本发明属于微生物降级技术领域，更具体涉及一种利用小孢根霉少孢变种降解玉米赤霉烯酮的方法。
技术背景
霉菌毒素是产玉米、小麦等谷物上生长繁殖过程中产生的次级代谢产物。我国常见的几种霉菌毒素和对动物危害比较严重的霉菌毒素有：玉米赤霉烯酮(zea)、呕吐毒素、黄曲霉毒素b1、伏马毒素、赭曲霉毒素以及t-2毒素。饲料中霉菌毒素的污染及其危害是全球性的问题，在我国南方大部分地区夏天炎热潮湿，对于霉菌的生长提供了有利条件。所以在我国南方地区受霉菌毒素的污染十分严重。而我国对于霉菌毒素产毒条件的控制不足，霉菌毒素的污染对食品和饲料生产造成损失十分巨大，已经成为阻碍我国农业发展的难题之一。霉菌毒素降低饲料的营养价值，影响饲料的适口性，霉菌毒素沉积的含量过高引发畜禽的毒性反应，降低动物的采食量和饲料的转化率，减缓畜禽的生长速度，破坏畜禽免疫力和抵抗力。影响动物的生长发育和繁殖能力，甚至增加畜禽的死亡率，造成器官坏死，贫血和抑制细胞中遗传信息的传递，干扰遗传物质dna、rna的合成，进而干扰蛋白质的合成，对人和畜禽产生毒害。
zea，又称为f-2毒素，是一类具有类雌激素作用的2,4二经基苯甲酸内醋化合物。玉米、小麦、燕麦和大麦等作物易受到玉米赤霉稀酮污染。zea为白色晶体溶点161-163℃，溶于碱性溶液、甲醇、乙醚、乙醇和苯等，不溶于水，zea具有热稳定性，在词料加工过程中不易被分解。zea具有很强的生殖毒性和免疫毒性。尤其母猪对zea最敏感。影响母猪孕酮的分泌和子宫的功能。降低黄体生成素。由于玉米赤霉烯酮对育种的家畜和家禽危害很大，常常可以导致一个育种基地一年内恢复不到原有的水平，而且造成大面积的品质下降。因此，对玉米赤霉烯酮的毒害作用应给予积极防治，减少畜产品的损失。另一方面，可以利用玉米赤霉烯酮在农作物生产方面的调控作用，开发出高产高质的新产品。
现在饲料工业中采取添加霉菌毒素的吸附剂，以降低摄入畜禽体内霉菌毒素的作用。其中效果好的有活性炭和一些高聚合物(比如蒙脱石)等，现在使用较多的是一些非金属无机矿物和有几聚糖，如硅铝酸盐(因为其良好的电负性)和不同来源的寡聚糖(因为其巨大的表面积和众多的化学键)，但是有其负面效应；其次是沸石，沸石具有良好的选择吸附、阳离子交换、催化激活、耐酸、热稳定性和分子筛等物理化学性质和功能特性，包括饲料工业在内的许多领域中得到广泛应用，但是效果都不太明显。现阶段对于霉菌毒素的脱毒分为物理脱毒和化学处理法，都有不同程度的缺陷，而本制备方法通过微生物对饲料原料的发酵来降解霉菌毒素的沉积。从饲料制备的根本上解决这一难题，有很大的帮助。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用小孢根霉少孢变种降解玉米赤霉烯酮的方法，使用该方法可用于降解各种饲料中污染玉米赤霉烯酮，并且制备及应用方法简单，操作方便、成本低廉，为动物饲料降解玉米赤霉烯酮提供了有效方法，该霉菌容易生长和培养，并且能高密度发酵、提高饲料的营养成分、减少霉菌毒素的含量。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种利用小孢根霉少孢变种降解玉米赤霉烯酮的方法，步骤如下：
a.将小孢根霉少孢变种(rhizopusmicrosporusvar.oligosporus)活化培养：用无菌吸管吸取灭菌pbs缓冲液，滴入放有小孢根霉少孢变种冻干粉的安瓿管内，pbs缓冲液与小孢根霉少孢变种冻干粉的用量比例为0.2～0.5ml：2g，轻轻振荡，使冻干小孢根霉少孢变种菌体溶解呈悬浮状；
b.扩大培养：将步骤a中活化后的菌种接种于121℃高压湿热灭菌后冷却至30-40℃的马铃薯葡萄糖琼脂pda培养基中扩大培养，28℃，72小时培养至对数生长期；
所述pda培养基按照下列比例组成：马铃薯浸出粉5.0g；葡萄糖20g；琼脂14g在室温25℃中ph值为5.6±0.2；配制方法：称取pda7.8g于200ml蒸馏水或去离子水中加热至完全溶解，pda与蒸馏水或去离子水的比例为7.8g：200ml，分装，121℃高压灭菌15分钟，灭菌结束后摇匀，以防琼脂沉积于器皿底部而凝固，备用
