乙酰化低聚糖、至少一种低聚半乳糖和至少一种唾液酸化低聚糖组成，或者包含至少一种n-乙酰化低聚糖、至少一种低聚半乳糖和至少一种唾液酸化低聚糖。
n-乙酰化低聚糖是具有n-乙酰化残基的低聚糖。根据本发明的营养组合物的低聚糖混合物中的合适n-乙酰化低聚糖包括galnacβ1，3galβ1，4glc和galβ1，6galnacβ1，3galβ1，4glc，以及它们的任何混合物。可通过氨基葡萄糖苷酶和/或氨基半乳糖苷酶作用于n-乙酰基葡萄糖和/或n-乙酰基半乳糖来制备n-乙酰化低聚糖。同样地，可使用n-乙酰基-半乳糖基转移酶和/或n-乙酰基-糖基转移酶实现此目的。n-乙酰化低聚糖还可通过使用相应的酶(重组酶或天然酶)的发酵技术和/或微生物发酵制得。在后一种情况下，微生物可表达其天然酶和底物，或者可经工程化以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物或混合培养物。可由受体底物引发n-乙酰化低聚糖的形成，起始于聚合度(dp)从dp＝1起的任何聚合度。另一种选择是将游离的或与低聚糖(乳酮糖)结合的已酮糖(果糖)化学转化成n-乙酰己糖胺或包含n-乙酰己糖胺的低聚糖，如wrodnigg，t.m，dtutz，a.e，angew.chem.int.ed.1999：38：827-82中所述。
低聚半乳糖是包含两个或更多个半乳糖分子的低聚糖，其不带电荷，也不具有n-乙酰基残基。
表述“低聚半乳糖”和“gos”可以互换使用。它们是指包含两个或更多个半乳糖分子的低聚糖，其不带电荷，也不具有n-乙酰基残基(即，其为中性低聚糖)。在一个具体实施方案中，所述两个或更多个半乳糖分子由β-1，2、β-1，3、β-1，4或β-1，6键连接。在另一个实施方案中，“低聚半乳糖”和“gos”也包含含有β-1，2、β-1，3或β-1，6键连接的一个半乳糖分子和一个葡萄糖分子(即，二糖)的低聚糖。
根据本发明的营养组合物的低聚糖混合物中的合适低聚半乳糖包括galβ1，3galβ1，4glc、galβ1，6galβ1，4glc、galβ1，3galβ1，3galβ1，4glc、galβ1，6galβ1，6galβ1，4glc、galβ1，3galβ1，6galβ1，4glc、galβ1，6galβ1，3galβ1，4glc、galβ1，6galβ1，6galβ1，6glc、galβ1，3galβ1，3glc、galβ1，4galβ1，4glc和galβ1，4galβ1，4galβ1，4glc，以及它们的任何混合物。合成的低聚半乳糖诸如galβ1，6galβ1，4glc、galβ1，6galβ1，6galβ1，6glc、galβ1，3galβ1，4glc、galβ1，6galβ1，6galβ1，4glc、galβ1，6galβ1，3galβ1，4glc、galβ1，3galβ1，6galβ1，4glc、galβ1，4galβ1，4glc和galβ1，4galβ1，4galβ1，4glc以及它们的混合物可以商标名
唾液酸化低聚糖是具有带有相关电荷的唾液酸残基的低聚糖。根据本发明的营养组合物的低聚糖混合物中的合适唾液酸化低聚糖包括唾液乳糖、α2，3-唾液乳糖(3sl)、α2，6-唾液乳糖(6sl)、neuacα2-3galβ1-4glc、neuacα2-6galβ1-4glc、neuacα2，3galβ1，4glc和neuacα2，6galβ1，4glc以及它们的任何混合物。
唾液酸化低聚糖可选自3′唾液乳糖(3-sl)、6′唾液乳糖(6-sl)以及它们的任何组合。在本发明的一些实施方案中，该组合物包含3-sl和6-sl。在一些具体实施方案中，3′-唾液乳糖(3-sl)与6′-唾液乳糖(6-sl)之间的比率可在介于5∶1和1∶10之间、或介于3∶1和1∶1之间、或1∶1至1∶10的范围内。在一些特定实施方案中，组合物的唾液酸化低聚糖为6′唾液乳糖(6-sl)。
可通过色谱技术或过滤技术从天然来源(诸如动物乳汁)中分离出这些唾液酸化低聚糖。另选地，也可通过利用特定的唾液酸转移酶的生物技术方法，通过基于酶的发酵技术(重组酶或天然酶)或微生物发酵技术来制备。在后一种情况下，微生物可表达其天然酶和底物，或者也可经工程化以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物或混合培养物。可由受体底物引发形成唾液酸化低聚糖，起始于聚合度(dp)从dp＝1起的任何聚合度。另选地，可通过由乳糖和游离n′-乙酰神经氨酸(唾液酸)的化学合成来产生唾液乳糖。唾液乳糖也可从例如日本的kyowahakkokogyo商购获得。
益生元/低聚糖的来源：
低聚糖可从任何来源分离。优选地，低聚糖从牛乳分离、纯化或浓缩。另选地，低聚糖中的全部或一些是完全地或部分地通过生物工程来产生的。
可以使用用于对牛乳衍生的低聚糖中的牛乳级分进行分级分离和富集的常规技术(此类常规技术包括柱过滤、树脂过滤、纳滤、酶处理(特别是使用β-半乳糖苷酶)、蛋白质沉淀、乳糖的结晶和分离等)。一些富含低聚糖的牛乳级分是可商购获得的，或者已被描述(例如在ep2526784a1中，该专利中的方法可用来提供本发明使用的低聚糖混合物)。
特定的实施方案：
可预见一些特定的低聚糖混合物特别适用于本发明。
本发明的营养组合物可包含至少0.01重量％的n-乙酰化低聚糖、至少2.0重量％的低聚半乳糖和至少0.02重量％的唾液酸化低聚糖。
在一些实施方案中，根据本发明的营养组合物可包含至少0.01重量％、或至少0.02重量％、或至少0.03重量％、或至少0.04重量％、或至少0.05重量％、或至少0.06重量％或至少0.07重量％的n-乙酰化低聚糖。在一些实施方案中，根据本发明的营养组合物可包含0.01重量％至0.07重量％的n-乙酰化低聚糖，诸如0.01重量％至0.05重量％的n-乙酰化低聚糖或0.01重量％至0.03重量％的n-乙酰化低聚糖。
此外，营养组合物可包含至少2重量％、或至少3重量％、或至少4重量％、或至少5重量％、或至少5.5重量％、或至少6重量％或至少7重量％或至少8重量％的低聚半乳糖。在一些实施方案中，营养组合物可包含5重量％至8重量％的低聚半乳糖，诸如5.75重量％至7重量％的低聚半乳糖或5.85重量％至6.5重量％的低聚半乳糖。具体示例是5.95重量％的量的低聚糖。
