本发明涉及用于婴儿和幼儿的营养组合物以及它们在婴儿中的健康效应。具体地，它涉及包含相对高量的低聚果糖和任选地相对高量的高sn-2棕榈酸酯甘油三酯的婴儿配方食品。
背景技术：
每当母亲不能母乳喂养她们的婴儿时，婴儿配方食品可为使用人类母乳的天然母乳喂养提供合适的替代方案。用于婴儿和幼儿的营养组合物通常作为用水重构的散剂或在某些情况下作为即饮型或浓缩液体组合物出售。这些组合物打算覆盖婴儿或幼儿的大部分或所有营养需要。
然而，据了解，人类母乳代表了婴儿营养方面的终极黄金标准。婴儿配方食品制造商已作出许多尝试来诱导接近或类似于人类母乳的益处的营养健康影响。
建议所有婴儿采用母乳喂养。然而，在一些情况下，由于某些医学原因，母乳喂养并不足够或不成功，或者母亲不选择母乳喂养。已针对这些情况研发了婴儿配方食品。还研发了用特殊成分丰富母乳或婴儿配方食品的强化剂。
在许多实例中，研究表明，与人类母乳相比，婴儿配方食品不对身体诱导相同的效应。例如，喂食婴儿配方食品的婴儿和喂食人类母乳(hbm)的婴儿可表现出不同的肠微生物群。
婴儿期，尤其是头几周、头3个月、头6个月或头12个月，对于建立平衡的肠道微生物群是至关重要的。
已知婴儿期肠道微生物群的调节对于身体的未来健康状况可预期具有重大影响。例如肠道微生物群可对日后肥胖症的发展、对日后强健免疫系统的发育或正常的生长具有影响。其它长期效应也已被证明或有所描述。
健康的肠微生物群是婴儿健康的指示，并且肠微生物群的改变可能是异常健康事件诸如腹泻、营养物质吸收不足、绞痛、睡眠改变和生长和发育改变的指示(和/或起因)。
已知分娩方式可影响婴儿的初始肠道微生物群：与经阴道分娩的婴儿相比，经剖腹产分娩的婴儿具有不同的肠道微生物群。
已知，除了其它成分之外，非消化性碳水化合物(益生元)具体地会影响促进特定微生物群。例如，已证实某些低聚半乳糖(gos)和/或某些低聚果糖(fos)可促进肠道尤其是婴儿肠道中的双歧杆菌的生长和繁衍。
然而，在婴儿的发育过程中，肠道微生物群及其进化是许多肠道细菌种群的存在和繁衍(数量)之间的精密平衡。关于肠道细菌对婴儿总体健康的影响，一些肠道细菌被分类为“通常阳性”，而另一些为“通常阴性”(或潜在或已知致病菌)。
相比于母乳喂养的婴儿，某些种类的细菌(诸如双歧杆菌)，在喂食常规婴儿配方食品的婴儿中可能不足。类似地，一些细菌种群被认为是潜在或已知致病性的，并且在肠道微生物群中应保持低繁衍。
的确用婴儿配方食品喂养的婴儿可能不能获益于完全或主要用人类母乳喂养的婴儿的天然、良好平衡的肠肠道微生物群。母乳喂养的婴儿中所观察到的这种天然微生物群确实既随时间推移得到良好控制(随时间而演变)又十分复杂。许多微生物类群共存于肠道/肠内的高度复杂微环境中，每一者以依序限定的比例存在。当限定婴儿或幼儿的微生物群时，应该考虑数量维度和质量维度。此外，肠道微生物群随时间推移的变化增加了复杂性。实际上，在胃肠道的每个位置中存在的细菌所有科、属、种和菌株的细微平衡以及其随时间的变化均有助于婴儿和幼儿的“肠胃健康”。虽然已认识到，人类母乳(hbm)喂养的婴儿的“胃肠健康”代表靶标，但对如何促进婴儿配方食品喂养的婴儿的肠道微生物群以模拟hbm喂养的婴儿的肠道微生物群中的组成和多样性知之甚少。
虽然许多研究已确定了促进特定阳性细菌或细菌群在婴儿肠道中的生长和繁衍的方法，但对于诱导在其完全组成和多样性上与母乳喂养的一个婴儿相似的总体微生物群的方法知之甚少。
对于婴儿配方食品喂养的婴儿，存在促进和/或诱导接近母乳喂养的婴儿的微生物群的总体微生物群的需要。
对于婴儿配方食品喂养的婴儿，存在促进和/或诱导在种、属、科、目、纲和/或门水平上其组成和多样性与母乳喂养的婴儿接近的总体微生物群的需要。
对于婴儿配方食品喂养的婴儿，存在促进和/或诱导接近母乳喂养的婴儿(特别是在系统发育学上接近)的细菌群落的需要。
对于婴儿配方食品喂养的婴儿，存在随时间推移促进和/或诱导以与母乳喂养的婴儿的微生物群相似的方式演变的微生物群的需要。
对于婴儿配方食品喂养的婴儿，还需要为他们提供最佳营养，以在提供营养干预(短期)期间和/或在停止提供营养干预(长期)后支持接近母乳喂养的婴儿的微生物群的微生物群的发展。
对于婴儿配方食品喂养的婴儿，存在通过诱导和/或促进接近/类似母乳喂养的婴儿的微生物群的微生物群的发展的营养干预，来诱导最佳的短期或长期健康状态的需要；这种健康状态包括随时间推移的最佳生长，和免疫系统的最佳发育，以及代谢障碍的预防。
存在补偿非母乳喂养的婴儿中观察到的低常微生物群的需要。存在使这种微生物群再平衡的需要。
存在在未喂养或非完全喂养人类母乳的婴儿中促进健康的微生物群的需要。对于那些患有非平衡微生物群的婴儿或幼儿存在特别需要，并且对患有影响其肠道微生物群的健康状况的那些甚至更存在需要(例如在感染期间/之后，营养不良一段时间后，腹泻发作后，剖腹产婴儿群体等)。
对于婴儿配方食品喂养的婴儿，存在诱导和/或促进特定的细菌纲、目、科、属、种或菌株在他们肠的发育以获得接近母乳喂养的婴儿的微生物群的微生物群的需要。
对于婴儿配方食品喂养的婴儿，存在抑制和/或下调特定的细菌纲、目、科、属或种或菌株在他们肠的发育以获得接近母乳喂养的婴儿的微生物群的微生物群的需要。
存在下调婴儿和幼儿肠道中潜在或已知致病菌或“阴性细菌”的发育和生长的需要。
存在选择性地影响或降低婴儿和幼儿肠道中潜在或已知致病菌的生长，同时促进或至少不影响潜在或已知阳性肠道细菌的生长的需要。存在诱导微生物群的低多样性的需要，如在母乳喂养的婴儿中观察到的。
在正建立这种平衡的出生的头几个星期内，存在增强婴儿的总体肠道微生物群中的良好平衡，特别是通过下调或抑制潜在或已知致病菌的生长的需要。
存在通过耐受性良好的“软冲击”(指没有或有很少的副作用)来增强这种良好平衡的需要。
存在减少或抑制婴儿和幼儿肠道内潜在或已知致病菌的生长的需要。
例如，存在负面地影响潜在或已知致病菌的生长，并促进婴儿和幼儿肠道内潜在或已知的有益菌的生长，但避免促进硬便、痉挛和绞痛的需要。
由manjiangyao等人于2013年5月16日公布的wo2013068879a2报道了高sn-2棕榈酸酯饮食(存在或不存在低聚果糖)在婴儿中对粪便柔软性和阳性细菌(诸如双歧杆菌)的诱导的影响。然而，该文件对肠道菌群的整体组成和多样性只字未提。
技术实现要素：
本发明涉及用于婴儿和幼儿的营养组合物，诸如婴儿配方食品或较大婴儿配方食品。组合物可呈粉末状形式或呈液体形式。当呈即饮液体形式时，组合物包含至少4g/l或至少5g/l的低聚果糖。当呈粉末状形式或浓缩液体形式(即，在食用之前需要稀释)时，组合物包含足量的低聚果糖以在重构组合物中获得至少4g/l或5g/l的低聚果糖。优选地，组合物呈粉末状形式。组合物可包含高sn-2棕榈酸酯。
