本发明涉及一种提升黑莓花青素稳定性的方法，具体属于植物提取物技术领域。
背景技术：
黑莓(blackberry)，蔷薇科(rosaceae)悬钩子属(rubus)灌木，主要原产于新旧大陆北温带，北美东部和太平洋沿岸尤为丰富，在不列颠群岛和西欧为常见萌生林和绿篱植物,品种较多栽培范围广泛，资源较为丰富。因新鲜黑莓不但有甘美的滋味，并且含有大量的维生素、氨基酸、矿物元素、微量元素、无机盐类、果胶、黄酮、有机酸、酚类、粗蛋白及糖类等多种营养成分，又具有食用和医疗保健的作用，而被广大人群所喜爱。黑莓具有镇静安神、养颜益智、乌发明目、生津止渴、延年祛斑和降压消渴的功效。随着现代医学对黑莓进行药理、药效毒理测试的研究，发现黑莓具有促进造血细胞的生长，提高动物体内微波的活性，抗诱变，抗菌，抗病毒，抗辐射，抑制肿瘤及有害物质的生成，增强免疫力、抗寒功能及耐劳能力，抗氧化，延缓细胞衰老，防止血管硬化，调节血糖和血脂，护肝等功效。
花青素是天然的水溶性色素，具有鲜艳的颜色，可以作为食品色素剂添加于食品中提高食品的美观，减少合成色素带来的食品安全问题。同时，花青素还具有抗氧化、抗炎症、缓解糖尿病和抑制癌症等药理学和生物学活性。因此，长期食用富含花青素的食品有利于降低疾病风险和促进身体健康的作用。
但是花青素极不稳定性，易在光照、碱性条件和高温下分解，导致颜色和营养成分的降低。这一自身缺陷大大阻碍了这种天然物质的生产和加工，尤其高温条件下会导致花青素降解、褐变，使活性成分迅速减少。但食品加工过程中高温处理是最普遍的方法，因此通过对花青素的改性来提高花青素热稳定性的研究受到了国内外学者的高度关注，主要包括微胶囊技术、缔合作用(自身缔合、辅色作用与金属络合)和辅色作用等方法。其中，辅色作用在植物组织和水提液中被广泛的观察到，因此辅色作用被认为是提高花青素稳定性的重要方法之一。目前，主要的辅色剂，如咖啡酸、坏血酸和六羟黄酮等，主要集中于有机酸和黄酮类化合物。有机酸作为辅色剂中易去质子化的化学类型，其负电荷的羧基是必须的活性基团。一般而言，容易去质子化的化合物带有负电荷，pka较低，细胞膜的透过性也较差，在某些特定环境下并不适用。因此，研究一种能够有效提升黑莓花青素在高温下稳定性的方法，显得尤为必要。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提升黑莓花青素稳定性的方法，能够有效提高黑莓花青素在高温下的稳定性。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种提升黑莓花青素稳定性的方法，包括以下步骤：取黑莓浓缩汁，进行纯化，得到纯化后黑莓花青素，取纯化后黑莓花青素加水配制成黑莓提取液，加入脯氨酸溶液，混合即得。
前述提升黑莓花青素稳定性的方法中，纯化具体为：在50℃下，将黑莓浓缩汁进行减压浓缩，随后离心，取上清液即为黑莓花青素粗提物，再用80％乙醇溶液稀释，调节ph值，上树脂柱，分别用水、ph为3的80％乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，进行真空浓缩，即得纯化后黑莓花青素。
进一步地，前述提升黑莓花青素稳定性的方法中，纯化具体为：在50℃下，将黑莓浓缩汁进行减压浓缩至原体积的1/5～1/3，随后在3000～4000r/min下离心5～10min，取上清液即为黑莓花青素粗提物，再用80％乙醇溶液稀释至浓度为0.5～1mg/ml，用盐酸溶液调节ph值为1，上60～100目聚酰胺树脂柱，流速为5bv/h，温度为15℃，分别用水、ph为3的80％乙醇溶液进行洗脱，水溶液可以洗出水溶性的糖和酸等杂质，收集洗脱液，在低于40℃条件下进行真空浓缩，即得纯化后黑莓花青素。真空浓缩的温度在低于40℃条件下进行，既能尽量除去乙醇溶液，也能使黑莓花青素的损失降到最低。