最后，营养组合物可包含至少0.02重量％、或至少0.03重量％、或至少0.04重量％、或至少0.05重量％、或至少0.06重量％、或至少0.07重量％、或至少0.08重量％或至少0.09重量％的唾液酸化低聚糖。在一些实施方案中，营养组合物可包含0.02重量％至0.09重量％的唾液酸化低聚糖，诸如0.02重量％至0.08重量％的唾液酸化低聚糖、或0.02重量％至0.07重量％的唾液酸化低聚糖、或0.003重量％至0.07重量％的唾液酸化低聚糖。
在一个具体实施方案中，根据本发明的营养组合物可包含0.01重量％至0.07重量％的n-乙酰化低聚糖、2.0重量％至8.0重量％的低聚半乳糖和0.02重量％至0.09重量％的唾液酸化低聚糖。
在另一个具体实施方案中，根据本发明的营养组合物可包含0.01重量％至0.03重量％的n-乙酰化低聚糖、5.95重量％的低聚半乳糖和0.02重量％至0.09重量％的唾液酸化低聚糖。
在另一个实施方案中，营养组合物可包含至少0.0015g/100kcal的n-乙酰化低聚糖、至少0.70g/100kcal的低聚半乳糖和至少0.0045g/100kcal的唾液酸化低聚糖。
在一些具体实施方案中，营养组合物可包含至少0.0015g/100kcal、或至少0.002g/100kcal、或至少0.0025g/100kcal、或至少0.003g/100kcal、或至少0.0035g/100kcal、或至少0.004g/100kcal、或至少0.0045g/100kcal、或至少0.005g/100kcal的n-乙酰化低聚糖。在一些实施方案中，营养组合物可包含0.0015g/100kcal至0.005g/100kcal的n-乙酰化低聚糖，诸如0.0015g/100kcal至0.045g/100kcal的n-乙酰化低聚糖或0.002g/100kcal至0.0045g/100kcal的n-乙酰化低聚糖。
此外，营养组合物可包含至少0.70g/100kcal、或至少0.74g/100kcal、或至少0.8g/100kcal、或至少0.85g/100kcal、或至少0.90g/100kcal、或至少0.95g/100kcal、或至少1.0g/100kcal、或至少1.05g/100kcal、或至少1.10g/100kcal、或至少1.20g/100kcal、或至少1.50g/100kcal的低聚半乳糖。在一些实施方案中，营养组合物可包含0.70g/100kcal至1.5g/100kcal的低聚半乳糖，诸如0.70g/100kcal至1.20g/100kcal的低聚半乳糖或0.74g/100kcal至1.2g/100kcal的低聚半乳糖。
最后，营养组合物可包含至少0.0045g/100kcal、或至少0.005g/100kcal、或至少0.0055g/100kcal、或至少0.006g/100kcal、或至少0.0065g/100kcal、或至少0.007g/100kcal、或至少0.0075g/100kcal、或至少0.008g/100kcal或至少0.0085g/100kcal的唾液酸化低聚糖。在一些实施方案中，营养组合物可包含0.0045g/100kcal至0.0085g/100kcal的唾液酸化低聚糖，诸如0.0045g/100kcal至0.008g/100kcal的唾液酸化低聚糖或0.0045g/100kcal至0.0075g/100kcal的唾液酸化低聚糖。
在一个具体实施方案中，营养组合物可包含0.0015g/100kcal至0.005g/100kcal的n-乙酰化低聚糖、0.70g/100kcal至1.5g/100kcal的低聚半乳糖和0.0045g/100kcal至0.0085g/100kcal的唾液酸化低聚糖。
在另一个具体实施方案中，营养组合物可包含0.0015g/100kcal至0.0045g/100kcal的n-乙酰化低聚糖、0.74g/100kcal至1.2g/100kcal的低聚半乳糖和0.0045g/100kcal至0.0075g/100kcal的唾液酸化低聚糖。
在一个具体的有利实施方案中，根据本发明的营养组合物的低聚糖混合物包含0.1重量％至4.0重量％的n-乙酰化低聚糖、92.0重量％至98.5重量％的低聚半乳糖和0.3重量％至4.0重量％的唾液酸化低聚糖。
在本发明的一个方面，营养组合物包含2.5重量％至15重量％的量的低聚糖混合物。另选地，营养组合物包含3重量％至15重量％的量、或3重量％至10重量％的量、或3.5重量％至9.5重量％的量、或4重量％至9重量％的量、或4.5重量％至8.5重量％的量、或5.0重量％至7.5重量％的量、或5重量％至8重量％的量的低聚糖混合物。
在一些具体实施方案中，营养组合物可包含0.5g/100kcal至3.1g/100kcal的量、或0.6g/100kcal至3.1g/100kcal的量、或0.6g/100kcal至2.0g/100kcal的量、或0.7g/100kcal至2.0g/100kcal的量、或0.8g/100kcal至1.8g/100kcal的量、或0.9g/100kcal至1.7g/100kcal的量、或1.0g/100kcal至1.5g/100kcal的量、或1.0g/100kcal至1.6g/100kcal的量的低聚糖混合物。
本发明的营养组合物可包含至少0.01重量％的n-乙酰化低聚糖、至少2.0重量％的低聚半乳糖和至少0.02重量％的唾液酸化低聚糖。
在一些实施方案中，根据本发明的营养组合物可包含至少0.01重量％、或至少0.02重量％、或至少0.03重量％、或至少0.04重量％、或至少0.05重量％、或至少0.06重量％或至少0.07重量％的n-乙酰化低聚糖。在一些实施方案中，根据本发明的营养组合物可包含0.01重量％至0.07重量％的n-乙酰化低聚糖，诸如0.01重量％至0.05重量％的n-乙酰化低聚糖或0.01重量％至0.03重量％的n-乙酰化低聚糖。