与主要用不包含本发明组合物的常规婴儿配方食品喂养的婴儿相比，该组合物促进或诱导更接近完全用人类母乳喂养的婴儿(所谓的完全用母乳喂养的婴儿)的微生物群的肠道微生物群。
所述婴儿或幼儿可为介于0月龄和36月龄之间，优选地介于0月龄和12个月龄之间。
本发明的组合物具有下调、减少或抑制生长以及降低潜在或已知致病菌的丰度并且/或者促进有益菌(例如双歧杆菌)的丰度并且/或者诱导在婴儿或幼儿肠道中多样性较少的微生物群的效应。
附图说明
图1a至1d示出了各种营养组合物对婴儿微生物群的效应。它示出了在沿着3轴作图时各组细菌的相对重要性。六种最丰富的细菌属(所有样品中相对丰度的加权平均值)的坐标由灰泡指示。
图2和表2：图2示出了通过使用加权unifrac距离计算喂食组从一个组到另一个组的细菌群落的平均系统发育距离。中值距离显示为包含四分位距的框，以及显示该范围的晶须。表2示出了图2(t检验)中距离分布差异的统计显著性。
图3和表3：图3示出了通过使用按样品计算的香农多样性指数喂食组从一组到另一组的微生物群多样性。中值多样性显示为包含四分位距的框，以及显示该范围的晶须。表3示出了图3(t检验)中多样性的分布差异的显著性。
图4和表4a至4b：图4示出了通过喂食组在每个组中的双歧杆菌的相对丰度。中值多样性显示为包含四分位距的晶须。表4a和4b示出了每个组中双歧杆菌属量的差异的统计学显著性(kruskal-wallis检验和dunn多重比较检验)。
图5和表5a至5b：图5示出了通过喂食组在每个组中的消化链球菌科(潜在致病菌组的示例)的相对丰度。中值多样性显示为包含四分位距的晶须。表5a和5b示出了每个组中消化链球菌科量的差异的统计学显著性(kruskal-wallis检验和dunn多重比较检验)。
具体实施方式
定义：
如本文所用，下列术语具有如下含义。
术语“婴儿”是指年龄在12个月以下的儿童。
表述“幼儿”是指年龄介于一岁和三岁之间的儿童，也称为学步儿。
“经剖腹产出生的婴儿或幼儿”是指通过剖腹产分娩的婴儿。这意味着婴儿不是经阴道分娩的。
“早产”或“早产的”是指不足月出生的婴儿或幼儿。通常是指在36周妊娠之前的出生的婴儿。
表述“营养组合物”是指供给受试者养分的组合物。一般情况下，营养组合物经胃肠道或不经胃肠道摄入，或者以口服或静脉注射方式摄入，并通常包含脂质或脂肪源和蛋白质源。优选地，营养组合物用于口服使用。
表述“低变应原营养组合物”是指不大可能引起变态反应的营养组合物。
表述“合成组合物”是指采用化学和/或生物方法获得的混合物，该混合物的化学性质可能与哺乳动物乳汁中天然存在的混合物相同。
表述“婴儿配方食品”是指打算用于专门供给出生后4至6个月婴儿营养，而且本身可满足这类婴儿的多种营养需求的食品(符合欧盟委员会1991年5月14日颁发的针对婴儿配方食品和较大婴儿配方食品的第91/321/eec号指令中第1.2条的规定)。
表述“1段婴儿配方食品”是指打算用于专门供给出生后不满4个月婴儿营养的食品。
表述“较大婴儿配方食品”是指打算用于专门供给4个月以上大的婴儿营养、并且是这类婴儿逐渐多元化的饮食中的主要流质成分的食品。
术语“婴孩食物”是指打算用于专门供给出生后不满1岁婴儿营养的食品。
表述“强化剂”是指适宜与母乳或婴儿配方食品混合的液态或固态营养组合物。
术语“离乳期”是指在婴儿饮食中逐步用其它食物替代母乳的这一时期。
“母乳”应理解为母亲的母乳或初乳(＝人类母乳＝hbm)。
本文所用的术语“低聚果糖”是指果糖低聚物。其可为长链或短链，具体取决于低聚果糖的聚合度(单体的数量)。优选地，本发明的低聚果糖为短链低聚果糖，最优选地其具有2至10的聚合度，例如2至8的聚合度。
本文所用的术语“sn-2棕榈酸酯”是指棕榈酸在甘油三酯的sn-2位与其键合。
“高sn-2棕榈酸酯甘油三酯”(或“高sn-2棕榈酸酯”)是指在sn-2位含有超过30％的棕榈酸的甘油三酯(tg)。例如，由脂类营养公司(lipidnutrition)出售的可商购获得的高sn-2棕榈酸酯成分是betapoltmb-55。其为来源于植物油的甘油三酯混合物，其中至少54％的棕榈酸处于甘油分子的sn-2位。
“α-乳白蛋白”是指高质量的易于消化的乳清蛋白质，其包含20％至25％的总人类母乳(hbm)蛋白质，并且是hbm中发现的主要蛋白质。α-乳白蛋白的结构由123个氨基酸和4个二硫键组成，并且该蛋白质具有14.2k道尔顿的分子量。由于α-乳白蛋白具有高含量的必需氨基酸(具体地色氨酸)，所以它是低蛋白质婴儿配方食品的理想选择。
术语“益生元”是指通过选择地刺激健康细菌(诸如人类结肠中的双歧杆菌)的生长和/或其活性而对宿主产生有益影响的非消化性碳水化合物(gibsongr,roberfroidmb.dietarymodulationofthehumancolonicmicrobiota:introducingtheconceptofprebiotics.jnutr.1995；125:1401-12(gibsongr,roberfroidmb.，人类结肠微生物群的饮食调节：引入益生元的概念，《营养学杂志》，1995年，第125卷，第1401页至1412页))。
术语“益生菌”是指对宿主的健康或良好状态具有有益影响的微生物细胞制剂或微生物细胞组分。(salminens,ouwehanda.bennoy.etal.“probiotics:howshouldtheybedefined”trendsfoodsci.technol.1999:10107-10(salminens.、ouwehanda.、bennoy.等人，“如何定义益生菌”，《食品科学与技术趋势》，1999年，第10卷，第107页至110页))。微生物细胞一般为细菌或酵母。
术语“cfu”应理解为菌落形成单位。
除非另外指明，否则所有百分比均按重量计。
现在开始更详细描述本发明。应当注意，本申请描述的多个方面、特征、实施例和实施方案可以相容和/或可以组合在一起。
另外，在本发明的上下文中，术语“包含”或“包括”不排除其它可能的要素。本发明(包括本文所述的多个实施方案)提到的组合物可包含下列要素、由或基本上由下列要素组成：本文所述的基本要素和必要限制，以及本文所述的任何附加的或可选(或者说视需求来定)的成分、组分或限制。
具体实施方式
