本发明涉及一种协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂制品及其应用，具体涉及一种以低聚木糖、高黄腐酸腐植酸钠与丁酸梭菌为原料，利用三者协同耦合作用机理，促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂制品及其在畜禽养殖中的应用。
背景技术：
伴随集约化养殖的发展，应用抗生素防治畜禽肠道疾病是比较通用的方法，但抗生素的乱用及滥用，导致耐药性问题突显，对人类健康存在安全威胁。开发适用于畜禽肠道和微生态环境的新型添加剂，在促进肠道吸收功能、减少肠道疾病发生的同时，逐步减少对抗生素的依赖，是未来添加剂的研发方向。
低聚木糖可广泛应用于食品及饲料领域，是公认的功能性低聚糖。低聚木糖在回肠、盲肠、结肠可以被微生物广泛的发酵利用，通过选择性促进有益菌（如丁酸梭菌等）生长，抑制有害菌增值，进而改善肠道微生物结构，促进肠道微生态平衡。
丁酸梭菌为革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，丁酸梭菌是调节肠道微生态平衡的有益菌，其主要生物特性表现为：①通过分泌维生素及生长因子等促进肠道有益菌群增殖，同时通过分泌丁酸及抗菌肽等抑制肠道内有害菌繁殖，减少肠毒素的分泌；②丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸为肠道上皮组织细胞提供营养，促进肠道上皮细胞发育；③丁酸梭菌是厌氧芽孢杆菌，可以耐受饲料制粒等高温、干燥及富氧环境，保证饲料中丁酸梭菌的活菌数量，同时能够耐受胃酸、胆汁酸等，保证活菌顺利进入肠道，发挥益生功能。
腐植酸钠中腐植酸成分根据理化及分子机构可以分为黄腐酸、棕腐酸及黑腐酸三种。其中所含的黄腐酸对于受损肠道部位毛细血管再生具有显著作用。由于矿源性腐植酸钠中黄腐酸含量一般都低于1%，大大降低了腐植酸钠的临床生理效果。白腐菌等微生物分泌的代谢产物可以降解腐植酸中的部分支链结构，释放出分子量更小的黄腐酸结构物质，进而提高腐植酸钠中黄腐酸含量。
目前公开了多种微生态相关的添加剂生产方法方法，专利201410137978.2公开了一种丁酸梭菌及其应用，利用麦芽糊精、麸皮、豆粕、石粉中的一种或多种作为载体，载体中的物质不能为丁酸梭菌生长提供营养。专利201410702431.2公开了一种复合微生态制剂，其中包含多种益生菌及低聚糖，其中低聚糖能够促进益生菌的增殖，但是无法对益生菌在肠道内的定植进行干预，大大降低了益生菌的功效。专利201310515953.7公布了一种稀土与腐植酸钠复合饲料添加剂及其制备方法，只是简单的将腐植酸钠添加至饲料中，重点强调了腐植酸钠的生产工艺，缺乏对其在饲料中的使用方法及机理等的研究。如前所述，低聚木糖、丁酸梭菌及高黄腐酸腐植酸钠三者协同作用改善肠道健康的方法及制剂鲜有报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种同步促进肠道益生菌增殖与定植并抑制有害菌增殖，进而保证肠道微生态平衡的添加剂。该添加剂区别于一般微生态制剂的优势在于，该制剂包含益生菌的营养物质低聚木糖、能够分泌抑制有害菌增殖活性物质的丁酸梭菌及修复肠道上皮损伤，提高上皮益生菌黏附受体水平的高黄腐酸腐植酸钠。三种物质通过作用过程协同及功能耦合，促进肠道微生态的健康发展，进而促进肠道屏障与吸收功能，提高饲料利用率，促进畜禽生长。
本发明的另一个目的是提供一种协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂制品的使用方法。
本发明的目的是这样实现的：一种协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂，它是由下述以重量份计的原料制成：低聚木糖10-15份，丁酸梭菌10-15份，高黄腐酸腐植酸钠70-80份。
本方案的具体特点还有，所述低聚木糖是指其中聚合度为2-4的低聚木糖含量为55%以上（产品由山东龙力生物科技股份有限公司生产）。
所述高黄腐酸腐植酸钠中黄腐酸含量≥12%。
高黄腐酸腐植酸钠是通过如下步骤制备而成：
（1）将黄孢原毛平革菌（购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC 40299，Phanerochaete chrysosporium）接种到麦芽汁液体培养基中，于39摄氏度培养4-8天后制备菌丝液。
（2）将菌丝液、纯净水与腐植酸钠（济南海华生物科技有限公司生产）按照重量1-3：1-2：1-4混合，按混合后混合物总重量为基数添加无机盐具体包括：尿素0.1-0.3%、磷酸氢二钾0.1-0.5%、磷酸二氢钾0.1-0.5%、硫酸镁0.1-0.3%、硫酸锰0.01-0.05%。