c.将生长至对数生长期的菌种用pbs缓冲液洗涤至250ml锥形瓶中，菌液浓度为1×106cfu/ml-1×107cfu/ml，取混合均匀菌液接种至粉碎玉米中，在28-30℃进行固体发酵，所述的玉米原料中添加了无菌水，菌液、玉米和无菌水的用量比例为10ml：200g：70ml，121℃高压湿热灭菌后冷却至30-40℃。
所述pbs缓冲液为：nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l,ph值7.2。配制方法为：称取原料后加去离子水约800ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调ph至7.2，最后定容到1l。高温高压灭菌后置于4℃冰箱保存待用。
所述的小孢根霉少孢变种(rhizopusmicrosporusvar.oligosporus)(中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号cgmcc3.4392)，菌种购自北京豫鼎鑫捷科技有限公司。
所述玉米购自饲料原料市场。
本发明的优点在于:利用小孢根霉少孢变种对饲料原料的固体发酵过程中，不仅对饲料原料的营养成分有不同程度的提升，而且对玉米赤霉烯酮有降解的效果。益生霉菌的发酵有双重的效果,通过降解部分多糖、蛋白质、脂肪，消除抗营养因子和积累有益的代谢物等大分子物质，形成有机酸和可溶性多肽等小分子物质，形成营养性丰富、适口性好和活菌含量较高的生物饲料不仅对饲料原料的营养成分有提升还能降解呕吐毒素的含量。不存在二次污染的问题，提高饲料原料的营养价值。提高产品的质量,提高粮食利用率，保证人畜的安全问题，还具有生产使用成本低、简单、易操作，玉米赤霉烯酮降解安全、高效等优点利用，对于企业生产有良好的借鉴基础。
具体实施方式
本发明实施例中小孢根霉少孢变种(rhizopusmicrosporusvar.oligosporus)(中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号cgmcc3.4392)，菌种购自北京豫鼎鑫捷科技有限公司，玉米从饲料厂购买饲料原料。
pbs缓冲液为：nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l。称取137mmolnacl、2.7mmolkcl、10mmolna2hpo4和2mmolkh2po4加去离子水约800ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调ph至7.2，最后定容到1l，高温高压灭菌后置于4℃冰箱保存待用。
马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基：马铃薯浸出粉5.0g；葡萄糖20g；琼脂14g在室温25℃中ph值为5.6±0.2；配制方法：称取pda7.8g于200ml蒸馏水或去离子水中(可按比例增加或者减少配置量)加热至完全溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟，灭菌结束后摇匀，以防琼脂沉积于器皿底部而凝固，备用
实施例1：
一种利用小孢根霉少孢变种固体发酵降解玉米赤霉烯酮的方法，步骤如下：
1.小孢根霉少孢变种菌液的制备
首先将菌粉活化培养用无菌吸管，吸取0.2ml灭菌pbs缓冲液滴入2g冻干菌体的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，分别配置五组悬浮液；
2.马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基的制备