通常，呈即食型(ready-to-consume)液体形式的婴儿配方食品(例如由粉末重构而来)提供60kcal/100ml至70kcal/100ml。婴儿配方食品通常包含每100kcal：约1.8g至4.5g蛋白质；约3.3g至6.0g脂肪(脂质)；约300mg至1200mg亚油酸；约9g至14g选自乳糖、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖浆、淀粉、麦芽糖糊精和麦芽糖以及它们的组合的碳水化合物；以及必需维生素和矿物质。乳糖可以是婴儿配方食品中的主要碳水化合物。例如，液体婴儿配方食品可含有约67kcal/100ml。在一些实施方案中，婴儿配方食品可包含每100kcal约1.8g至3.3g蛋白质。婴儿配方食品可以呈粉末的形式，可通过添加一定量的水将该粉末重构成即可喂养型(ready-to-feed)液体，该量的水导致例如具有约67kcal/100ml的液体。
婴儿配方食品还可以包含选自胞苷5'-单磷酸(cmp)、尿苷5'-单磷酸(ump)、腺苷5'-单磷酸(amp)、鸟苷5'-单磷酸(gmp)和肌苷5'-单磷酸(imp)以及它们的混合物的核苷酸。婴儿配方食品还可以包含叶黄素、玉米黄质、低聚果糖、低聚半乳糖、唾液乳糖和/或岩藻糖基-乳糖。婴儿配方食品中可以包含长链多不饱和脂肪酸，诸如二十二碳六烯酸(dha)和花生四烯酸(aa)。婴儿配方食品还可以包含游离氨基酸。婴儿配方食品还可以包含本领域熟知的其它成分。
在一个实施方案中，本发明的婴儿配方食品包含每100kcal约5g至6g的脂肪(甘油三酯)，其中该脂肪的至少约7.5重量％(例如约7.5重量％至12.0重量％)由处于甘油三酯sn-2位的棕榈酸组成。在一些实施方案中，脂肪的约7.8重量％至11.8重量％、约8.0重量％至11.5重量％、约8.5重量％至11.0重量％或约9.0重量％至10.0重量％是位于甘油三酯sn-2位的棕榈酸。
在一些实施方案中，按重量计，棕榈酸占配方食品的总脂肪酸含量的约15％至约25％，诸如约15％至约20％，并且总棕榈酸含量的至少约30％(例如，约35％)至约43％位于sn-2位。
在一些实施方案中，婴儿配方食品还包含比率为约6至约1的至少一种ω6脂肪酸和至少一种ω3脂肪酸。在一个实施方案中，至少一种ω6脂肪酸占总脂肪酸的约10重量％至约15重量％，并且至少一种ω3脂肪酸占总脂肪酸的约1.2％至约3.6％。在一些实施方案中，婴儿配方食品包含至少一种以总重量的约2％至约4％存在的ω6脂肪酸和至少一种以总重量的约0.3％至约0.6％存在的ω3脂肪酸。
本发明的婴儿配方食品中的脂肪包括在牛奶和/或婴儿配方食品中常见的各种甘油三酯。甘油三酯中最常见的脂肪酸残基是棕榈酸和油酸。除了存在的油酸和棕榈酸之外，脂肪酸残基包括但不限于亚油酸、α-亚麻酸、月桂酸、肉豆蔻酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸。
最近的婴儿临床研究已经表明，含有比率为约6至约1的至少一种ω6脂肪酸和至少一种ω3脂肪酸的营养配方产品增加了红细胞和血浆中dha的吸积。ω6脂肪酸与ω3脂肪酸的约6:1的平衡比率也可以提供长期的健康益处，包括对心血管疾病的保护。这种平衡将通过用具有ω6脂肪酸含量的植物油脂肪源(诸如例如，大豆油和葵花油)和ω-3脂肪酸含量(例如，油菜籽、卡诺拉、亚麻籽、奇亚(chia)、紫苏属或核桃)配制本发明来实现。将使用具有5种不同油的独特脂肪共混物来实现改性的脂肪共混物。
在一个实施方案中，本发明的婴儿配方食品包含每100kcal约1.8g至约2.2g的总蛋白质，例如每100kcal约1.8g至约2.1g、或约1.9g至约2.1g蛋白质，其中约0.3g/100kcal至约0.4g/100kcal的蛋白质是α-乳白蛋白。本发明的婴儿配方食品可呈即喂型液体的形式，或者可为可通过加入一定量的水来重构成即食型液体从而产生具有约67kcal/100ml的液体的液体浓缩物或粉末状配方食品。本发明的婴儿配方食品包含美国或欧盟法律要求的所有成分，包括但不限于某些维生素、矿物质和必需氨基酸。它还可以包含核苷酸(诸如cmp、ump、amp、gmp和imp)、叶黄素、玉米黄质和本领域已知的其它成分。
低聚果糖(of)
本发明的婴儿配方食品可包含每100kcal组合物至少约0.5g、至少0.6g或至少0.7g的低聚果糖。在一些实施方案中，其含有每100kcal约0.5g至约0.9g、约0.6g至约0.7g、约0.7g至约0.8g、或约0.7g至约0.9g低聚果糖。
在一些实施方案中，低聚果糖具有2至10的聚合度。在一些实施方案中，至少80％、90％、95％、99％或100％的低聚果糖具有2至8(介于2和8之间)的聚合度。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含：
-当组合物为即饮型液体组合物时，至少5g/l或至少4g/l的低聚果糖(of)，或者
-当所述营养组合物为粉末状或浓缩组合物时，足够量的低聚果糖以在重构组合物中分别获得至少4g/l或至少5g/l的低聚果糖。
在一些实施方案中，本发明的营养组合物包含至少0.5g或至少0.6gof/100kcal组合物，或至少0.7g、或至少0.75g、或至少0.8g或至少0.9gof/100kcal组合物。
从实施例所示的结果来看，普遍认为高量的低聚果糖递送更强的作用。低聚果糖的有益效应的上限可为：然而，当不利的副作用开始时存在。这种上限可为例如2.2g/100kcal、2.0g/100kcal、1.8g/100kcal、1.5g/100kcal或1.2g/100kcal。优选地，本发明的组合物包含5gof/l组合物或0.75g或0.9gof/100kcal组合物或至少这种量。
实验证据表明，等于或低于3g/l或等于或低于0.4g/100kcal的水平不或可仅部分地诱导本发明所需的效应。
其它的低聚糖：
也可在本发明的上下文中使用其它低聚糖(而不是of)。在一个优选的实施方案中，其它低聚糖为唾液酸化低聚糖和gos的混合物。
在一个实施方案中，(其它)低聚糖的混合物包含n-乙酰化低聚糖、低聚半乳糖(gos)和唾液酸化低聚糖。
在一个实施方案中，该组合物包含：
·介于0.001重量％至1重量％之间、优选地介于0.003重量％和0.3重量％之间的n-乙酰化低聚糖
·介于1重量％和10重量％之间、优选地介于3重量％和6重量％之间的低聚半乳糖
·介于0.005重量％和1重量％之间、优选地介于0.01重量％和0.4重量％之间的唾液酸化低聚糖
健康效应
本发明的组合物对受试者婴儿或幼儿的微生物群具有积极影响。这种积极效应的特征在于下调，减少或抑制潜在或已知致病菌的生长，同时也促进有益菌的生长。此类细菌可天然定位在肠道中，或可具有外源来源。
可例如通过对粪便的分析来测量生长的这种变化。生长的这种变化优选地在4周、8周、12周、16周或24周龄时测量。可例如，通过与不包含本发明中存在的低聚果糖的常规营养组合物(例如婴儿配方食品)喂养的婴儿的肠道微生物群相比较来评价生长的这种变化。