（3）控制pH为4.8-6.0，温度为30-37摄氏度，60转/分钟搅拌反应5-10天。
（4）将步骤（3）获得的反应液采用滚筒干燥，获得高黄腐酸腐植酸钠片状产品。
所述的丁酸梭菌活菌数为1010-1011菌落/克。
丁酸梭菌是通过如下步骤制备而成：
（1）制作丁酸梭菌种子培养液，其中菌液浓度均为5.0×108CFU/ml；
（2）制作培养基，具体为：高温豆饼粉1.8%、尿素0.1%、玉米浆0.1%、低聚木糖3.0%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、硫酸锰0.01%；
（3）将丁酸梭菌种子液按2%的比例利用蠕动泵加入到培养基中，35℃静置培养28小时；丁酸梭菌发酵过程中以低聚木糖为唯一碳源；取样检测活菌总数，活菌总数为2.7×109CFU/ml，芽孢率为100%；
（4）将发酵液利用管式离心机离心，加入载体玉米芯，在40℃以下通风干燥，水分控制在5%，粉碎过100目钢筛，得到丁酸梭菌。
检测合格后，包装入库。
一种如前所述的协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂的使用方法，低聚木糖与丁酸梭菌混合制成原料组分Ⅰ；高黄腐酸腐植酸钠为原料组分Ⅱ，协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂的重量占饲料总重的0.15%；原料组分Ⅰ与Ⅱ分先后饲料原料混合，首先将原料组分Ⅰ添加进饲料原料中，搅拌1-2分钟后，投入原料组分Ⅱ继续搅拌1-2分钟。
本方案的具体特点还有，原料组分Ⅰ 20-30份，原料组分Ⅱ 70-80份，其中低聚木糖10-15份，丁酸梭菌10-15份，高黄腐酸腐植酸钠70-80份。
本发明具有如下积极效果：
1、低聚木糖促进丁酸梭菌增殖，而不被畜禽及有害菌代谢，选择性促进丁酸梭菌在肠道的增殖。
2、丁酸梭菌芽孢状态可以耐受高温、干燥等极端环境，因此在饲料高温制粒过程中能够保证丁酸梭菌不受破坏，保证了丁酸梭菌以活菌状态进入畜禽肠道发挥益生活性。
3、丁酸梭菌发酵培养基中以低聚木糖为碳源，使丁酸梭菌开启低聚木糖代谢通路，便于菌株进入肠道以后以低聚木糖为碳源快速启动生长与增殖过程，缩短微生物生长所需延滞期。
4、采用黄孢原毛平革菌生物处理方法，将腐植酸钠中黄腐酸由≤1%提高至12-16%，该方法反应温和，反应过程不会生成污染物。
5、黄腐酸促进受损部位组织内毛细血管的分化与再生，通过对受伤组织强化输送营养物质，促进受伤组织的再生，保证肠道上皮组织的完整与发育，进而提高上皮粘膜表面益生菌黏附受体水平，促进益生菌在肠道的定植。
本发明制剂通过低聚木糖、丁酸梭菌与高黄腐酸腐植酸钠联合作用，提高了制剂在维持肠道微生态平衡、增强肠道健康方面的功效，增强了其在畜禽养殖上的效果，使产品具有更强竞争力。
黄孢原毛平革菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市丰台区造甲街110号15幢。分类命名：黄孢原毛平革菌；拉丁文学名：Phanerochaete chrysosporium；保藏编号CICC 40299。
丁酸梭菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市丰台区造甲街110号15幢。分类命名：丁酸梭菌；拉丁文学名：Clostridium butyricum 保藏编号CICC 20036。
附图说明
图1为本发明低聚木糖、丁酸梭菌及高黄腐酸腐植酸钠协同作用机理示意图。
具体实施方式
实施例1：一种协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂，它是由下述以重量份计的原料制成：低聚木糖10-15份，丁酸梭菌10-15份，高黄腐酸腐植酸钠70-80份。所述低聚木糖是指其中聚合度为2-4的低聚木糖含量为55%以上（产品由山东龙力生物科技股份有限公司生产）。所述高黄腐酸腐植酸钠中黄腐酸含量≥12%。所述的丁酸梭菌活菌数为1010-1011菌落/克。
高黄腐酸腐植酸钠制备：
（1）菌丝液的制备：将黄孢原毛平革菌（购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC 40299，Phanerochaete chrysosporium）接种到麦芽汁液体培养基中，于39摄氏度培养4天后制备菌丝液。
（2）将菌丝液、纯净水与腐植酸钠（济南海华生物科技有限公司生产，黄腐酸含量为0.4%）按照重量1：1：1混合，按混合物重量添加无机盐（尿素0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、硫酸锰0.01%）。
（3）控制pH为4.8，温度为30摄氏度，60转/分钟搅拌反应10天。