此外，营养组合物可包含至少2重量％、至少3重量％、至少4重量％、至少5重量％、至少5.5重量％、至少6重量％、至少7重量％或至少8重量％的低聚半乳糖。在一些实施方案中，营养组合物可包含5重量％至8重量％的低聚半乳糖，例如5.75重量％至7重量％的低聚半乳糖或5.85重量％至6.5重量％的低聚半乳糖。具体示例是5.95重量％的量的低聚糖。
最后，营养组合物可包含至少0.02重量％、或至少0.03重量％、或至少0.04重量％、或至少0.05重量％、或至少0.06重量％、或至少0.07重量％、或至少0.08重量％或至少0.09重量％的唾液酸化低聚糖。在一些实施方案中，营养组合物可包含0.02重量％至0.09重量％的唾液酸化低聚糖，诸如0.02重量％至0.08重量％的唾液酸化低聚糖、或0.02重量％至0.07重量％的唾液酸化低聚糖、或0.003重量％至0.07重量％的唾液酸化低聚糖。
在一个具体实施方案中，根据本发明的营养组合物可包含0.01重量％至0.07重量％的n-乙酰化低聚糖、2.0重量％至8.0重量％的低聚半乳糖和0.02重量％至0.09重量％的唾液酸化低聚糖。
在另一个具体实施方案中，根据本发明的营养组合物可包含0.01重量％至0.03重量％的n-乙酰化低聚糖、5.95重量％的低聚半乳糖和0.02重量％至0.09重量％的唾液酸化低聚糖。
在另一个实施方案中，营养组合物可包含至少0.0015g/100kcal的n-乙酰化低聚糖、至少0.70g/100kcal的低聚半乳糖和至少0.0045g/100kcal的唾液酸化低聚糖。
在一些具体实施方案中，营养组合物可包含至少0.0015g/100kcal、或至少0.002g/100kcal、或至少0.0025g/100kcal、或至少0.003g/100kcal、或至少0.0035g/100kcal、或至少0.004g/100kcal、或至少0.0045g/100kcal、或至少0.005g/100kcal的n-乙酰化低聚糖。在一些实施方案中，营养组合物可包含0.0015g/100kcal至0.005g/100kcal的n-乙酰化低聚糖，诸如0.0015g/100kcal至0.045g/100kcal的n-乙酰化低聚糖或0.002g/100kcal至0.0045g/100kcal的n-乙酰化低聚糖。
此外，营养组合物可包含至少0.70g/100kcal、或至少0.74g/100kcal、或至少0.8g/100kcal、或至少0.85g/100kcal、或至少0.90g/100kcal、或至少0.95g/100kcal、或至少1.0g/100kcal、或至少1.05g/100kcal、或至少1.10g/100kcal、或至少1.20g/100kcal、或至少1.50g/100kcal的低聚半乳糖。在一些实施方案中，营养组合物可包含0.70g/100kcal至1.5g/100kcal的低聚半乳糖，诸如0.70g/100kcal至1.20g/100kcal的低聚半乳糖或0.74g/100kcal至1.2g/100kcal的低聚半乳糖。
低聚糖/bmos：
在本发明的一个实施方案中，该组合物包含“牛乳低聚糖”(本文缩写为“bmos”或“bmos混合物”)，其为包含以下物质的混合物(富含某些低聚糖的来自牛乳的级分)：
bmos大致提供(在最终组合物诸如婴儿配方食品中，以干重计)：
n-乙酰化低聚糖：0.006重量％至0.24重量％
低聚半乳糖：5.52重量％至5.91重量％
唾液酸化低聚糖：0.018重量％至0.24重量％
gos可以是商购自frieslandcampina的“vivinalgos”。
在一个具体实施方案中，营养组合物包含2.5重量％至15.0重量％的bmos混合物。
在另一个实施方案中，营养组合物包含至少0.01重量％的n-乙酰化低聚糖、至少2.0重量％的低聚半乳糖和至少0.02重量％的唾液酸化低聚糖。
在一个实施方案中，该组合物包含至少一种n-乙酰化低聚糖和/或至少一种低聚半乳糖和/或至少一种唾液酸化低聚糖。在一个实施方案中，该组合物包含至少一种n-乙酰化低聚糖和至少一种低聚半乳糖和至少一种唾液酸化低聚糖。
在一个实施方案中，bmos混合物包含0.1重量％至4.0重量％的n-乙酰化低聚糖、92.0重量％至98.5重量％的低聚半乳糖和0.3重量％至4.0重量％的唾液酸化低聚糖。
在一个实施方案中，bmos混合物来源于动物乳，诸如奶牛乳、或水牛乳。
营养组合物可包含至少0.0045g/100kcal、或至少0.005g/100kcal、或至少0.0055g/100kcal、或至少0.006g/100kcal、或至少0.0065g/100kcal、或至少0.007g/100kcal、或至少0.0075g/100kcal、或至少0.008g/100kcal或至少0.0085g/100kcal的唾液酸化低聚糖。在一些实施方案中，营养组合物可包含0.0045g/100kcal至0.0085g/100kcal的唾液酸化低聚糖，诸如0.0045g/100kcal至0.008g/100kcal的唾液酸化低聚糖或0.0045g/100kcal至0.0075g/100kcal的唾液酸化低聚糖。
在一个具体实施方案中，营养组合物可包含0.0015g/100kcal至0.005g/100kcal的n-乙酰化低聚糖、0.70g/100kcal至1.5g/100kcal的低聚半乳糖和0.0045g/100kcal至0.0085g/100kcal的唾液酸化低聚糖。
在另一个具体实施方案中，营养组合物可包含0.0015g/100kcal至0.0045g/100kcal的n-乙酰化低聚糖、0.74g/100kcal至1.2g/100kcal的低聚半乳糖和0.0045g/100kcal至0.0075g/100kcal的唾液酸化低聚糖。
在一个具体的有利实施方案中，根据本发明的营养组合物的低聚糖混合物包含0.1重量％至4.0重量％的n-乙酰化低聚糖、92.0重量％至98.5重量％的低聚半乳糖和0.3重量％至4.0重量％的唾液酸化低聚糖。
wo2006087391和wo2012160080提供了制备bmos混合物的一些示例。
其它低聚糖低聚果糖(of)