重要的是，观察到的变化诱导维持肠道微生物群的低多样性。
本发明的组合物对大量肠道细菌具有总体效应。在本发明的各种实施方案中，丰度的变化对双歧杆菌属和/或消化链球菌科以及全球细菌群落测量(参见附图)特别有效(可见/可测量)。
通过分别调节(下调，减少和/或抑制和/或上调或促进)潜在或已知致病菌和/或有益菌的种群的生长，本发明的组合物提供了积极的健康效应，并且有助于健康肠微生物群的诱导和维持。这样的健康肠道/肠微生物群最终与恰当的营养物质吸收、充分的生长、较少的绞痛、较少的腹泻以及最好的肠道健康相关联。
所诱导的微生物群在2个维度上是特定的：从数量上而言，肠道菌群包含较多的有益菌和较少的有害菌。从质量上而言，细菌群落与母乳喂养的婴儿的微生物群更相似。
本发明的效应可以是预防性的(例如避免肠道微生物群的失衡、避免肠道感染、维持健康的肠微生物群、诱导健康的肠微生物群)或治愈性的(当肠道微生物群受损时恢复健康的肠道微生物群、帮助消除或减少肠道/肠中的潜在或已知致病性种群、在由于例如腹泻或感染而引起的受损后诱导健康的微生物群)。通过下调、减少和/或抑制潜在或已知致病菌种群的生长，和/或诱导更多有益菌，从数量上和从质量上而言，本发明的组合物提供积极的健康效应。这样的健康肠道/肠微生物群最终与恰当的营养物质吸收、充分的生长、较少的绞痛、较少的感染、较少的腹泻以及最好的肠道健康相关联。
在一个实施方案中，本发明的组合物的特征在于在微生物群(即调节-下调，减少和/或抑制婴儿或幼儿肠道中潜在或已知的致病菌和/或上调或促进婴儿或幼儿肠道中潜在或已知的有益菌)上观察到的健康效应进一步诱导肠道微生物群与完全用母乳喂养的婴儿或幼儿的微生物群相似或更相似(当与常规组合物喂养的婴儿的微生物群比较时-即，不含本发明的基本特征物例如不含低聚果糖的组合物)。应当理解，诱导接近/类似于母乳喂养的婴儿的肠道微生物群的肠道微生物群是有益的，因为人类母乳代表婴儿营养的黄金标准。
在本发明的一个实施方案中，术语“促进或诱导更接近完全用人类母乳喂养的婴儿的微生物群的肠道微生物群”是指组合物诱导有益菌诸如促进双歧杆菌的生长，和/或下调潜在或已知致病菌的生长。
在本发明的一个实施方案中，术语“促进或诱导更接近完全用人类母乳喂养的婴儿的微生物群的肠道微生物群”是指以与主要用不含所述量的所述低聚果糖的常规营养组合物喂养的婴儿的微生物群相比组合物诱导微生物群多样性的减少使其更接近完全用人类母乳喂养的婴儿的微生物群，
在本发明的一个实施方案中，术语“促进或诱导更接近完全用人类母乳喂养的婴儿的微生物群的肠道微生物群”是指以与主要用不含所述量的所述低聚果糖的常规营养组合物喂养的婴儿的微生物群相比组合物诱导降低与完全用母乳喂养的婴儿的微生物群的系统发育和/或分类距离使其更接近完全用人类母乳喂养的婴儿的微生物群，
系统发育距离可通过加权unifrac方法测量，如文献中所述。
根据文献中所述，分类距离可通过bray-curtis距离基于基因水平分布来测量。
与所述婴儿相关的健康效应可通过如下面实施例中所示的各种方法来测量。然而在一个实施方案中，通过与母乳喂养的参考组的unifrac距离的平均分布来测量微生物群效应(参见下文)。
在一个实施方案中，健康效应“促进或诱导更接近完全用人类母乳喂养的婴儿的微生物群的肠道微生物群”的特征还在于促进或诱导与母乳喂养的婴儿的微生物群的系统发育距离小于0.3个单位(通过加权unifrac方法测量)、优选地小于0.25个单位或小于0.2个单位的肠道微生物群。
肠道微生物群多样性可通过“香农指数”来测量，如科学文献中已知。以香农多样性指数测量，本发明的组合物可诱导小于1.8，优选地小于1.5，更优选地小于1.3的微生物群多样性。
在本发明的一个实施方案中，肠道细菌的生长和/或多样性的调节可在婴儿粪便中测量，任选地可在8周龄或之后测量。
在本发明的一个实施方案中，术语“促进和/或诱导更接近完全用人类母乳喂养的婴儿的肠道微生物群”的特征还在于通过促进和/或诱导健康的生长、健康的免疫系统和/或健康的肠道功能，尤其是在以后的生活中。
本发明还包括本文所述的组合物用于诱导本文和上文所述的健康效应，尤其是在所述的目标群体中，更优选地在最易受益于健康有益效应的婴儿中的用途。
在一个实施方案中，本发明包括营养组合物用于婴儿和幼儿的用途，所述营养组合物包含：
-每100kcal所述营养组合物至少0.6g，或至少0.7g的量的低聚果糖，或者
-当所述组合物为即饮型液体组合物时，至少4g/l或至少5g/l的量的低聚果糖，或者
-当所述营养组合物为粉末状或浓缩组合物时，足够量的低聚果糖以在重构组合物中获得至少4g/l或至少5g/l的低聚果糖，
-任选地高sn2棕榈酸酯甘油三酯，
所述营养组合物用于促进或诱导介于0和36个月之间、任选地介于0和12个月之间、并且更优选地在患有不平衡的微生物群的婴儿的所述婴儿或幼儿的与主要用不包含所述量的所述低聚果糖的常规营养组合物喂养的婴儿的微生物群相比更接近完全用人类母乳喂养的婴儿的微生物群的肠道微生物群。
本发明还包括低聚果糖(和任选地高sn2棕榈酸酯甘油三酯)用于制造用于婴儿和幼儿的组合物的用途，所述组合物包含：
-每100kcal所述营养组合物至少0.6g，或至少0.7g的量的低聚果糖，或者
-当所述组合物为即饮型液体组合物时，至少4g/l或至少5g/l的量的低聚果糖，或者
-当所述营养组合物为粉末状或浓缩组合物时，足够量的低聚果糖以在重构组合物中获得至少4g/l或至少5g/l的低聚果糖，
所述营养组合物用于促进或诱导介于0和36个月之间、任选地介于0和12个月之间、并且更优选地在患有不平衡的微生物群的婴儿的所述婴儿或幼儿的与主要用不包含所述量的所述低聚果糖的常规营养组合物喂养的婴儿的微生物群相比更接近完全用人类母乳喂养的婴儿的微生物群的肠道微生物群。
目标婴儿
在一个实施方案中，婴儿或幼儿为足月出生的。所有婴儿均可从本发明中受益，因为所有婴儿在某一年龄可能或可能会容易获得不平衡的肠/肠道微生物群。在一个实施方案中，婴儿或幼儿为未足月出生的(早产)。在一个实施方案中，婴儿或幼儿为经阴道分娩的。在本发明的一个实施方案中，目标婴儿或幼儿天生具有脆弱的或不平衡的微生物群或微生物群失调。例如这类婴儿可以是早产婴儿、小于胎龄儿或经剖腹产出生的婴儿、住院的婴儿或用抗生素治疗或已用抗生素治疗的婴儿。在一个实施方案中，婴儿或幼儿为经剖腹产分娩的。可以预见的是，本发明的组合物对于可能天生具有受损的肠道微生物群或脆弱的婴儿(诸如早产婴儿和/或经剖腹产出生的婴儿)可能更有益处。还可以预见的是，本发明的组合物对于在出生后例如出生后的头4周内显示有肠疾病(诸如腹泻、感染或绞痛)的婴儿可能甚至更有益处。