前述提升黑莓花青素稳定性的方法中，黑莓提取液的浓度为1.0～2.5mg/ml。
进一步地，前述提升黑莓花青素稳定性的方法中，黑莓提取液的浓度为1.8mg/ml。
前述提升黑莓花青素稳定性的方法中，脯氨酸溶液的浓度为0.5～2mol/l。
进一步地，前述提升黑莓花青素稳定性的方法中，脯氨酸溶液的浓度为1mol/l。
前述提升黑莓花青素稳定性的方法中，黑莓提取液和脯氨酸溶液的体积比为1～3︰2～5。
优选地，前述提升黑莓花青素稳定性的方法中，黑莓提取液和脯氨酸溶液的体积比为1︰3。
为了确保本发明技术方案的科学、有效、合理，发明人进行了一系列的实验研究。
1、材料与方法
1.1材料与仪器
黑莓浓缩汁(贵州北极熊实业有限公司提供)；花青素对照品(矢车菊素-3-o-葡萄糖苷)：分析纯，贵州迪大生物有限责任公司；2,2-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)北京百灵威科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)北京百灵威科技有限公司；溴甲酚紫、hcl、feso4、naf、h2o2：分析纯，天津博迪化工股份有限公司，无水乙醇：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司。酶标仪spectramaxlus384,molecuar(美国)；水浴锅hh-s6型(北京科伟永兴仪器有限公司)。
1.2样品的准备
取黑莓浓缩汁，进行纯化，得到纯化后黑莓花青素，取纯化后黑莓花青素加水配制成黑莓提取液，再取1.8mg/ml的黑莓提取液1ml加入1mol/l脯氨酸溶液3ml，混合即得测试样品液。
取1.8mg/ml的纯化后黑莓提取液1ml加入3ml去离子水，作为对照样品液。
将测试样品和对照样品分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的温度分别反应2h、3h、4h、5h、6h，每个样做2个平行样。
1.3黑莓花青素吸光度的测定
在96孔板中加入200μl样品液，用酶标仪在530nm波长下测定吸光值。
1.4黑莓花青素含量的测定
配置100μg/ml的花青素对照品溶液为随行对照，称取1.000g花青素对照品溶解于10ml的容量瓶，通过分光光度计测定530nm波长下样品中的花青素含量。含量测定按下式计算：
a对照/c对照＝a样品/c样品，
其中，a对照为对照品的吸光度；a样品为样品的吸光度；c对照为对照品的浓度，g/ml；c样品为样品的浓度，g/ml。
1.5dpph自由基清除能力的测定
将dpph(1,1-二苯基-2-苦基苯肼)自由基配置成0.6mmol/l的乙醇溶液，取试管加入0.2ml的dpph溶液和0.2ml需测试的样品溶液加入到同一带塞口的试管中，混匀，在暗处静置30min，通过分光光度计测定517nm波长下dpph的残留量。dpph清除率按下式计算：
式中,as为样品管在517nm下吸光值；ao为空白管在517nm下吸光值。
1.6羟基自由基清除能力的测定
准确配制0.5g/l溴甲酚紫溶液、0.1mol/l盐酸溶液、5mmol/lfes04溶液、50mmol/lnaf溶液以及h2o2溶液(通过将3.0ml30％过氧化氢稀释到50ml获得)。按照加入顺序，将0.4ml溴甲酚紫溶液、0.5ml盐酸溶液、1.0mlfes04溶液和0.5mlh2o2溶液依次加入试管中混合，加水稀释到10.0ml，摇匀，置于30℃环境下水浴8min，取出后迅速加入0.2mlnaf溶液终止反应，测定波长420nm处反应液吸光度，记为a。相同方法测定含有溴甲酚紫和盐酸的空白溶液的吸光度，记为ao。将待测抗氧化剂样品按照溴甲酚紫溶液、盐酸、fes04溶液、h2o2溶液、1ml待测液顺序加入反应管，并迅速稀释至10.0ml，摇匀，记为as。羟基自由基清除率按下式计算：