本发明的婴儿配方食品可包含每100kcal的组合物至少约0.4g或至少0.7g的低聚果糖。在一些实施方案中，其含有每100kcal约0.4g至约0.9g、约0.4g至约0.7g、约0.4g至约0.5g、约0.7g至约0.8g、或约0.7g至约0.9g低聚果糖。
在一些实施方案中，低聚果糖具有2至10的聚合度。在一些实施方案中，至少80％、90％、95％、99％或100％的低聚果糖具有2至8(介于2和8之间)的聚合度。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含：
-当组合物为即饮型液体组合物时，至少3g/l或至少5g/l的低聚果糖(of)，或者
-当所述营养组合物为粉末状或浓缩组合物时，足够量的低聚果糖，以在重构组合物中分别获得至少3g/l或5g/l的低聚果糖。
在一些实施方案中，本发明的营养组合物包含至少0.4gof/100kcal组合物，或至少0.7g、或至少0.75g、或至少0.8g或至少0.9gof/100kcal组合物。
从实施例所示的结果来看，普遍认为高量的低聚果糖递送更强的作用。然而，当开始出现不利的副作用时则可能存在低聚果糖有益效果的上限。这种上限可为例如2.2g/100kcal、2.0g/100kcal、1.8g/100kcal、1.5g/100kcal或1.2g/100kcal。优选地，本发明的组合物包含5gof/l组合物或0.75g或0.9gof/100kcal组合物或至少这种量。
其它益生元：
本发明的组合物可包含所述非消化性低聚糖或另外的非消化性低聚糖(例如益生元)。其量通常介于组合物重量的0.3％和10％之间。
益生元通常是非消化性的，在这个意义上来讲，它们在胃或小肠中是不能被分解和吸收的，因而它们通过胃和小肠到达结肠时可保持完整，在结肠处通过有益细菌选择性地发酵。益生元的示例包括某些低聚糖，诸如果糖低聚糖(fos)和/或低聚半乳糖(gos)。可使用益生元的组合，诸如90％的gos与10％的短链低聚果糖。益生元的另一种组合是70％的短链低聚果糖和30％的菊粉(＝长链fos)。这两者以及低聚果糖(of)都可商购获得，具体地从beneo公司(beneogmbh，maximilianstrasse，68165，mannheim，germany)商购获得。
益生菌
本发明的组合物包含动物双歧杆菌乳酸亚种(bifidobacteriumanirnalis
益生菌的剂量可例如介于105cfu/g组合物和1012cfu/g组合物之间，优选其量足以与组合物的低聚糖(如bmos)产生协同增强效应，并且优选介于106cfu/g组合物和108cfu/g组合物之间。
蛋白质/α-乳白蛋白
本发明的组合物包含蛋白质源。这种蛋白质源可例如递送介于1.6g/100kcal和3g/100kcal之间的蛋白质。在专用于早产儿的一个实施方案中，该量可介于2.4g/100kcal和4g/100kcal之间，或大于3.6g/100kcal。在一个实施方案中，该量可低于2.0g/100kcal，例如量低于1.8g/100kcal。
只要满足必需氨基酸含量的最低要求并确保令人满意的生长，并认为蛋白质的类型是对本发明最紧要的。然而，特定的蛋白质可向微生物群提供最适合的底物。因此，可使用基于乳清、酪蛋白以及它们的混合物的蛋白质源，也可使用基于大豆的蛋白质源。就所关注的乳白蛋白而言，蛋白质源可基于酸乳清或甜乳清或它们的混合物，并且可包含任何所需比例的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。
优选地，蛋白质源主要是乳清(50％以上的蛋白质源于乳白蛋白)。在一个实施方案中，组合物的蛋白质为完整蛋白质，或大部分(90％以上)为完整蛋白质。
该蛋白质可为完整的或水解的，或为完整蛋白质和水解蛋白质的混合物。所谓术语“完整的”是指蛋白质的主要部分是完整的，即分子结构未发生改变，例如至少80％的蛋白质未发生改变，诸如至少85％的蛋白质未发生改变，优选地，至少90％的蛋白质未发生改变，甚至更优选地，至少95％的蛋白质未发生改变，诸如至少98％的蛋白质未发生改变。在一个具体实施方案中，100％的蛋白质未发生改变。
术语“水解的”是指在本发明的上下文中，蛋白质已被水解或分解成其组成氨基酸。
该蛋白质可为完全水解的、深度水解的或部分水解的。例如，对于被认为处于发生牛的乳汁变态反应风险的婴幼儿而言，提供部分水解的蛋白质(水解程度介于2％和20％之间)可能是期望的。如果需要水解的蛋白质，则可根据需要并且如本领域已知的那样进行水解过程。例如，可通过在一个或多个步骤中对乳清级分进行酶法水解来制备乳白蛋白水解产物。如果用作原料的乳清级分基本上不含乳糖，则发现该蛋白质在水解过程中经受少得多的赖氨酸封闭(lysineblockage)。这使得能够将赖氨酸封闭的程度从约15重量％的总赖氨酸降至低于约10重量％的赖氨酸；例如约7重量％的赖氨酸，这大大提高了蛋白质源的营养质量。
在一个优选的实施方案中，该组合物中的蛋白质为水解的、完全水解的、深度水解的或部分水解的。蛋白质的水解度(dh)可介于8和40之间，或介于20和60之间，或介于20和80之间，或大于10、20、40、60、80、90。应当理解，水解蛋白可对变态反应产生多种效应：水解蛋白可能更不容易引起变态反应，因此更不容易触发免疫变态反应。水解蛋白，特别是小分子肽(氨基酸数量少于20、10或5个)可诱导口服耐受性，从而影响受试者将来的变态反应状态。应当理解，水解蛋白可通过提供双重效应有利地与本发明的岩藻糖基化低聚糖组合，该效应可能是通过在过敏症状或过敏状态的建立中以至少两个不同的水平起效而实现的协同效应。
在本发明的一个实施方案中，至少70％的蛋白质被水解，优选地，至少80％的蛋白质被水解，诸如至少85％的蛋白质被水解，甚至更优选地，至少90％的蛋白质被水解，诸如至少95％的蛋白质被水解，具体地至少98％的蛋白质被水解。在一个具体实施方案中，100％的蛋白质被水解。
在一个实施方案中，水解蛋白是蛋白质的唯一来源(即，100％或至少90％的蛋白质被水解)。
在一个实施方案中，水解蛋白是蛋白质的主要来源(即，至少50％、优选地60％的蛋白质被水解)。