在本发明的实施方案中，婴儿是早产或剖腹产出生的婴儿，或者表现出不平衡的或异常的肠微生物群或遭受肠感染；任选地，当婴儿为0月龄至6月龄时，所述以上病症是本发明的组合物的目标。不受理论的约束，据信年龄较小的婴儿从本发明中获益甚至更多，尤其是当婴儿具有(或有风险具有)“不平衡的肠微生物群”和/或具有脆弱的健康状况时(如上述条件所例示)。
在一个实施方案中，婴儿和幼儿为0月龄至6月龄、或0月龄至12月龄或0月龄至36月龄。可以预见的是，本发明的组合物对于刚出生(0周至4周或0周至8周)的婴儿可能更有益处，因为它们的肠道可能更脆弱。
在这类婴儿或幼儿中，获得接近母乳喂养的婴儿(优选地完全用母乳喂养的婴儿)的肠道微生物群的肠道微生物群特别引人关注。的确其为他们提供大量的健康要素，这些健康要素可以是有益处的，尤其对于那些脆弱的婴儿而言。
打算喂食方案：
在一个实施方案中，本发明的组合物在2周、4周、8周、12周期间或在至少2周、4周、8周、12周期间喂食给婴儿或幼儿(或打算喂食或指导喂食)。在优选的实施方案中，在婴儿出生后的头4周、8周或12周期间喂食(或打算喂食或指导喂食)。据信早期开始(在出生时或接近出生时)更倾向于诱导打算的效应。
益生菌
本发明的组合物可包含益生菌。优选地，益生菌有助于构建健康肠道微生物群。最优选地，益生菌与本发明组合物的低聚果糖协同作用。
在一个实施方案中，益生菌b.lactis是可购自丹麦科汉森(chr.hansen,denmark)的商业“bb12”。在一个实施方案中，益生菌动物双歧杆菌乳酸亚种(b.lactis)为cncmi-3446。
益生菌的剂量可例如介于105cfu/g组合物和1012cfu/g组合物之间，优选地其量足以与本发明组合物的低聚糖(例如of)产生协同效应，并且优选地介于106cfu/g组合物和108cfu/g组合物之间。
蛋白质/α-乳白蛋白
本发明的组合物包含蛋白质源。这种蛋白质源可例如递送介于1.6g/100kcal和3g/100kcal之间的蛋白质。在打算用于早产的婴儿的一个实施方案中，该量可介于2.4g/100kcal和4g/100kcal之间，或大于3.6g/100kcal。在一个实施方案中，该量可低于2.0g/100kcal，例如量低于1.8g/100kcal。
只要满足必需氨基酸含量的最低要求并确保令人满意的生长，并认为蛋白质的类型是对本发明最紧要的。然而，特定的蛋白质可向微生物群提供最适合的底物。因此，可使用基于乳清、酪蛋白以及它们的混合物的蛋白质源，也可使用基于大豆的蛋白质源。就所关注的乳清蛋白质而言，蛋白质源可基于酸乳清或甜乳清或它们的混合物，并且可包含任何所需比例的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。
优选地，蛋白质源主要是乳清(50％以上的蛋白质源于乳清蛋白质)。在一个实施方案中，组合物的蛋白质为完整蛋白质，或大部分(90％以上)为完整蛋白质。
该蛋白质可为完整的或水解的，或为完整蛋白质和水解蛋白质的混合物。所谓术语“完整的”是指蛋白质的主要部分是完整的，即分子结构未发生改变，例如至少80％的蛋白质未发生改变，诸如至少85％的蛋白质未发生改变，优选地，至少90％的蛋白质未发生改变，甚至更优选地，至少95％的蛋白质未发生改变，诸如至少98％的蛋白质未发生改变。在一个具体实施方案中，100％的蛋白质未发生改变。
术语“水解的”是指在本发明的上下文中，蛋白质已被水解或分解成其组成氨基酸。
该蛋白质可以是完全水解或部分水解的。例如，对于被认为处于发生牛的乳汁变态反应风险的婴儿而言，提供部分水解的蛋白质(水解程度介于2％和20％之间)可能是期望的。如果需要水解的蛋白质，则可根据需要并且如本领域已知的那样进行水解过程。例如，可通过在一个或多个步骤中对乳清级分进行酶法水解来制备乳清蛋白质水解产物。如果用作原料的乳清级分基本上不含乳糖，则发现该蛋白质在水解过程中经受少得多的赖氨酸封闭(lysineblockage)。这使得能够将赖氨酸封闭的程度从约15重量％的总赖氨酸降至小于约10重量％的赖氨酸；例如约7重量％的赖氨酸，这大大地提高了蛋白质源的营养质量。
在一个优选的实施方案中，组合物的蛋白质是水解的、完全水解的或部分水解的。蛋白质的水解度(dh)可介于8和40之间，或介于20和60之间，或介于20和80之间，或大于10、20、40、60、80、90。应当理解，水解蛋白质可对变态反应产生多种效应：水解蛋白质可能更不容易引起变态反应，因此更不容易触发免疫变态反应。水解蛋白质，特别是小分子肽(小于20个、10个或5个的氨基酸)可诱导口服耐受性，从而诱导受试者将来的变态反应状态。应当理解，水解蛋白质可通过提供双重效应有利地与本发明的低聚糖组合，该效应可能是通过在变态症状或变态状态的建立中以至少2个不同的水平起效的协同效应。
在本发明的一个实施方案中，至少70％的蛋白质被水解，优选地，至少80％的蛋白质被水解，诸如至少85％的蛋白质被水解，甚至更优选地，至少90％的蛋白质被水解，诸如至少95％的蛋白质被水解，具体地至少98％的蛋白质被水解。在一个具体实施方案中，100％的蛋白质被水解。
在一个实施方案中，水解蛋白质是蛋白质的唯一来源(即，100％或至少90％的蛋白质被水解)。
在一个实施方案中，水解蛋白质是蛋白质的主要来源(即，至少50％、优选地60％的蛋白质被水解)。
在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含至少0.2g/100kcal或0.3g/100kcal或0.4g/100kcal或至少1.7g/l，或2.0g/l或2.3g/l，或2.6g/l的量的α-乳白蛋白。据信特定量的α-乳白蛋白的存在通过例如向微生物群提供足够的营养底物而增强低聚糖的效应。
进一步益生元：
本发明的组合物也可进一步包含非消化性低聚糖(例如益生元)。其量通常介于组合物0.3重量％和10重量％之间。
益生元通常是非消化性的，在这个意义上来讲，它们在胃或小肠中是不被分解和吸收的，因而它们到达结肠时仍保持完整，在结肠处通过潜在或已知有益菌被选择性地发酵。益生元的示例包括某些低聚糖，进一步诸如低聚果糖(fos)和/或低聚半乳糖(gos)。可使用益生元的组合，诸如90％的gos与10％的短链低聚果糖。益生元的另一种组合是70％的短链低聚果糖和30％的菊粉(＝长链fos)。这两者以及低聚果糖(of)都可商购获得，具体地从beneo公司(beneogmbh,maximilianstrasse,68165,mannheim,germany)商购获得。
优选的营养组合物基质：