（4）将反应液采用滚筒干燥，获得片状产品，黄腐酸含量为12.6%。
丁酸梭菌是通过如下步骤制备而成：
（1）制作丁酸梭菌种子培养液，其中菌液浓度均为5.0×108CFU/ml；
（2）制作培养基，具体为：高温豆饼粉1.8%、尿素0.1%、玉米浆0.1%、低聚木糖3.0%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、硫酸锰0.01%；
（3）将丁酸梭菌种子液按2%的比例利用蠕动泵加入到培养基中，35℃静置培养28小时；丁酸梭菌发酵过程中以低聚木糖为唯一碳源；取样检测活菌总数，活菌总数为2.7×109CFU/ml，芽孢率为100%；
（4）将发酵液利用管式离心机离心，加入载体玉米芯，在40℃以下通风干燥，水分控制在5%，粉碎过100目钢筛，得到丁酸梭菌。
检测合格后，包装入库。
实施例2：一种协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂，它是由下述以重量份计的原料制成：低聚木糖10-15份，丁酸梭菌10-15份，高黄腐酸腐植酸钠70-80份。所述低聚木糖是指其中聚合度为2-4的低聚木糖含量为55%以上（产品由山东龙力生物科技股份有限公司生产）。所述高黄腐酸腐植酸钠中黄腐酸含量≥12%。高黄腐酸腐植酸钠制备：
（1）菌丝液的制备：将黄孢原毛平革菌（购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC 40299，Phanerochaete chrysosporium）接种到麦芽汁液体培养基中，于39摄氏度培养6天后制备菌丝液。
（2）将菌丝液、纯净水与腐植酸钠（济南海华生物科技有限公司生产，黄腐酸含量为0.4%）按照重量2：1.5：3混合，按混合物重量添加无机盐（尿素0.2%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸镁0.2%、硫酸锰0.03%）。
（3）控制pH为5.0，温度为34摄氏度，60转/分钟搅拌反应6天。
（4）将反应液采用滚筒干燥，获得片状产品，黄腐酸含量为16.8%。
所述的丁酸梭菌活菌数为1010-1011菌落/克。丁酸梭菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC 20036，Clostridium butyricum。丁酸梭菌是通过如下步骤制备而成：
（1）制作丁酸梭菌种子培养液，其中菌液浓度均为5.0×108CFU/ml；
（2）制作培养基，具体为：高温豆饼粉1.8%、尿素0.1%、玉米浆0.1%、低聚木糖3.0%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、硫酸锰0.01%；
（3）将丁酸梭菌种子液按2%的比例利用蠕动泵加入到培养基中，35℃静置培养28小时；丁酸梭菌发酵过程中以低聚木糖为唯一碳源；取样检测活菌总数，活菌总数为2.7×109CFU/ml，芽孢率为100%；
（4）将发酵液利用管式离心机离心，加入载体玉米芯，在40℃以下通风干燥，水分控制在5%，粉碎过100目钢筛，得到丁酸梭菌。
检测合格后，包装入库。
实施例3：本实施例与实施例2相同之处不再赘述，不同之处在于：高黄腐酸腐植酸钠制备
（1）菌丝液的制备：将黄孢原毛平革菌接种到麦芽汁液体培养基中，于39摄氏度培养8天后制备菌丝液。
（2）将菌丝液、纯净水与腐植酸钠（济南海华生物科技有限公司生产）按照重量3：2：4混合，按混合物重量添加无机盐（尿素0.3%、磷酸氢二钾0.5%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸镁0.3%、硫酸锰0.05%）。
（3）控制pH为6.0，温度为37摄氏度，60转/分钟搅拌反应8天。
（4）将反应液采用滚筒干燥，获得片状产品，黄腐酸含量为14.4%。
本发明添加剂制品育肥猪临床应用实施例：
2016年5-7月在济南海华生物科技有限公司试验猪场进行饲养试验，在济南绿安食品有限责任公司进行屠宰分割试验。选择品种相同、年龄相近的60kg体重杜长大商品猪800头，分为16组，每组50头。按表格1分组并添加相应本发明制剂，对照组饲喂临邑和康源饲料有限公司的配合饲料。饲养试验至平均体重为100kg左右终止，对育肥猪的体重、采食量及料肉比等进行计算。
实施例4：
制剂A：原料组分Ⅰ 20份，原料组分Ⅱ80份，最终制剂产品中低聚木糖10份，丁酸梭菌10份，高黄腐酸腐植酸钠（产品来源于实施例2）80份。育肥猪饲料中添加量为0.15 %，具体生长指标参数见表1。
表1
实施例5：