在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含至少0.2g/100kcal或0.3g/100kcal或0.4/100kcal或者至少1.7g/l、或2.0g/l或2.3g/l、或2.6g/l的量的α-乳白蛋白。α-乳白蛋白以一定的量存在据信可通过给微生物群提供例如足够的营养底物而增强低聚果糖的效果。
可以设想，尤其是对于脆弱的婴幼儿，水解蛋白质更易于消化并因而与更接近母乳喂养的婴幼儿的微生物群的肠道微生物群的定植协同增效地发挥联合作用。
优选的营养组合物基质：
根据本发明的组合物可为合成营养组合物。其可为婴儿配方食品、1段婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、早产儿配方食品或强化剂(诸如人乳强化剂)或补充剂。优选地，本发明的组合物是专用于不满4个月或不满6个月婴儿的婴儿配方食品或强化剂或补充剂。
脂肪/高sn-2棕榈酸酯：
在一个实施方案中，营养组合物包含具有高sn-2棕榈酸酯的甘油三酯，优选地在sn-2位具有超过33％的棕榈酸的甘油三酯。
在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含每100kcal约5g至6g的脂肪(甘油三酯)，其中该脂肪的至少约7.5重量％(例如约7.5％至12.0％)由位于甘油三酯的sn-2位的棕榈酸组成。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含的至少7.5％、优选地8％、更优选地至少9.6％的脂肪是sn-2棕榈酸酯。
在一些实施方案中，脂肪的约7.8重量％至11.8重量％、约8.0重量％至11.5重量％、约8.5重量％至11.0重量％或约9.0重量％至10.0重量％是位于甘油三酯sn-2位的棕榈酸。
在一些实施方案中，按重量计，棕榈酸占配方食品的总脂肪酸含量的约15％至约25％，诸如约15％至约20％，并且总棕榈酸含量的至少约30％(例如，约35％)至约43％位于sn-2位。
在一些实施方案中，营养组合物还包含比率为约6至约1的至少一种ω6脂肪酸和至少一种ω3脂肪酸。在一个实施方案中，至少一种ω6脂肪酸占总脂肪酸的约10重量％至约15重量％，并且至少一种ω3脂肪酸占总脂肪酸的约1.2％至约3.6％。在一些实施方案中，婴儿配方食品包含至少一种以总重量的约2％至约4％存在的ω6脂肪酸和至少一种以总重量的约0.3％至约0.6％存在的ω3脂肪酸。
本发明的营养组合物中的脂肪包括在牛奶和/或营养组合物中常见的各种甘油三酯。甘油三酯中最常见的脂肪酸残基是棕榈酸和油酸。除了存在的油酸和棕榈酸之外，脂肪酸残基包括但不限于亚油酸、α-亚麻酸、月桂酸、肉豆蔻酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸。
由脂类营养公司出售的可商购获得的组合物是betapoltmb-55，其为来源于植物油的甘油三酯混合物，其中至少54％的棕榈酸位于甘油分子的sn-2位。在一个实施方案中，本发明组合物的脂肪含量为约40重量％至50重量％(例如约43重量％至约45重量％)的betapoltmb-55。本领域的技术人员将了解，在不脱离本发明的实质和范围的情况下，配方食品中所使用的高sn-2脂肪的百分比以及sn-2棕榈酸酯的总量可以有所变化，并且可使用不同的高sn-2棕榈酸酯油。
尽管用含有高百分比的sn-2棕榈酸酯的配方食品喂养婴幼儿有助于产生较软的粪便和结肠中双歧杆菌的生长，但高sn-2棕榈酸酯与低聚果糖的组合提供了显着优越的粪便软化，同时诱导最佳的肠道微生物群平衡以及增强喂养配方食品的婴幼儿结肠中致病性细菌负荷的下调或减少。
健康效应
本发明的组合物对受试者婴儿或幼儿的微生物群具有积极影响。这种积极效应可包括致病菌生长的下调、降低或抑制和/或有益菌生长的上调、增加或促进。
本发明组合物的健康效应包括，促进或诱导与主要用不包含所述益生菌的常规营养组合物(或婴儿配方食品)喂养的婴幼儿的微生物群相比、与仅用人类母乳喂养的婴幼儿的微生物群更接近的肠道微生物群。这种效应是在介于0和36个月之间、任选介于0和12个月之间的婴儿或幼儿中。
在使用该组合物数天或数周后-例如在使用4周或6周或8周后，可观察到该健康效应。然而可能要耗费4周、6周、8周才能观察到诱导的微生物群。
在那种情况下，该健康效应使婴儿或幼儿的微生物群更接近于(纯)母乳喂养的婴幼儿或幼儿的微生物群。当与不接受本发明组合物的婴儿或幼儿相比时，尤其观察到这种情况。
所诱导的微生物群在2个维度上是特定的：从数量上而言，肠道菌群包含较多的有益菌和较少的有害菌。从质量上而言，细菌类群的种类与母乳喂养的婴幼儿的微生物群更相似。
通过下调、降低和/或抑制致病菌种群的生长和/或诱导更多有益菌，从数量上和从质量上而言，本发明的组合物提供积极的健康效应。这样的健康肠道/肠内微生物群最终与恰当的营养物质吸收、充分的生长、较少的绞痛、较少的感染、较少的腹泻以及最好的肠道健康相关联。
在一个实施方案中，由本发明的组合物诱导的健康效应表征为包括动物双歧杆菌和/或双歧杆菌属(bifidobacterium)和/或长双岐杆(b.longum)和/或乳杆菌属(lactobacillus)的种群上调，以及/或者粪芽孢菌属(coprobacillus)和/或链球菌属(streptococcus)的种群下调。
本发明的效应可以是预防性的(例如避免肠道微生物群的失衡、避免肠道感染、维持健康的肠内微生物群、诱导健康的肠内微生物群)或治愈性的(当肠道微生物群受损时恢复健康的肠道微生物群、帮助消除或减少肠道/肠中的致病性种群、在由于例如腹泻或感染而引起的受损后诱导健康的微生物群)。
与所述婴幼儿相关的健康效应可通过如下面实施例中所示的各种方法来测量。然而在一个实施方案中，通过unifrac距离的平均分布来测量微生物群效果(参见下文)。
在一个实施方案中，健康效应“促进或诱导与仅用人类母乳喂养的婴幼儿的微生物群更接近的肠道微生物群”进一步表征为促进或诱导与母乳喂养的婴幼儿的微生物群的系统发育距离小于0.3个单位(通过unifrac方法测量)、优选小于0.25个单位的肠道微生物菌落。