根据本发明的组合物可为合成营养组合物。其可为婴儿配方食品、1段婴儿配方食品、较大婴儿配方食品或强化剂(诸如人乳强化剂)或补充剂。优选地，本发明的组合物是打算用于不满4月龄或6月龄婴儿的婴儿配方食品或强化剂或补充剂。
脂肪/高sn-2棕榈酸酯：
在一个实施方案中，营养组合物包含具有高sn-2棕榈酸酯的甘油三酯，即，优选地在sn-2位具有超过33％的棕榈酸的甘油三酯。
在一个实施方案中，本发明的婴儿配方食品包含每100kcal约5g至6g的脂肪(甘油三酯)，其中该脂肪的至少约7.5重量％(例如约7.5重量％至12.0重量％)由处于甘油三酯的sn-2位的棕榈酸组成。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含的至少7.5％、优选地8％、更优选地至少9.6％的脂肪是sn-2棕榈酸酯。
在一些实施方案中，脂肪的约7.8重量％至11.8重量％、约8.0重量％至11.5重量％、约8.5重量％至11.0重量％或约9.0重量％至10.0重量％是位于甘油三酯的sn-2位的棕榈酸。
在一些实施方案中，按重量计，棕榈酸占配方食品的总脂肪酸含量的约15％至约25％，诸如约15％至约20％，并且总棕榈酸含量的至少约30％(例如，约35％)至约43％位于sn-2位。
在一些实施方案中，婴儿配方食品还包含比率为约6至约1的至少一种ω6脂肪酸和至少一种ω3脂肪酸。在一个实施方案中，至少一种ω6脂肪酸占总脂肪酸的约10重量％至约15重量％，并且至少一种ω3脂肪酸占总脂肪酸的约1.2％至约3.6％。在一些实施方案中，婴儿配方食品包含至少一种以总重量的约2％至约4％存在的ω6脂肪酸和至少一种以总重量的约0.3％至约0.6％存在的ω3脂肪酸。
本发明的婴儿配方食品中的脂肪包括在牛奶和/或婴儿配方食品中常见的各种甘油三酯。甘油三酯中最常见的脂肪酸残基是棕榈酸和油酸。除了存在的油酸和棕榈酸之外，脂肪酸残基包括但不限于亚油酸、α-亚麻酸、月桂酸、肉豆蔻酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸。
由脂类营养公司(lipidnutrition)出售的可商购获得的组合物是betapoltmb-55，其为来源于植物油的甘油三酯混合物，其中至少54％的棕榈酸位于甘油分子的sn-2位。在一个实施方案中，本发明组合物的脂肪含量为约40重量％至50重量％(例如约43重量％至约45重量％)的betapoltmb-55。本领域的技术人员将了解，在不脱离本发明的实质和范围的情况下，配方食品中所使用的高sn-2脂肪的百分比以及sn-2棕榈酸酯的总量可以有所变化，并且可使用不同的高sn-2棕榈酸酯油。
尽管用含有高百分比的sn-2棕榈酸酯的配方食品喂养的婴儿有助于产生较软的粪便和结肠中双歧杆菌的生长，但高sn-2棕榈酸酯与低聚果糖的组合提供了显著优越的粪便软化，同时诱导配方食品喂养的婴儿的结肠中最佳的肠道微生物群平衡。
呈现以下实施例以说明本发明的某些实施方案和特征，但不应理解为限制本发明的范围。
实施例1：
在以下实验结果中，所用的婴儿配方食品如下。组合物4为本发明的实施例，其中组合物1、2和3不是本发明的实施例，并且出于比较目的包括组合物1、2、3、4，所述组合物用于图1、2、3、4、5的实验中，并且分别引用为b、d、e、a：
“b＝对照”(组合物1)；
“d＝sn-2”(组合物2)，
“e＝sn-2+3g/lof”(组合物3)
“a＝sn-2+5g/lof”(组合物4)。
1.对照配方食品(不是本发明的组合物)，编码“对照配方食品”。
作为即食型液体婴儿配方食品，对照配方食品具有670kcal/l。成分如下所示：
对照配方食品还包括基本氨基酸、矿物质和痕量元素、核苷酸，以及常用于婴儿配方食品中的多种任选的成分和食品添加剂。
2.高sn-2配方食品(不是本发明的组合物)，编码“sn-2配方食品”。
该配方食品与对照配方食品相同，不同的是9.6重量％的脂肪为sn-2棕榈酸酯。这通过使用57％植物油和43％betapoltmb-55的脂肪来实现，其中约55％的棕榈酸在sn-2位。(betapol可从荷兰沃姆维尔1521az霍格维格1号的洛德斯克罗科兰公司，邮箱编号4,1520aa沃姆维尔(loderscroklaan,hogeweg1,1521azwormerveer,p.o.box4,1520aawormerveer,thenetherlands)商购获得)
3.高sn-2+低聚果糖配方食品a(不是本发明的组合物)编码“sn-2+3g/lof配方食品”。
该配方食品与高sn-2配方食品相同，不同的是其包括3.0g/l(0.4g/100kcal)低聚果糖。
4.高sn-2+低聚果糖配方食品b(本发明的组合物)，编码“sn-2+5g/lof配方食品”。
该配方食品与高sn-2配方食品相同，不同的是其包含5.0g/l(0.7g/100kcal)低聚果糖。
重要的是，本发明组合物的另一个实施例是不具有betapol成分的相同配方食品(其将9.6重量％的脂肪作为sn-2棕榈酸酯)。
下表1给出了组合物(1)“对照配方食品”，(2)“sn-2”配方食品，(3)“sn-2+3g/lof配方食品”和(4)“sn-2+5g/lof配方食品”的成分的详细列表。
表1：组合物的概述
实施例2-临床研究
设计和总体概述
使用来自健康菲律宾婴儿的8周随机对照试验的数据来比较喂食对照配方食品(对照)，高sn-2棕榈酸酯配方食品(sn-2)或具有3g/lof(sn-2+3g/lof)或5g/lof(sn-2+5g/lof)的相同配方食品的婴儿的子集，以及非随机的hm喂养组之间的肠道微生物群结果。这项研究包括3个诊所访问(基线，第4周和第8周)和3个电话呼叫(第2周，第6周，以及最后一次诊所访问后2周后的后续行动)。在基线访问时，收集了参与者人口统计和家庭特征。本分析的重点是42名婴儿(每组9个至12个)的子集，他们在第8周提供粪便样品，所述粪便样品待使用16srrna基因的焦磷酸测序分析排泄物微生物群组成和多样性。
该研究在2009年4月和9月之间在菲律宾muntinlupa市的muntinlupa健康中心进行。这项研究是根据赫尔辛基宣言中制定的指导方针进行的，并且涉及人类受试者/患者的所有程序均由国家道德委员会和菲律宾食品药品局批准。从每名婴儿的父母或法定监护人获得书面知情同意书。
参与者
根据菲律宾参考标准，招募7日至14日龄、按年龄计重≥5百分位的健康、足月(妊娠37周至42周)单生婴儿。需要婴儿完全食用并耐受适于配方食品喂养组的基于牛乳的婴儿配方食品，或完全食用适于hm喂养组的hm。鼓励母亲进行母乳喂养，并只有在母亲作出完全用配方食品喂养决定后，才开始参与配方食品喂养研究组。