1.7abts自由基清除能力的测定
将abts用超纯水溶解，配制成7mmol/l溶液。并配置浓度为12.25mmol/l的过硫酸钾k2s2o8水溶液。将abts溶液与k2s2o8溶液以5:1(v:v)比例混合，室温下避光静置12h，形成富含abts+的abts自由基溶液。测定时用无水乙醇将此abts自由基母液稀释，使其在734nm处吸光值处于0.8-0.9之间，并在室温下稳定。取试管加入1ml的稀释后abts+溶液和50μl需测试的的样品溶液加入到同一带塞口的试管中，混匀，在暗处静置7min，通过分光光度计测定734nm波长下abts+的残留量。abts自由基清除率按下式计算:
式中，as为样品管在734nm下吸光值；ao为空白管在734nm下吸光值。
2、结果与分析
2.1黑莓提取物吸光度的测定
表1中为对照样品液(黑莓提取液+去离子水)吸光度，表2为黑莓提取液和脯氨酸溶液混合溶液(测试样品液)的吸光度。
表1对照样品吸光度
注：平均值±标准差(n＝3)
表2测试样品液吸光度
注：平均值±标准差(n＝3)
由表1与表2可知，黑莓提取液的吸光度值随温度和加热时间的延长，吸光度值显著性变化明显，黑莓提取液与脯氨酸溶液混合物的吸光度值随温度和加热时间的延长，吸光度值显著性变化不明显。脯氨酸有利于黑莓花青素的稳定，并随温度和加热时间的延长，吸光度值上升，可能的原因是脯氨酸与花青素发生共色作用，能使花青素颜色更稳定，并且颜色加深。共色剂的主要作用是使花青素在适宜的条件下，产生红移并增加最大吸收波长的吸光度。花青素与共色剂联合形成一种垂直层叠的复合物，这种层叠过程产生一种疏水力，从而防止亲水核的加合作用和褪色。
2.2黑莓花青素含量的测定
表3为对照样品液中黑莓花青素含量；表4为测试样品液中黑莓花青素含量。
表3对照样品液中黑莓花青素含量
注：平均值±标准差(n＝3)
表4测试样品液中黑莓花青素含量
注：平均值±标准差(n＝3)
由表3与表4可知，黑莓提取液的花青素含量随温度和加热时间的延长，花青素含量值显著性变化明显，黑莓提取液与脯氨酸溶液的混合溶液中的花青素含量随温度和加热时间的延长，花青素值显著性变化不明显。脯氨酸有利于黑莓花青素的稳定。
2.3dpph自由基清除能力的测定
表5为对照样品液dpph自由基清除能力的测定值；表6为测试样品液dpph自由基清除能力的测定值。
表5对照样品液dpph自由基清除能力的测定值
注：平均值±标准差(n＝3)
表6测试样品液dpph自由基清除能力的测定值
注：平均值±标准差(n＝3)
由表5与表6可知，黑莓提取液的花青素dpph清除能力随温度和加热时间的延长，dpph清除率显著性变化明显，黑莓提取液与脯氨酸溶液的混合溶液的dpph清除能力随温度和加热时间的延长，花青素值显著性变化不明显。添加脯氨酸的黑莓提取液抗氧化活性较未添加脯氨酸的黑莓提取物的抗氧化活性高。说明脯氨酸对黑莓花青素的dpph清除能力有提高的作用，但是黑莓花青素的dpph清除能力随温度和加热时间的延长，清除率升高，可能的原因是花青素分解的产物对清除能力有补充作用。
2.4羟基自由基清除能力的测定
表7为对照样品液羟基自由基清除能力的测定值，表8测试样品液羟基自由基清除能力的测定值。
表7对照样品液羟基自由基清除能力的测定值
注：平均值±标准差(n＝3)
表8测试样品液羟基自由基清除能力的测定值
注：平均值±标准差(n＝3)