首先将高温灭菌的pda分别倒入五个培养皿中，冷却至室温。然后将活化好的五组霉菌菌种，接种至pda培养基中扩大培养，每个培养皿中用200ul移液枪吸取菌液200ul至五个培养皿中，再用接种环涂布均匀，放置在恒温培养箱中培养，将温度调节至小孢根霉少孢变种适宜生长温度28℃，进行72h培养。
在72h后，将五个生长霉菌的培养皿从培养箱中取出，分别用pbs缓冲液洗涤培养皿中的小孢根霉少孢变种，每个培养皿洗涤5次，每次10ml，尽量将生长的霉菌洗涤至300ml锥形瓶中,5个培养皿一共洗涤25次，菌液为250ml，然后调节菌液的浓度，用25格x16格血球计数板技术，用200ul移液枪滴一滴菌液至血球计数板中，放置显微镜下计数。公式为：霉菌数/ml＝80小格内霉菌细胞个数/80×400×10四次方×稀释倍数，将菌液的浓度保持在1×107cfu/ml。
3.固体发酵培养
饲料原料的制备方法：粉碎玉米原料称重200g，添加70ml无菌水，121℃高压湿热灭菌后冷却至40℃。取步骤2中菌液10ml接种至200g粉碎玉米原料中，菌液的浓度保持在1×107cfu/ml，固体发酵温度为30℃，发酵时间为72小时。
设立空白对照组不进行霉菌接种，作为对照。称取粉碎玉米200g，添加80ml无菌水，121℃高压湿热灭菌后冷却至40℃，固体发酵温度为30℃,发酵时间为72小时。
上述应用中，所述的粉碎玉米都是从饲料厂购买饲料原料。
试验结束。收集发酵前后的饲料原料称重后，进行65℃风干，再进行粉碎，-20℃保存待测。
4.小孢根霉少孢变种发酵前后玉米营养物质含量的变化
分别测定小孢根霉少孢变种发酵前后玉米的总能，粗脂肪，粗蛋白，营养指标的变化。统计分析试验数据用spss19软件的一般线性模型进行单因素分析，粗脂肪的含量显著低于空白对照组的粗脂肪含量。因为霉菌的生长和繁殖需要碳水化合物来维持。粗脂肪以此来作为碳源来维持生长。所以在小孢根霉少孢变种发酵过程中生成总能和粗蛋白的含量有上升。具体结果见下表。
5.小孢根霉少孢变种发酵前后玉米赤霉烯酮含量的变化
经过小孢根霉少孢变种固体发酵后使玉米赤霉烯酮的含量显著下降。
经过少孢根霉固体发酵后使玉米赤霉烯酮的含量显著下降。
实施例2：
一种利用少孢根霉降解玉米赤霉烯酮的方法，步骤如下：
a.将小孢根霉少孢变种(rhizopusmicrosporusvar.oligosporus)活化培养：用无菌吸管吸取0.5ml灭菌pbs缓冲液，滴入放有2g小孢根霉少孢变种冻干粉的安瓿管内，轻轻振荡，使冻干小孢根霉少孢变种菌体溶解呈悬浮状；
b.扩大培养：将步骤a中活化后的菌种接种于121℃高压湿热灭菌后冷却至30℃的马铃薯葡萄糖琼脂pda培养基中扩大培养，28℃，72小时培养至对数生长期；
c.将生长至对数生长期的菌种用pbs缓冲液洗涤至250ml锥形瓶中，菌液浓度为1×106cfu/ml，200g粉碎玉米原料中添加了70ml无菌水，121℃高压湿热灭菌后冷却至30-40℃，取混合均匀菌液10ml接种至粉碎玉米中，在28℃进行固体发酵，发酵时间72h。
设立空白对照组不进行霉菌接种，作为对照。称取粉碎玉米200g，添加80ml无菌水，121℃高压湿热灭菌后冷却至30℃，固体发酵温度为28℃,发酵时间为72小时。
试验结束。收集发酵前后的饲料原料称重后，进行65℃风干，再进行粉碎，-20℃保存待测。
玉米小孢根霉少孢变种发酵前后营养物质含量的变化分别测定玉米小孢根霉少孢变种(发酵前后的总能，粗脂肪，粗蛋白，营养指标的变化。统计分析试验数据用spss19软件的一般线性模型进行单因素方差分析，粗脂肪的含量显著低于空白对照组的粗脂肪含量。因为霉菌的生长和繁殖需要碳水化合物来维持。粗脂肪以此来作为碳源来维持生长。所以在小孢根霉少孢变种发酵过程中生成总能和粗蛋白的含量有上升。具体结果见下表。
玉米小孢根霉少孢变种发酵前后玉米赤霉烯酮含量的变化为：经过小孢根霉少孢变种固体发酵后使玉米赤霉烯酮的含量显著下降。