目标婴幼儿
在本发明的一个实施方案中，目标婴儿或幼儿天生具有脆弱的或不平衡的微生物群或微生物群失调。例如这类婴幼儿可以是早产的婴幼儿、小于胎龄出生的婴幼儿或经剖腹产婴幼儿、住院的婴幼儿或用抗生素治疗或已用抗生素治疗的婴幼儿。
在一个实施方案中，婴儿或幼儿为足月生产的。所有婴幼儿均可从本发明中受益，因为所有婴幼儿在某一年龄可能或可能会容易获得不平衡的肠/肠道微生物群。在一个实施方案中，婴儿或幼儿为未足月生产的(早产)。在一个实施方案中，婴儿或幼儿是小于胎龄儿生产的。在一个实施方案中，婴儿或幼儿为经阴道分娩的。在一个实施方案中，婴儿或幼儿为经剖腹产分娩的。可以预见的是，本发明的组合物对于可能受损的肠道微生物群或脆弱的婴幼儿(诸如早产婴幼儿和/或经剖腹产出生的婴幼儿)可能更有利。还可以预见的是，本发明的组合物对于在出生后例如出生后的头4周内显示有肠道疾病(诸如腹泻、感染或绞痛)的婴幼儿可能甚至更有益处。
在本发明的实施方案中，婴幼儿是早产儿或小于胎龄儿或剖腹产婴幼儿，或者表现具有不平衡的或异常的肠内微生物群或遭受肠道感染；在本发明的实施方案中，婴幼儿为早产或小于胎龄儿出生的或经剖腹产出生的，或者表现出不平衡或异常的肠道微生物群，或者患有肠道感染；任选地，当婴幼儿为0-6个月时，所述以上病症是本发明的组合物的目标。不受理论的约束，据信年龄较小的婴幼儿从本发明中获益甚至更多，尤其是当婴幼儿具有(或有风险具有)“不平衡的肠道微生物群”和/或具有脆弱的健康状况时(如上述条件所例示)。
在这类婴儿或幼儿中，获得与母乳喂养的婴幼儿(优选纯母乳喂养的婴幼儿)的肠道微生物群接近的肠道微生物群特别引人关注。的确其为他们提供大量的健康要素，这些健康要素可以是有利的，尤其对于那些脆弱的婴幼儿而言。
在一个实施方案中，婴儿和幼儿为0至6个月、或0至12个月或0至36个月。可以预见的是，本发明的组合物对于刚出生(0至4周或0至8周)的婴幼儿可能更有利，因为它们的肠管可能更脆弱。
呈现以下实施例以说明本发明的某些实施方案和特征，但不应理解为限制本发明的范围。
预期喂予方案：
在一个实施方案中，本发明的组合物在2、4、8、12周期间或在至少2、4、8、12周期间喂予给婴儿或幼儿(或预期喂予或指导喂予)。在优选的实施方案中，在婴幼儿生命的头4、8或12周期间喂予(或预期喂予或指导喂予)。据信早期开始(在出生时或接近出生时)更倾向于产生预期的效应。
预计当本发明组合物用作营养的唯一来源时，健康会更明显或者确立得更快。在一个实施方案中，只要将本发明的组合物用于覆盖靶标婴儿或幼儿的营养需求(例如能量需求)的50％或更高、或者75％或更高，就观察到所述健康效应。
实施例1：
表1提供了本发明组合物的实施例。
表1：
上面表1中的组合物另外分别含有106cfu/g组合物(对照配方食品)、108cfu/g组合物(sn2配方食品)、109cfu/g组合物(sn2配方食品+3gof)、1010cfu/g组合物(sn2配方食品5gof)的量的益生菌动物双歧杆菌乳酸亚种(bifidobacteriumanimalisssp.lactis)(bb12或者cncmi-3446)。
下面表2中给出了根据本发明所用的营养组合物的组成的另外实施例。这些组合物仅以举例的方式给出。蛋白质源是60％mswp28和40％酪蛋白的混合物。
表2
实施例2：临床研究
研究设置
在印度平行进行两组的多中心、展望、随机、对照的双盲临床试验。包括非随机分配的纯母乳喂养组作为参照。所有婴幼儿的主要入选标准由以下组成：健康、足月出生、招募时小于3个月，并且由于不能母乳喂养而需要配方食品喂养(随机组)或者纯母乳喂养(参照组)。将随机分配的婴幼儿指派给2个处理组中的一组：
1.来自介于14天和3个月之间到6个月的接受含有动物双歧杆菌乳酸亚种(bifidobacteriumanimalisssp.lactis)ncc2818(＝b.lactiscncmi-3446)的1段配方食品的受试者(组o)。组o的婴儿配方食品是本发明的营养组合物。
2.来自介于14天和3个月之间到6个月的接受具有相同组成但不合b.lactis的1段配方食品的受试者(组v)(不是本发明的组合物，而是常规婴儿配方食品)。
参照组从出生到第6个月仅用母乳喂养(组bf)。
所用的“1段配方食品”是常规的1段婴儿配方食品(预期用于0-6个月的婴幼儿的婴儿配方食品)，其类似于实施例1的婴儿配方食品“对照”，不同之处在于其最初不含益生菌动物双歧杆菌乳酸亚种(bifidobacteriumanimalisssp.lactis)(＝b.lactis)。
在婴幼儿年龄为4个月时收集粪便样品，在排便后于4℃下冷藏最多10小时，并于-80℃下冷冻保存直至进行微生物群分析。
粪便微生物群分析
在17名婴幼儿(组o)、15名婴幼儿(组v)和16名婴幼儿(组bf)中研究粪便微生物群组成。
通过对微生物种群中存在的16srna基因的可变区进行焦磷酸测序，测量粪便微生物群组成。用qiacube(qiagen)从粪便样本中提取dna。如先前所提出的设计引物[hamady，m.，walker，j.j.，harris，j.k.，n.etal.(2008)，error-correctingbarcodedprimersforpyrosequencinghundredsofsamplesinmultiplex，nat.methods，5：235-237]以扩增16s基因的v1至v3可变区，显示出高的分类信息水平。使用条形编码技术，进行多重焦磷酸测序。使用qiime分析软件包[caporaso，j.g.，kuczynski，j.，stombaugh，j.etal.(2010)，qiimeallowsanalysisofhigh-throughputcommunitysequencingdata，natmethods，7(5)：335-6]来鉴定并分析高质量读段。以97％同一性将读段分组为操作分类单位(operationaltaxonomicgroup，otu)，并使用rdp分类器进一步分类[wang，q.，garrity，g.m.，tiedje，j.m.andcole，j.r.(2007)，naivebayesianclassifierforrapidassignmentofrrnasequencesintothenewbacterialtaxonomy，appl.environ.microbiol.，73：5261-5267]。使用qiime来计算样品之间的加权unifrac距离(其考虑otu之间的系统发育距离)。然后，在每组中，分析每种样品与母乳喂养组的样品相比的距离分布。由mann-whitneyu测试给出统计显著性。
