一种治疗鱼类肠炎的中草药饲料添加剂的制作方法

本发明属于鱼类饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种治疗鱼类肠炎的中草药饲料添加剂。

背景技术：

我国鱼类养殖正逐步走向工业化养殖道路，随着鱼类养殖的集约化程度不断提升，养殖规模不断扩大，密度不断增加，鱼类病害频繁发生。水产药物在水产动物病害防治中占有重要地位，因其疗效显著、生产使用简便、成本低等特点，使其成为鱼类疾病防治的重要手段之一。目前，抗生素和化学药品的大量使用不仅会造成水产品药物残留，危害人类健康，同时也产生微生物耐药及水环境污染等问题。中草药作为天然药物在防治水产动物疾病方面有着悠久的历史，因其具有毒副作用小、残留少、抗药性不明显等优点，在防治疾病中除了兼有药性，还可以通过对水产动物的营养作用，免疫增强作用，激素样作用等发挥预防及治疗的目的。肠炎是养殖鱼类常发的肠道性疾病，其主要原因是由于一些致病性细菌在鱼体消化道内定植与繁殖，进而破坏鱼体消化内的微生态系统从而引起疾病发生，严重时可造成鱼类大量死亡。中草药常通过采用饲料添加的方式投喂给鱼体，消化道是其直接作用部位，然而目前有关中草药对鱼类肠炎防治效果及其对鱼体肠道菌群影响的研究仍较为欠缺。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种中草药饲料添加剂的应用，旨在对患肠炎鱼体达到理想的治疗效果，同时解决现有抗生素、化学品等药物饲料添加剂的大肆滥用，导致致病原体的抗药性增强和抗生素在动物体内残留的问题。

本发明所述的一种中草药混合物，包括以下按质量份计的原料组分：黄柏15份、红藤10份、败酱草10份、五倍子10份、石榴皮10份、白花蛇舌草20份、半枝莲15份、马齿苋15份、金银花25份、白头翁20份、葛根20份、黄连5份、苍术10份、茯苓20份、木香5份、神曲15份、鸡内金10份、白术15份、仙鹤草15份、艾叶10份。

本发明所提供的中草药混合物用于制备饲料添加剂；

所述的饲料添加剂为鱼类饲料添加剂；

所述中草药原料制备饲料添加剂，其是将中草药原料烘干后进行粉碎，过200目筛制成的。

本发明再一个方面提供一种鱼类饲料，所述的饲料中添加有上述的中草药原料制备的饲料添加剂；其添加量为0.1-2％。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：

(1)通过在鱼用常规颗粒饲料中添加本发明的中草药饲料添加剂，具有调节肠道菌群结构功效，可明显降低肠道中有害菌群的比例与数量，提升乳杆菌目与芽孢杆菌目有益细菌比例，缓解患肠炎鱼体症状，降低了患肠炎鱼体的死亡率，提高了鱼体养成率。

(2)本发明的中草药饲料添加剂配伍科学，材料易得，成本低廉，并且制备方法简单。且具备对患肠炎鱼体肠道菌群的调节作用以及清热解毒、止泻化湿、理气消涨、止血诱食的功效。

附图说明

图1是本发明肠道各样品高通量测序结果的稀释性曲线图；

图2是本发明肠道各样品间的多样性比较；

图3是本发明肠道各样品中细菌多样性的相关性分析(图中数字为各样本中的otu数量)；

图4是本发明中草药饲料添加剂对患肠炎大菱鲆的治疗效果。

具体实施方式

本发明克服现有治疗肠炎病技术的不足，提供一种中草药饲料添加剂。在本发明的中草药饲料添加剂中，黄柏、红藤、石榴皮、白花蛇舌草、半枝莲、金银花和白头翁具有清热解毒作用，葛根与黄连具解表止泻功能，苍术与茯苓具化湿燥湿作用，木香具理气效果作用，神曲、鸡内金和白术具消导消涨作用，仙鹤草和艾叶具止血诱食作用。