如果婴儿目前正在接受或已接受可能潜在影响研究终点的药物，则将他们从该研究中排除；这些药物包括已知或疑似影响脂肪消化，吸收和/或代谢的任何药物(例如胰酶)；含有钙的任何维生素和/或矿物质补充剂；栓剂、含铋药物、草药补充剂或可中和或抑制胃酸分泌的药物。此外，如果婴儿目前正在接受或接受过任何抗生素或抗真菌药物(局部用除外)，则将他们从该研究中排除；以及如果hm喂养的婴儿的母亲在产后正在接受或接受了这些药物，则将他们排除。
当达到样品尺寸目标时，招募结束。试验结束时，最终受试者完成了所有协议要求，或退出研究。
研究喂食
随机化配方食品喂养的婴儿以获得4种配方食品(即类似于实施例1的组合物的组合物)中的任意一个：1.具有100％植物脂肪共混物(s-26gold，爱尔兰阿斯基顿的惠氏营养品公司(wyethnutrition,askeaton,ireland))的基于牛乳的，主要是乳清，富含α-乳白蛋白的足月婴儿配方食品(“对照”)；2.高sn-2棕榈酸酯配方食品(经修饰以含有60％的植物脂肪共混物和40％高sn-2棕榈酸酯脂肪共混物[betapoltm，荷兰沃姆维尔的洛德斯克罗科兰公司(loderscroklaan,wormerveer,thenetherlands)])(“sn-2”)的对照配方食品；3.以3.0g/l补充of(
粪便微生物群和生物化学
在基线(数据未示出)和第8周的临床访问中从婴儿的子集收集粪便样品。父母或法定监护人同意收集这些样品。研究人员使用附接到无菌聚丙烯小瓶的盖内部的勺子在诊所收集至少3g刚排出的粪便，并立即储存在-20℃冷冻器中。°将冷冻样品在干冰上运送至荷兰埃德的荷兰乳品研究所(nizofoodresearchb.v.,ede,thenetherlands)。
最初使用荧光原位杂交(fish)分析来确定细菌组的浓度(数据未显示)。
为了研究在粪便细菌组中观察到的变化，使用条形码焦磷酸测序对肠道微生物群进行分析。利用这种技术，来自微生物群的16srrna分子被pcr扩增并随机测序。
使用先前描述的方法从4摄氏度解冻的粪便样品中提取dna(salonena,nikkilaj,jalanka-tuovinenj,immoneno,rajilic-stojanovicm,kekkonenra,palvaa,devoswm:comparativeanalysisoffecaldnaextractionmethodswithphylogeneticmicroarray:effectiverecoveryofbacterialandarchaealdnausingmechanicalcelllysis.jmicrobiolmethods2010,81(2):127-134.(salonena、nikkilaj、jalanka-tuovinenj、immoneno、rajilic-stojanovicm、kekkonenra、palvaa、devoswm：利用系统发育微阵列的粪便dna提取方法的比较分析：利用机械细胞裂解有效回收细菌和古细菌dna，《微生物学方法杂志》，2010年，第81卷，第2期：第127-134页))，做出微小的修改。简而言之，使用1.0ml裂解缓冲液(500mmnacl，50mmtris-hcl(ph8)，50mmedta，4％sds)和0.5g0.1mm氧化锆珠，将大约0.2g粪便用于机械和化学裂解。通过添加260μl10m乙酸铵，使用一体积异丙醇沉淀核酸。随后，用70％乙醇洗涤dna粒料。使用qiaampdnastoolmini试剂盒(德国希尔登的qiagen公司(qiagen，hilden，germany))进行进一步纯化dna。最后，将dna溶解于200μltris/edta缓冲液中，并且以分光光度法(nd1000，美国特拉华州威尔明顿的nanodrop技术公司(technologies，wilmington，de，usa))检查其纯度和量。
为了制备用于焦磷酸测序的扩增子池，将下列通用引物用于扩增16srrna基因的v3-v6区域：a)正向引物5’-ccatctcatccctgcgtgtctccgactagnnnnnnactcctacgggaggcagcag-3’(斜体序列是454生命科学引物a，并且粗体序列是广义保守的细菌引物338f；nnnnnn指定用于标记每个pcr产物的样本特定的六碱基条形码)；b)反向引物5’-cctatcccctgtgtgccttggcagtctcagcrrcacgagctgacgac-3’(斜体序列是454生命科学引物b，并且粗体序列是广义保守的细菌引物1061r)。pcr扩增混合物含有：1μl粪便dna，1μl条形码正向引物，15μl主混合物(1μlkod热起始dna聚合酶(1u/μl；美国威斯康星州麦迪逊的novagen公司(novagen,madison,wi,usa)，5μlkod缓冲液(10×)，3μlmgso4(25mm)，5μldntp混合物(每个2mm)，1μl(10μm)反向引物)和33μl无菌水(总体积50μl)。pcr条件为：95℃下2分钟，接着95℃下20秒，55℃下10秒和70℃下15秒，循环35次。随后使用msbspinpcrapace试剂盒(invitek)纯化大约750bppcr扩增子，并使用nanodrop1000分光光度计(赛默科技(thermoscientific))检查浓度。用于焦磷酸测序的复合样品通过汇集200ng每个样品的这些纯化的pcr产物来制备。使用purelinkpcr纯化试剂盒(invitrogen)和高截留结合缓冲液b3纯化汇集的样品，并使用钛测序化学(gatc-biotech，德国)提交在454lifesciencesgs-flx平台上用于16srrna基因的v3-v4区域的焦磷酸测序。
统计分析