另选地，通过利用基于随机程序的假设检验的多元排序(例如典范对应分析(canonicalcorrespondenceanalysis，cca)、冗余分析(redundancyanalysis，rda))、或多元参数或非参数检验(如adonis、anosim、多元anova)来评价相似性。预计有类似的结果。
结果
用具有b.lactis的配方食品喂养的婴幼儿(组o)的总体微生物群组成不同于用对照配方食品喂养的组，并且在系统发育上与母乳喂养的组更紧密相关(图1)。具体地讲，与对照配方食品组相比，b.lactis配方食品组(组o)具有增加的动物双歧杆菌和减少的粪芽孢菌属和链球菌属。
实施例3：临床研究
营养干预试验。在平均年龄为5天时，将115名健康的足月婴幼儿招募进营养干预试验中。将其母亲决定不母乳喂养的婴幼儿随机分配给1段婴儿配方食品(对照配方食品c，n＝37，1.8g蛋白质/100kcal；乳清/酪蛋白比率为70∶30)或补充有总低聚糖浓度为5.7±1.0g/100g粉末配方食品(在重构配方食品中为8g/l)的益生元(bmos)和益生菌(b.lactis菌株cncm-i-3446，1x107cfu/g粉末配方食品；1.4x107cfu/l重构配方食品)的相同配方食品(测试配方食品t，n＝39)，持续12周的喂养周期。将其母亲决定纯母乳喂养的婴幼儿招募进母乳喂养组(组b，n＝39)中，其充当生理参照组。试验中所用的“bmos”是如本发明中所定义的。
粪便性状。在按方案分析(perprotocolanalysis)中，在观察周期内排便次数从4.9次降低至2.4次排便/每天，各组之间没有差别(p＞0.4)。在喂养试验期间，来自t组而不是来自c组的婴幼儿显示出与b组婴幼儿相当的黄色粪便对绿色粪便的比例(图5)。颜色相似是具有类似/接近的微生物群的指示。
粪便微生物学分析：定量实时pcr。当按照指派的喂予方案时在第一次产品施用之前以及在6周大和12周大时从婴幼儿收集粪便样品。在按方案分析中，可获得每个组和时间点的来自18至23名婴幼儿的粪便。对每个时间点收集粪便样品，在排便后于4℃下冷藏最多10小时，并于-80℃下冷冻保存直至进行微生物群分析。使用qiaampdnastoolminikit(qiagen)，按照制造商的说明提取总dna，不同的是使用fastprep装置和lysingmatrixb管(mpbiochemicals公司)增加一系列的机械破碎步骤(11×45s)。我们使用容许分类分化的16srrna基因引物。在招募时大与6周大之间所有三个组中双歧杆菌的总计数增加，此后其保持恒定直至12周(图4a)。与c组中的婴幼儿相比，t组中的婴幼儿显示出更明显的双歧杆菌属滴度的增加，增加0.8log。在t组中，双歧杆菌的最终粪便滴度为0.8×1010个细菌/g粪便，显著高于c组中和b组中的滴度。相比于t组，来自c组的婴幼儿中拟杆菌属(bacteroides)和乳杆菌分别显示出高10倍和低10倍的粪便数目(数据未显示，以及图4b)。
为了在双歧杆菌属中实现进一步解析，我们使用了一套基于groel基因的qpcr引物，其允许检测12种双歧杆菌属物种两岐双岐杆菌(b.bifidum)和长双歧杆菌(图4c和图4d)。
微生物群组成：多样性指数。通过16srrna基因焦磷酸测序来补充微生物群分析。在roche454gs-flx-titanium测序仪上pcr扩增16s可变区v1至v3并测序。用mothurv.1.33.0软件包(schloss，p.d.，s.l.westcott，t.ryabin，j.r.hall，m.hartmann，e.b.hollister，r.a.lesniewski，b.b.oakley，d.h.parks，c.j.robinson，j.w.sahl，b.stres，g.g.thallinger，d.j.vanhornandc.f.weber(2009)。“introducingmothur：open-source，platform-independent，community-supportedsoftwarefordescribingandcomparingmicrobialcommunities。”appliedandenvironmentalmicrobiology75(23)：7537-7541.)和qiimev.1.8软件包(caporaso，j.g.，kuczynski，j.，stombaugh，j.，bittinger，k.，bushman，f.d.，costello，e.k.etal.(2010b)qiimeallowsanalysisofhigh-throughputcommunitysequencingdata.natmethods7：335-336)分析原始序列数据。以97％同一性进行otu从头挑选(denovopicling)并在greengenes参考数据库v.13.8上用rdp分类器进行otu代表性序列的分类指派(taxonomyassignment)。使用pynast在greengenes核心参考比对数据集上将相同的序列进行比对。然后过滤所得的多重比对并用于利用fasttree构建系统树。在质量过滤后，将所有样品之间的系统发育距离计算为unifrac距离。在分析并排除具有不完整数据集的受试者后，我们获得了来自每组至少13名婴幼儿的所有三个时间点的粪便微生物群组成。图3比较了基线时以及喂予6周和12周后三个组的α-多样性(用calypso计算，http://bioinfo.qimr.edu.au/calypso)。在基线时，三个喂养组在微生物多样性(香农指数(shannonindex))方面差异不显著。在6周大时，当与t组和b组中的婴幼儿相比时，c组中的婴幼儿由于丰富度和均匀度二者的增加，显示出更高的多样性指数。在12周大时，c组而不是t组在多样性和丰富度方面不同于b组。使用qiime计算样品之间的加权unifrac距离(其考虑otu之间的系统发育距离)。然后，在每组中，分析每种样品与母乳喂养组的样品相比的距离分布。由mann-whitneyu测试给出统计显著性(图2)。用具有b.lactis和bmos的配方食品喂养的婴幼儿(t)的总体微生物群组成不同于用对照配方食品喂养的组(c)，并且在系统发育上与母乳喂养的组(b)更紧密相关。