在本发明中，通过科学配伍，将多种中草药组成复方作为中草药饲料添加剂比添加于常规鱼用颗粒饲料，连续投喂试验结果表明，添加中草药的试验组患肠炎鱼体症状缓解、健康状态得到明显好转，在试验期间的死亡率显著低于对照组，进一步对比分析两组鱼体肠道内的菌群组成差异变化，显示添加中草药组鱼体肠道内有害菌群比例得到明显的抑制下降。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1治疗鱼类肠炎的中草药饲料添加剂的制备

将干燥的黄柏15份、红藤10份、败酱草10份、五倍子10份、石榴皮10份、白花蛇舌草20份、半枝莲15份、马齿苋15份、金银花25份、白头翁20份、葛根20份、黄连5份、苍术10份、茯苓20份、木香5份、神曲15份、鸡内金10份、白术15份、仙鹤草15份、艾叶10份混合后，先用普通粉碎机制备成粗粉，再利用超微粉碎机进行微粉加工，粉碎粒度为80％通过200目筛，将加工好的中草药复方粉剂于阴凉干燥处保存备用，作为饲料添加剂。

实施例2中草药饲料添加剂水提液的体外抑菌效果

(1)中草药水提液的制备：将中草药复方及配方中11种抗菌中草药单方(黄柏、金银花、败酱草、五倍子、白头翁、石榴皮、白花蛇舌草、半枝莲、马齿苋、红藤、黄连)，分别置于50℃恒温干燥箱中烘干至恒重；称取中草药单方及复方各50g，分别按1∶10比例加入蒸馏水浸泡30min；置于电磁炉上煎煮，煮沸后用文火煎煮30min，然后用4层纱布过滤，过滤后的中草药继续添水煎煮，重复2次；最后将滤液合并继续煎煮浓缩至50ml，使药液中生药含量为1g/ml，高压灭菌后4℃保存备用。

(2)中草药水提液体外抑菌试验：用于体外抑菌试验的供试菌株包括哈维氏弧菌、铜绿假单胞菌、溶藻弧菌、嗜麦芽窄食单胞菌、产气肠杆菌、鲁菲不动杆菌、迟钝爱德华氏菌、奇异变形杆菌、副溶血弧菌、嗜水气假单胞菌、金黄色葡萄球菌；将待测11种细菌分别接种于mh肉汤中增菌，28℃培养过夜后，离心收集菌体用生理盐水重悬并调整浓度至0.5麦度(含菌量约为1.5×10⁸个/ml)，然后分别涂布于mh琼脂平板，每板100μl菌液。每个平板中放置3个灭菌后的牛津杯，牛津杯内加入中草药水提液100μl。28℃恒温培养箱内培养24h后，测量抑菌圈大小，计算平均值。

(3)抑菌实验结果：利用平板打孔法测定了中草药复方ycj及配方中11种单方对11种鱼类致病菌和肠道菌的体外抑菌效果。结果显示不同菌株对不同中草药的敏感性存在一定差异，整体而言，石榴皮、五倍子对11种测试菌的抑菌效果最明显，平均抑菌直径大于18mm，其次为半枝莲，平均抑菌直径为14mm左右，而有部分中草药却没有表现出明显的抑菌效果，例如金银花、败酱草、马齿苋等(见表1)。中草药复方水提液对不同菌种的抑菌效果介于各中草药单方的中间水平，且同样对不同的菌株表现出差异抑菌效果，其中对副溶血弧菌、哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果较好，抑菌圈直径大于8mm，其次为嗜水气单胞菌与爱德华氏菌，抑菌圈直径为7mm，而对产气肠杆菌、奇异变形杆菌、鲁菲不动杆菌3种肠道细菌的抑菌直径均小于5mm。

表1：中草药水提液对鱼类致病菌及肠道菌的抑菌圈(直径mm)