由表7与表8可知，黑莓提取液的花青素羟基自由基清除能力随温度和加热时间的延长，清除率显著性变化明显，黑莓提取液与脯氨酸溶液的混合溶液的羟基自由基清除能力随温度和加热时间的延长，清除率显著性变化不明显。添加脯氨酸的黑莓提取液抗氧化活性较未添加脯氨酸的黑莓提取液的抗氧化活性高。说明脯氨酸对黑莓花青素的羟基自由基清除能力有提高的作用。
2.5abts自由基清除能力的测定
表9为对照样品液abts自由基清除能力的测定值，表10测试样品液abts自由基清除能力的测定值。
表9对照样品液abts自由基清除能力的测定值
注：平均值±标准差(n＝3)
表10测试样品液abts自由基清除能力的测定值
注：平均值±标准差(n＝3)
由表9与表10可知，黑莓提取液的花青素abts自由基清除能力随温度和加热时间的延长，清除率显著性变化明显，黑莓提取液与脯氨酸溶液的混合溶液的abts自由基清除能力随温度和加热时间的延长，清除率显著性变化不明显。添加脯氨酸的黑莓提取液抗氧化活性较未添加脯氨酸的黑莓提取液的抗氧化活性高。说明脯氨酸对黑莓花青素的abts自由基清除能力有提高的作用。
3、色泽沉淀研究
3.1实验方法
取1ml浓度为1.8mg/ml纯化后的黑莓提取液与3ml浓度为1mol/l的脯氨酸溶液混合分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴锅中加热2h、3h、4h、5h、6h。在酶标仪(spectramaxplus384,moleculardevicesco.,ltd.,america)检测波长530nm的波长下测量吸光度。
3.2、评价方法
at为反应后的吸光度(t为反应时间)，ao为起始的吸光度。
3.3、研究结果
表11黑莓提取液色泽沉淀研究结果表
如上表11所示，黑莓提取液与脯氨酸的混合物随温度和加热时间的增加，保色性百分比基本保持不变，随着加热温度的上升，百分比略微上升，可能因为共色作用加强。但黑莓提取液的保色性百分比随温度和加热时间的增加，百分比明显下降。黑莓花青素是天然色素，加热后会降解，色素颜色即从红色降解为黄色，加入了脯氨酸的黑莓提取液在加热过程中，颜色虽然降解，但是相对于黑莓提取液本身的降解程度有所保留，说明脯氨酸对黑莓浓缩汁色泽具有良好的稳定作用。此外，加入脯氨酸后，基本可以消除黑莓提取液出现的沉淀现象。
随着加热时间的增加，黑莓提取液颜色逐渐从红色变成黄色，逐渐从花色基元正离子变成查尔酮结构。黑莓提取液与脯氨酸溶液的混合溶液随着加热时间的增加，颜色逐渐变深。
本发明的有益之处在于：本发明提供的一种提升黑莓花青素稳定性的方法，通过在黑莓提取液中加入脯氨酸溶液，能够有效提高黑莓花青素在高温下的稳定性。通过对黑莓提取液与脯氨酸溶液的混合溶液进行溶液吸光度和黑莓花青素含量测定，随温度和加热时间的延长，吸光度值和黑莓花青素含量变化不明显，表明脯氨酸有利于黑莓花青素的稳定。此外，对黑莓提取液与脯氨酸溶液的混合溶液进行羟基自由基清除能力和abts自由基清除能力的测定，随着温度和时间的延长，清除率变化不明显，并且两个自由基清除能力测试中，添加脯氨酸的黑莓提取液抗氧化活性较未添加脯氨酸的黑莓提取液的抗氧化活性高，表明脯氨酸对黑莓花青素的羟基自由基清除能力和abts自由基清除能力均有提高的作用。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。
实施例1
一种提升黑莓花青素稳定性的方法，包括以下步骤：取黑莓浓缩汁，进行纯化，得到纯化后黑莓花青素，取纯化后黑莓花青素加水配制成黑莓提取液，黑莓提取液浓度为1.0mg/ml，加入浓度为0.5mol/l的脯氨酸溶液，黑莓提取液和脯氨酸溶液的体积比为1︰2，混合即得。