实施例4：另外的临床研究
营养干预；随机双盲对照试验。
在南非进行的多中心随机对照双盲试验测试了补充有益生元即从乳清渗透物产生的牛乳衍生低聚糖(bmos)的混合物(含有低聚半乳糖和乳低聚糖诸如3′-和6′-唾液乳糖)和益生菌即动物双歧杆菌乳酸亚种(bifidobacteriumanimalisssp.lactis)(b.lactis)菌株cncmi-3446的配方食品对经阴道分娩的婴幼儿或经剖腹产的婴幼儿在早期生命中肠道内的双歧杆菌水平的影响。另外还评价了新配方的安全性。试验中所用的“bmos”是如本发明中所定义的。
将总共430名健康、足月、由hiv阳性母亲生产的婴幼儿随机分配进具有4个平行组的该多中心试验中，这些婴幼儿的母亲被选择成仅用配方食品从出生(≤3天大)开始喂养她们的小孩。将总共421名已摄入任何研究配方食品的婴幼儿包括在全分析集(fullanalysisset，fas)中。
第一两组由指派给测试配方食品(1段婴儿配方食品，其含有总低聚糖为5.8±1.0g/100g粉末配方食品(在重构的配方食品中为8g/l)的bmos+b.lactis(1×107cfu/g))的剖腹产婴幼儿(n＝92)或指派给对照婴儿配方食品的剖腹产婴幼儿(n＝101)组成，第二两组由随机分配给相同测试配方食品的经阴道分娩的婴幼儿(n＝115)或随机分配给对照配方食品的经阴道分娩的婴幼儿(n＝113)，从招募开始到第6个月。
主要的功效结果为第10天时的粪便双歧杆菌计数，主要的安全性结果为介于第10天和第4个月之间的每日增重(g/天)。
在第10天时，在剖腹产婴幼儿中测试配方食品组中比对照配方食品组中粪便双歧杆菌计数显著更高(中值[范围］log：9.41[6.30-10.94]cfu/g对6.30[6.30-10.51]cfu/g，wilcoxon检验，p＝0.002)，但在经阴道分娩的婴幼儿中并不如此(中值[范围]log：10.06[5.93-10.77]cfu/g对9.85[6.15-10.79]cfu/g，p＝0.126)。在经阴道分娩的婴幼儿和经剖腹产的婴幼儿二者中，测试配方食品组与对照配方食品组之间的平均每日增重差异的双侧95％置信区间的下限均高于-3g/天，从而表明测试配方食品喂养的婴幼儿中的生长不次于对照配方食品喂养的婴幼儿。
在第10天和第4周，用测试配方食品喂养的婴幼儿的粪便ph显著低于用对照配方食品喂养的婴幼儿中的ph，而不管分娩方式如何：对于阴道分娩：4.93对5.59p＜0.001(第10天)以及5.01对5.71p＜0.001(第4周)，对于剖腹产：5.14对5.65p＝0.009(第10天)，5.06对5.75p＜0.001(第4周)。在第3个月时，这种酸化效果仅在剖腹产婴幼儿中持续。补充有益生元bmos和益生菌b.lactis的婴儿配方食品在两种分娩方式中均诱导强的促双歧杆菌生长效果(bifidogeniceffect)，但从出生开始校正剖腹产婴幼儿中存在的低双歧杆菌水平更加明显。补充了的婴儿配方食品降低了粪便ph并改善了正常分娩的婴幼儿和剖腹产婴幼儿二者中的粪便微生物群。
详细结果：(还可参见图6)
在fas种群中，剖腹产婴幼儿(图6中的正方形)中与对照组相比，测试配方食品组中第28天和第3个月(第84天)的双歧杆菌计数也显著更高。然后，在第28天，测试配方食品组和对照配方食品组中，中值[范围]log双歧杆菌计数分别为10.15[6.30-10.96]cfu/g和9.00[6.30-10.77]cfu/g(非参数wilcoxon检验，p＝0.001)。在第84天，测试配方食品组和对照配方食品组中，中值[范围]log双歧杆菌计数分别为10.40[6.50-10.79]cfu/g和9.67[6.30-10.50]cfu/g(非参数wilcoxon检验，p＜0.001)。
在经阴道分娩的婴幼儿(图6中的三角形)中，与对照配方食品组相比，在第28天和第84天，测试配方食品组也具有显著增加的双歧杆菌计数。在第28天，测试配方食品组和对照配方食品组中，中值[范围]log双歧杆菌计数分别为10.25[6.75-10.98]cfu/g和9.66[6.30-10.31]cfu/g(非参数wilcoxon检验，p＜0.001)。在第84天，测试配方食品组和对照配方食品组中，中值[范围]log双歧杆菌计数分别为10.45[8.22-10.96]cfu/g和9.95[6.30-10.17]cfu/g(非参数wilcoxon检验，p＜0.001)。
在采用任一分娩方式的婴幼儿中，第3天和第10天的总细菌计数在测试配方食品组和对照配方食品组之间没有显著不同(数据未示出)。然而在第4周，在两种分娩组中总细胞计数在测试配方食品组中均较高，在第3个月，仅在经阴道分娩的婴幼儿中总细胞计数在测试配方组中较高(数据未示出)。
最多至第4周，与对照配方食品组相比，测试配方食品组中更高比例的婴幼儿具有可检测的双歧杆菌属物种(数据未示出)。与对照相比，在测试配方食品组中，乳杆菌属物种分别在经剖腹产的婴幼儿和经阴道分娩的婴幼儿中在第4周和第3个月在更高比例的婴幼儿中可检测。在第10天、第4周和第3个月，与对照配方食品组中的那些相比，测试配方食品组中在显著更高比例的婴幼儿中检测到b.lactis(数据未示出)。与测试配方食品组相比，对照配方食品组中在显著更高比例的婴幼儿中检测到大肠杆菌和葡萄球菌属(staphylococcus)、肠杆菌属(enterobacteria)和克雷伯氏杆菌属(klebsiella)物种(数据未显示)。