(4)中草药饲料添加剂水提液的体外抑菌效果分析：本发明的中草药饲料添加剂中的一些单方成分，例如石榴皮、红藤、五倍子、半枝莲等对细菌均具有一定的抑杀效果，因而制作的复方制剂也表现出了明显的抑菌效果。但更值得注意的是，本发明的中草药饲料添加剂对鱼类重要的致病性细菌，如副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌、哈维氏弧菌及嗜水气单胞菌表现出较强的抑制作用，而对于鱼体肠道中的常规细菌的抑制效果却不是很明显，例如产气肠道与鲁菲不动杆菌，这便对于改善鱼体肠道菌群结构，促进肠道微生态平衡具有重要作用。

实施例3中草药饲料添加剂对患肠炎病大菱鲆肠道菌群影响的检测

(1)实验动物分组与处理：患肠炎病大菱鲆体长18±1cm，肛门发红拖白便，解剖后发现部分病鱼肠道发红、充水，选取100尾，随机分成两组，每组50尾。本试验的鱼体在相同环境的水槽内养殖，连续通气，水温为21±1℃，日换水1/2。其中，实验组拌饲投喂中草药添加剂，每kg配合颗粒饲料添加中草药复方制剂10g(1％)，对照组仅投喂配合颗粒饲料，每天早晚各投喂1次，连续投喂30天。

(2)取样和高通量测序分析：在投喂实验开始前及投喂结束后，分别从投喂中草药复方微粉的实验组中随机取3尾大菱鲆，置于解剖盘中，体表用75％酒精棉球擦拭，然后用灭菌的剪刀镊子将鱼体解剖并剥离出肠道，用剪刀剪取中肠组织，挤出内容物至无菌离心管中，同时将肠道剪开用无菌生理盐水冲洗4次，将组织放入离心管中，用组织匀浆机匀浆均匀。3尾鱼的肠道内容物和组织分别混合成一个样本，共有4个样品，分别为中草药投喂前鱼体肠道样品(it-c)与内容物样品(ic-c)，及中草药投喂结束后鱼体肠道样品(it-t)与内容物样品(ic-t)。利用qiaampdnastoolminikic(qiagen)提取样品中的细菌总dna。以引物5'-agagtttgatcctggctcag-3'和3'-cctacgggaggcagcag-5'pcr扩增样品中细菌16srdnav1-v3区序列。pcr的反应体系总体积25μl，包含5×reactionbuffer5μl，5×gcbuffer5μl，dntp(100mm)5μl，引物(10μm)各1μl，high-fidelitydnapolymerase1μl，dna模板2μl，无菌去离子水8.75μl。pcr反应条件：98℃下预变性2min，98℃下变性15s，55℃下退火30s，72℃下延伸30s，共进行30个循环；最后在72℃延伸5min。扩增好的dna序列，经琼脂糖电泳检测阳性后交由上海派森诺公司利用roche454flx+测序平台进行序列测定。

(3)数据分析流程：首先对高通量测序的原始下机数据根据序列质量进行初步筛查，对于双端序列还需根据重叠碱基进行配对连接。通过质量初筛的序列按照引物和index信息，识别分配入对应样本，并去除嵌合体等疑问序列。对获得的高质量序列进行otu(operationaltaxonomicunit，可操作分类单元)划分，每个otu的代表序列用于分类地位鉴定以及系统发育学分析。根据otu在不同样本中的丰度分布，评估每个样本的多样性水平，并通过稀疏曲线反映测序深度是否达标。随后绘制韦恩图(venn)，对各样本在不同分类水平的具体组成进行分析。在上述分析结果的基础上，通过多种多变量统计学分析工具，进一步衡量不同样本间的群落结构差异及与差异相关的otu，构建丰度分布高度相关的otu关联网络。进行alpha多样性分析，计算丰富度指数(richness)，包括计算chao指数、香农(shannon)指数、ace指数与simpson指数衡量样本物种多样性。