一种协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂的使用，低聚木糖与丁酸梭菌混合制成原料组分Ⅰ；高黄腐酸腐植酸钠为原料组分Ⅱ，协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂的重量占饲料总重的0.15%；原料组分Ⅰ与Ⅱ分先后饲料原料混合，首先将原料组分Ⅰ添加进饲料原料中，搅拌1-2分钟后，投入原料组分Ⅱ继续搅拌1-2分钟。
制剂B：原料组分Ⅰ 25份，原料组分Ⅱ 75份，最终制剂产品中
低聚木糖12.5份，丁酸梭菌12.5份，高黄腐酸腐植酸钠（产品来源于实施例2）75份。育肥猪具体生长指标参数见表2。
表2
实施例6：一种协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂的使用方法，本实施例与实施例4相同之处不再赘述，不同之处在于：
制剂C：原料组分Ⅰ30份，原料组分Ⅱ 70份，最终制剂产品中低聚木糖15份，丁酸梭菌15份，高黄腐酸腐植酸钠（产品来源于实施例2）70份。育肥猪具体生长指标参数见表3。
表3
通过实施例4-6可知（表1-3），通过添加本发明制品，能够显著提高试验猪只日增重，降低料肉比和腹泻率，提高饲料利用效率，进而提高养殖效益。
实施例7：一种协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂的使用方法，本实施例与实施例4相同之处不再赘述，不同之处在于：
制剂D：原料组分Ⅰ 25份，原料组分Ⅱ 75份，最终制剂产品中
低聚木糖12.5份，丁酸梭菌12.5份，腐植酸钠（济南海华生物科技有限公司生产，黄腐酸含量为0.4%，为实施例1-3技术所用原料，未经实施例1-3技术处理）75份。育肥猪饲料中添加量为0.15%，具体生长指标参数见表4。
表4
进而由实施例7可知，腐植酸钠中黄腐酸含量对于产品效果具有重要作用，实施例7与5中在其它成分相同，只有黄腐酸含量变化的情况下，育肥猪的日增重、料肉比及腹泻率水平均表现出劣势。
实施例8（对比例）
制剂E: 原料组分Ⅰ 25份，原料组分Ⅱ 75份，最终制剂产品中低聚木糖12.5份，丁酸梭菌12.5份，高黄腐酸腐植酸钠（产品来源于实施例2）75份，三者首先混合，然后与饲料原料混匀。育肥猪饲料中添加量为0.15 %，具体生长指标参数见表5。
实施例8与实施例5相比较，将低聚木糖、丁酸梭菌及高黄腐酸腐植酸钠直接混合，虽然三者最终含量相同，但是效果却远不及实施例5中分为原料组分Ⅰ和原料组分Ⅱ 的添加方式，进一步说明产品分步添加方法的重要性。
实施例9：一种协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂的制备方法，协同促进肠道益生菌增殖与定植的添加剂是由下述以重量份计的原料制成：低聚木糖10-15份，丁酸梭菌10-15份，高黄腐酸腐植酸钠70-80份。所述低聚木糖是指其中聚合度为2-4的低聚木糖含量为55%以上（产品由山东龙力生物科技股份有限公司生产）。
所述高黄腐酸腐植酸钠中黄腐酸含量≥12%。高黄腐酸腐植酸钠制备：
（1）菌丝液的制备：将黄孢原毛平革菌接种到麦芽汁液体培养基中，于39摄氏度培养6天后制备菌丝液。黄孢原毛平革菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC 40299，Phanerochaete chrysosporium。
（2）将菌丝液、纯净水与腐植酸钠（济南海华生物科技有限公司生产，黄腐酸含量为0.4%）按照重量2：1.5：3混合，按混合物重量添加无机盐（尿素0.2%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸镁0.2%、硫酸锰0.03%）。
（3）控制pH为5.0，温度为34摄氏度，60转/分钟搅拌反应6天。
（4）将反应液采用滚筒干燥，获得片状产品，黄腐酸含量为16.8%。
所述的丁酸梭菌活菌数为1010-1011菌落/克。丁酸梭菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC 20036，Clostridium butyricum。丁酸梭菌是通过如下步骤制备而成：
（1）制作丁酸梭菌种子培养液，其中菌液浓度均为5.0×108CFU/ml；
（2）制作培养基，具体为：高温豆饼粉1.8%、尿素0.1%、玉米浆0.1%、低聚木糖3.0%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、硫酸锰0.01%；
（3）将丁酸梭菌种子液按2%的比例利用蠕动泵加入到培养基中，35℃静置培养28小时；丁酸梭菌发酵过程中以低聚木糖为唯一碳源；取样检测活菌总数，活菌总数为2.7×109CFU/ml，芽孢率为100%；
（4）将发酵液利用管式离心机离心，加入载体玉米芯，在40℃以下通风干燥，水分控制在5%，粉碎过100目钢筛，得到丁酸梭菌。
检测合格后，包装入库。