用于焦磷酸测序分析的群体是排泄物微生物群的pp群体的小子集；pp群体由在研究期间仅接受研究配方食品的配方食品喂养的婴儿或仅食用hm的hm喂养的婴儿；通过第8周完成所有研究访问的婴儿；对于正在分析的终点，在第8周具有可用测量值的婴儿；以及无任何主要协议违规的婴儿(例如符合纳入和排除标准的婴儿)组成。如果婴儿接受了会潜在影响研究终点(上面列出)的药物，那么将他们从pp分析群体中排除，并且如果婴儿母亲使用过这些药物，而婴儿正在接受母乳喂养，则也排除hm喂养的婴儿和曾接受母乳喂养的配方食品喂养的婴儿。在研究开放之前，确定婴儿是否违反了议定书并被排除在pp分析之外。使用mothurv.1.33.0(schloss,p.d.,etal.2009.appliedandenvironmentalmicrobiology75(23):7537-7541(schloss、p.d.等人，2009年，《应用与环境微生物学》，第75卷，第23期：第7537页至7541页))和qiimev.1.8(caporaso,j.g.,etal.2010.natmethods7:335-336(qiime允许分析高通量群落测序数据，《自然方法》，第7卷，第335页至336页))软件包来分析原始序列数据。根据(schloss,p.d.andwestcott,s.l.,2011,applenvironmicrobiol77:3219-3226(schloss,p.d.和westcott,s.l.，2011年，《应用与环境微生物学》，第77卷：第3219页至3226页))中描述的454sop，利用pyronoise的mothur实施去噪焦磷酸测序读数(quince,c.,lanzen,a.,curtis,t.p.,davenport,r.j.,hall,n.,head,i.m.etal.，2009.natmethods6:639-641(quince,c.,lanzen,a.,curtis,t.p.,davenport,r.j.,hall,n.,head,i.m.等人，2009年，《自然方法》，第6卷：第639页至641页))。使用qiime中的usearch61鉴定嵌合体(edgar,r.c.,haas,b.j.,clemente,j.c.,quince,c.,andknight,r.2011.bioinformatics27:2194-2200(edgar,r.c.、haas,b.j.、clemente,j.c.、quince,c.和knight,r.，2011年，《生物信息学》，第27卷：第2194页至2200页))。然后如mothur454sop中所述对序列进行修剪，以使序列与相同的16s区域重叠。使用qiime中的uclust(edgar,r.c.2010.bioinformatics26:2460-2461(edgar,r.c.，2010年，《生物信息学》，第26卷：第2460页至2461页))进行97％同一性的otu从头挑选。otu代表性序列的分类学分配在qiime的greengenes参考数据库v.13.8(mcdonald,d.,price,m.n.,goodrich,j.,nawrocki,e.p.,desantis,t.z.,probst,a.etal2012.ismej6:610-618(mcdonald,d.,price,m.n.,goodrich,j.,nawrocki,e.p.,desantis,t.z.,probst,a.等人，2012年，《国际微生物生态学会会刊》，第6卷：第610页至618页))中使用了置信度阈值为0.6(wang,q.,garrity,g.m.,tiedje,j.m.,andcole,j.r.,2007.,applenvironmicrobiol73:5261-5267(wang,q.、garrity,g.m.、tiedje,j.m.和cole,j.r.，2007年，《应用环境微生物学》，第73卷：第5261页至5267页))的rdp分类器。在qiime和用于windows的graphpadprism版本6.07中进行多样性分析(美国加利福尼亚州拉荷亚的graphpad软件公司(graphpadsoftware,lajollacaliforniausa))。为了比较组间分类的相对丰度并解释偏倾分布，使用kruskal-wallis检验进行非参数统计检验。dunn的多重比较检验用于校正多种检验。对于所有检验，使用0.05的p值显著阈值。
结果
研究人群
在初始研究中，将三百名配方食品喂养的婴儿随机化以接收对照、sn-2、sn-2+3g/lof或sn-2+5g/lof。共招募了七十五名hm喂养的婴儿。一般来讲，在各种喂养组中参与pp分析群体的婴儿(每个喂养组大约30名至37名)一般类似于各种基线特性，但hm喂养的婴儿更年轻，更有可能是通过阴道分娩出生的，并且较不可能是雄性或第一出生的。与完全研究中375名婴儿相比，参与pp子集的婴儿在基线特性方面没有表现出显著差异。目前的分析代表42名婴儿(每组9名至12名)，其为在基线和第8周具有粪便样品的170个婴儿的小但随机选择的子集，其包含pp分析群体。
该研究的结果通过图1至5和相关联的表来示出。
在图中，报道了各种细菌群体(研究第8周的群体)。报道了5组的群体计数和/或表征：“对照”(不是本发明的组合物)，“sn-2”(不是本发明的组合物)，“sn-2+3g/lof”(不是本发明的组合物)，人乳(人类母乳而非本发明组合物喂养的婴儿，)和“sn-2+5g/lof”(本发明的组合物)。当存在时，统计学上显著的差异由p值指示，阈值为0.05。在图4和图5中，将各种细菌亚群的相对计数报道为第8周值(即，研究结束时的群体)。
图1示出了焦磷酸测序数据的双标图。通过基于加权unifrac的pcoa排序分析5组的细菌群落。十种最丰富的细菌属(所有样品中相对丰度的加权平均值)的坐标用带有属名称的灰色气泡指示。这些组分别显示在面板a、b、c、d中以更好地识别它们。人乳(图1a)诱导所有微生物群群体处于双歧杆菌属区域(在右侧)的区域中。与人乳相反，婴儿配方食品对照(图1c)示出了分散的细菌种群，其中大多数接近链球菌属区域。相似地，图1d(sn-2)还表现出不聚集在双歧杆菌属区中的细菌群体。图1b(sn-2+5g/lof)清楚地表明，该组的细菌群体聚集接近双歧杆菌区，不同的是在链球菌属区域仍有很少的样品。这与“人乳”组非常相似。
图2通过评价实验组和人乳群体之间的加权unifrac距离的分布来量化图1中显示的内容。unifrac距离是细菌群体的系统发育接近的量度。a(本发明的组合物)、d(sn-2)和e(sn-2+3g/lof)组均显示与b(对照)组相比较小的平均距离。然而，将距c组(人乳)的最小距离与a组(本发明的组合物)相关联，
图3示出了组的香农多样性指数(即每个样品中细菌群体的多样性如何)。它示出了a组(本发明的组合物)具有与人乳组c的指数非常相似的多样性指数。此外，a组是显示与对照b组在统计学上(t检验)不同的多样性分布的唯一组。
图4示出了各种实验组中双歧杆菌属的相对丰度。其显示，获得c组(人乳)和a组(本发明的组合物)的最高值。
图5示出了各种实验组(非期望细菌分类)中消化链球菌科的相对丰度。结果表明，获得a组(本发明的组合物)和e组(sn-2+3g/lof)的最低值，其均在统计学上与参考组c(人乳)难以区分。在d组(sn-2)上添加3g/lof(e)和5g/lof(a)，观察of的剂量效应，其与c组(人乳)仍难以区分。