(4)测序结果的质量分析：对4个样品的高通量测序数据进行统计(见表2)，结果显示各样品获得的高质量序列数量都在4万条以上，保持在一个相当的水平，而肠道内容物样品中的out数量略高于肠道组织，说明肠道内容物中的细菌多样性高于肠道组织中的细菌多样性。反应样品多样性的chao1、ace、simpson、shannon指数值统计结果同样显示，肠道内容物中微生物群落的多样指数值略高于肠壁上的群落多样性，且在投喂中草药后群落的多样性有进一步的提升。利用qiime软件对otu丰度矩阵中每个样本的序列总数在不同深度下随机抽样，以每个深度下抽取到的序列数及其对应的otu数绘制稀疏曲线(见图1)，随着随机抽取的序列数进一步增加，各样品曲线逐渐趋于平缓,表明有效测序数量已经能够较好地覆盖菌种的多样性，本次取样深度可信，测序结果能够真实地反映样品中优势细菌的数量关系。

表2：各样品中高通量测序数据统计

(5)各样品中细菌多样性及优势otu种类的丰度分析：以97％相似性水平为标准划分可操作分类单元(otu)，it-c、it-t、ic-c与ic-t四个样品数据分别可划分为352、372、388和405个out，利用r语言工具统计和作图软件制作rank-abundance曲线图(见图2)，每条折线代表一个样本的otu丰度分布，折线在横轴上的长度反映了该样本中otu数的多少，代表了群落的丰富度，折线越长表示样本中的otu数越多；折线的平缓程度则反映了群落组成的均匀度，折线越平缓，群落组成的均匀度越高，折线越陡峭，则群落中各otu间的丰度差异越大，均匀度越低。因而，结果显示投喂中草药后肠道(it-t)及肠道内容物(ic-t)样品中的菌落丰富度略高于投喂前样品，且其菌落组成的均匀度也高于投喂前。对各个样品细菌多样性的相互关系进行分析，并构建venn图(见图3)。在中草药投喂前后大菱鲆肠道壁及肠道内容物中相对比例超过70％的otu都属共有otu。在肠道内容物样品中，中草药投喂前后共有155个差异out，而在肠道壁样品中，中草药投喂前后106个out发生了差异变化。

进一步对不同样品中的细菌门类及相对丰度进行统计，结果显示变形菌门(proteobacteria)、厚壁菌门(firmicutes)、柔膜菌门(tenericutes)、拟杆菌门(bacteroidetes)、放线菌门(actinobacteria)、酸杆菌门(acidobacteria)、蓝藻门(cyanobacteria)与梭杆菌门(fusobacteria)是各样品的优势门类。其中变形菌门与厚壁菌门的细菌类群占到总菌群的90％以上(表3)。进一步对各样品中优势细菌目的统计结果显示，优势细菌目主要包括根瘤菌目(rhizobiales)、乳杆菌目(lactobacillales)、芽孢杆菌目(bacillales)、弧菌目(vibrionales)、伯克氏菌目(burkholderiales)、枝原体目(mycoplasmatales)、放线菌目(actinomycetales)、梭菌目(clostridiales)、假单胞菌目(pseudomonadales)、肠杆菌目(enterobacteriales)、腐螺旋菌目(saprospirales)，其中在肠道内容样品中乳杆菌目与芽孢杆菌目细菌比例在投喂中草药后的比例较投喂前有较为明显的提升，而弧菌目、假单胞菌目及枝原体目细菌的比例有较为明显的下降，而在肠道样品中除枝原体目与假单胞菌目细菌比例有明显降低之外，其他目的细菌比例没有明显差异变化(表4)。

表3：各样品中优势细菌门类及其相对丰度百分比

表4：各样品中优势细菌目类及其相对丰度百分比

(6)结果分析讨论：本发明高通量测序数据分析结果显示，变形菌门(proteobacteria)和厚壁菌门(firmicutes)在养殖大菱鲆肠道中占据优势地位，说明变形菌门和厚壁菌门是鱼类肠道的固有细菌门类，但是它们在不同鱼类肠道中所发挥的作用目前仍不明确。本发明基于优势菌群比例的统计结果显示，大菱鲆在投喂中草药治疗前后肠道壁上的微生物菌群比例变化显著小于肠道内容物，venn图分析结果也显示在中草药投喂前后肠道内容物中差异out数量大于肠壁样品，说明鱼体肠壁上的微生物菌群的结构与组成相对于肠道内容中的菌群更为稳定，更不易受外界因素影响。