纯化具体为：在50℃下，将黑莓浓缩汁进行减压浓缩至原体积的1/5，随后在3000r/min下离心10min，取上清液即为黑莓花青素粗提物，再用80％乙醇溶液稀释至浓度为0.5mg/ml，用盐酸溶液调节ph值为1，上60～100目聚酰胺树脂柱，流速为5bv/h，温度为15℃，分别用水、ph为3的80％乙醇溶液进行洗脱收集洗脱液，在低于40℃条件下进行真空浓缩，即得纯化后黑莓花青素。
实施例2
一种提升黑莓花青素稳定性的方法，包括以下步骤：取黑莓浓缩汁，进行纯化，得到纯化后黑莓花青素，取纯化后黑莓花青素加水配制成黑莓提取液，黑莓提取液浓度为2.5mg/ml，加入浓度为2mol/l的脯氨酸溶液，黑莓提取液和脯氨酸溶液的体积比为3︰5，混合即得。
纯化具体为：在50℃下，将黑莓浓缩汁进行减压浓缩至原体积的1/5，随后在4000r/min下离心5min，取上清液即为黑莓花青素粗提物，再用80％乙醇溶液稀释至浓度为1mg/ml，用盐酸溶液调节ph值为1，上60～100目聚酰胺树脂柱，流速为5bv/h，温度为15℃，分别用水、ph为3的80％乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，在低于40℃条件下进行真空浓缩，即得纯化后黑莓花青素。
实施例3
一种提升黑莓花青素稳定性的方法，包括以下步骤：取黑莓浓缩汁，进行纯化，得到纯化后黑莓花青素，取纯化后黑莓花青素加水配制成黑莓提取液，黑莓提取液浓度为1.8mg/ml，加入浓度为1mol/l的脯氨酸溶液，黑莓提取液和脯氨酸溶液的体积比为1︰3，混合即得。
纯化具体为：在50℃下，将黑莓浓缩汁进行减压浓缩至原体积的1/4，随后在3500r/min下离心5min，取上清液即为黑莓花青素粗提物，再用80％乙醇溶液稀释至浓度为0.75mg/ml，用盐酸溶液调节ph值为1，上60～100目聚酰胺树脂柱，流速为5bv/h，温度为15℃，分别用水、ph为3的80％乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，在低于40℃条件下进行真空浓缩，即得纯化后黑莓花青素。
实施例4
一种提升黑莓花青素稳定性的方法，包括以下步骤：取黑莓浓缩汁，进行纯化，得到纯化后黑莓花青素，取纯化后黑莓花青素加水配制成黑莓提取液，黑莓提取液浓度为1.5mg/ml，加入浓度为1.5mol/l的脯氨酸溶液，黑莓提取液和脯氨酸溶液的体积比为2︰5，混合即得。
纯化具体为：在50℃下，将黑莓浓缩汁进行减压浓缩至原体积的1/5，随后在3200r/min下离心8min，取上清液即为黑莓花青素粗提物，再用80％乙醇溶液稀释至浓度为0.6mg/ml，用盐酸溶液调节ph值为1，上60～100目聚酰胺树脂柱，流速为5bv/h，温度为15℃，分别用水、ph为3的80％乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，在低于40℃条件下进行真空浓缩，即得纯化后黑莓花青素。
实施例5
一种提升黑莓花青素稳定性的方法，包括以下步骤：取黑莓浓缩汁，进行纯化，得到纯化后黑莓花青素，取纯化后黑莓花青素加水配制成黑莓提取液，黑莓提取液浓度为2.0mg/ml，加入浓度为1.2mol/l的脯氨酸溶液，黑莓提取液和脯氨酸溶液的体积比为3︰4，混合即得。
纯化具体为：在50℃下，将黑莓浓缩汁进行减压浓缩至原体积的1/3，随后在3800r/min下离心6min，取上清液即为黑莓花青素粗提物，再用80％乙醇溶液稀释至浓度为0.9mg/ml，用盐酸溶液调节ph值为1，上60～100目聚酰胺树脂柱，流速为5bv/h，温度为15℃，分别用水、ph为3的80％乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，在低于40℃条件下进行真空浓缩，即得纯化后黑莓花青素。