前期研究表明肠道微生物与宿主共同构建的肠道微生态系统对宿主消化代谢、肠道发育、体内平衡、免疫响应与抵御疾病等过程中发挥着至关重要的作用，因此肠道微生物也被许多学者称为宿主的外在器官，一个正常平衡的肠道微生物群体会对宿主的肠道免疫调节功能产生积极的影响，而一个比例失调的微生物群体则会造成宿主免疫调节功能紊乱，并且增加疾病发生的机率。随着中草药被越来越多人的认可，它对肠道菌群的影响与作用机理研究也得到一定开展。本发明显示，中草药投喂后肠道壁及肠道内容物样品中的菌落丰富度略高于投喂前样品，且其菌落组成的均匀度也高于投喂前。通过对优势菌群比例的变化分析结果显示，大菱鲆肠道壁在投喂后枝原体目与假单胞菌目细菌有较大比例的下降，在肠道内容物中弧菌目、假单胞菌目及枝原体目细菌的比例有较为明显的下降，乳杆菌目与芽孢杆菌目细菌比例在中草药投喂后的比例较投喂前有较为明显的提升，这些结果提示鱼体在患肠炎后肠道内细菌菌群的结构会受到影响，其菌落组成的均匀度会有所下降，而在患病大菱鲆肠道样品中的高比例弧菌、假单胞菌及枝原体菌群提示其与肠炎疾病存在一定相关性，而在中草药投喂治疗后肠道中的乳杆菌目与芽孢杆菌目细菌比例上升有助于肠道健康。

实施例4中草药饲料添加剂对患病大菱鲆肠炎的治疗效果

(1)实验动物分组与处理：同实施例中(1)所述。投喂期间，记录实验组与对照组的鱼体死亡情况，并在投喂试验结束后计算相对保护率。

(2)治疗效果：在实验过程中观察到，投喂中草药添加剂组的养殖水槽内，白便逐渐减少，鱼体肛门红肿突出情况缓解，实验结束后观察多数肠道恢复白色，肠道内容物饱满；基于对试验组与对照组连续记录的鱼体死亡情况数据，制作累计死亡曲线图(见图4)，发现中草药添加剂投喂组与正常饲料投喂对照组的发病鱼体在投喂治疗试验开始后的前2周均出现了相似的死亡率，但是在连续投喂2周后，中草药投喂组鱼体的死亡率显著低于对照组，至投喂试验结束时，中草药投喂组患病鱼体的累计死亡率为18％，而普通饲料投喂对照组的累计死亡率为34％，计算中草药投喂组的相对保护率为47％。

(3)结果讨论：肠炎病是鱼类工厂化养殖过程中常见而且危害较大的疾病之一，目前常规的治疗方式以拌饲投喂抗生素为主。长期使用抗生素，不仅提高了病原菌的耐药性，同时会破坏鱼体正常肠道菌群结构，造成菌群失调加重病情。因此，本发明基于不同中草药的药理特性，选择了具有清热解毒作用的黄柏、红藤、石榴皮、五倍子、白花蛇舌草、半枝莲、金银花、白头翁、败酱草、马齿苋，具解表止泻的葛根、黄连，具化湿燥湿的苍术、茯苓，具理气效果的木香，具消导消涨作用的神曲、鸡内金和白术以及具止血诱食的一个仙鹤草与艾叶配伍形成中草药饲料添加剂。治疗试验结果表明，投喂本发明的中草药复方制剂能够改善患肠炎病鱼肠道发红、白便的症状，最终降低病鱼的死亡率，显示出对大菱鲆肠炎病良好的治疗效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。