本申请为分案申请，原申请申请号：201410674215.1，申请日：2014-11-21，发明名称：饲料用益生菌微胶囊及其应用。本发明涉及一种益生菌胶囊产品及其应用，属于微生物饲料添加剂
技术领域：
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背景技术：
：乳酸菌类微生态饲料添加剂是抗菌药物的替代品中重要的一种。乳酸菌是肠道正常菌群中有益菌的杰出代表之一，具有重要的生理和保健功能：它可以拮抗病原微生物，调节动物消化道微生物区系平衡：活化免疫系统，增强免疫力，防止多种疾病和不良反应的发生；抑制肿瘤的发生，保护动物健康；合成营养物质，产生消化酶类，提高动物消化酶的活性，改善维生素的代谢，中和肠毒素，降低胺、氨等有害物质的产生等。然而，乳酸菌在生长过程中不形成芽抱，抗逆性较差，对外界环境，如氧、水分、高温、机械挤压、热激及胃酸等都非常敏感，在实际的应用中难以保证有效的活菌存活数量。因此，如何筛选出优良的乳酸菌种并延长其商品活性，一直是世界各地乳酸菌生产厂商的研发重点。微胶囊技术是保护菌体活力最为有效和实用的方法之一。将乳酸菌进行微胶囊化，可以将菌体与外界的不良环境分开，免受饲料中微量元素损害，减缓制粒过程中温度和压力的影响；形成固体颗粒，利于在预混料中的均匀分布，也有利于储存和运输：采用肠溶性壁材后，还能保证尽可能多的菌体到达肠道，真正起到保健和治疗的功效。如：专利cn1613455中公开了一种采用三层保护层包被的益生菌微胶囊；专利cn1569043中公开了一种采用海藻酸钠、氯化钙为壁材进行流化床喷雾包被制成的乳酸菌微胶囊。上述专利在一定程度上提高了益生菌或乳酸菌的存活率，但不可避免的是，cn1613455中氢化油脂温度超过55℃，会对芯材内部的乳酸菌造成损伤，同时外层的控释包衣材料，使乳酸菌在肠道中不能快速地释放，会导致一部分乳酸菌被排出体外，降低乳酸菌的利用率。cn1569043中采用海藻酸钠作为壁材，是目前微胶囊包被中经常使用的，但海藻酸钠本身持水能力差，由海藻酸钠包被的微胶囊凝胶易于失水硬化破裂，此外海藻酸钠包被的微胶囊不耐胃酸，使微胶囊过胃能力差。名称为一种含有多层微胶囊乳酸菌的乳酸菌粉的制备方法，专利申请号为：201310743621.4，发明属于营养保健食品
技术领域：
，尤其涉及一种含有胶原肽和多层微胶囊乳酸菌的乳酸菌粉的制备方法，其特征在于：将海洋鱼皮胶原低聚肽粉20份～30份，柠檬酸5份～20份与多层微胶囊乳酸菌粉40份～50份混合搅拌。本发明的有益效果是，可使益生菌在人体胃肠中定植生长繁殖，它可改善胃肠环境，可杀灭多种有害病菌和有害微生物，它可在人体内生产出各种消化酶，能够帮助消化吸收，强壮身体。一种乳酸菌微胶囊及其制备方法和用途，申请号：200810135259.1，该发明也公开了一种乳酸菌微胶囊及其制备方法和用途。该乳酸菌微胶囊是由外层壁材、冻干保护剂和乳酸菌组成。本发明还提供了该乳酸菌微胶囊的制备方法及其作为饲料添加剂的用途。本发明的乳酸菌微胶囊可有效保护芯材内的乳酸菌,延长乳酸菌在室温条件下的存活时间,提高乳酸菌对饲料中金属离子的耐受性；另外,该乳酸菌微胶囊耐胃酸性好,在肠道内可迅速崩解,释放出乳酸菌,从而真正提高乳酸菌的利用率,起到平衡肠道微生态环境抑制病原菌生长,保证动物的肠道健康,降低动物肠道的发病率等作用。大北农公司申请的名称为《饲用乳酸菌微胶囊的生产工艺及其微胶囊与应用和预混料》的发明，申请号：201110415081.8，发明公开一种饲用乳酸菌微胶囊的生产工艺及其微胶囊与应用和预混料。本发明通过利用在低温下能够快速形成玻璃化保护状态海藻糖、乳糖等和谷氨酸钠、硫酸锰、甘油和聚乙烯吡咯烷酮作为主要壁材成分，采用特殊的超生波喷雾干燥设备，采用超声波喷嘴进行雾化，利用真空和保护性气体氮气等在常温下进行干燥，避免了低温冻干的低温和高温喷雾干燥的高温对乳酸菌活性的影响，菌存活率能够达到90％以上。工艺实现了乳酸菌在常温下进行干燥，且制备工艺便于控制、制得的产品贮藏期长，能够大幅度延长产品的贮藏时间。其中涉及一种涉及超声波喷雾干燥设备在专利2011205033111中披露。综上所述，现有的微胶囊包被技术或者在其实施过程中会对乳酸菌产生较大的破坏作用，或者制成的微胶囊对胃部环境的耐受性较差，这些都不利于微胶囊产品的产业化和应用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种益生菌微胶囊产品，由壁材、植物乳杆菌、水苏糖、羊肚菌酶解粉组成。对益生菌微胶囊产品进行包被的方法如下：将经发酵罐发酵培养后的益生菌发酵液中添加发酵液质量3-5％的水苏糖和5-8％的羊肚菌酶解粉，然后发酵液与壁材溶液混合，得混合溶液；采用超声波真空喷雾干燥的方法，一级真空干燥，二级惰性保护气体加震动流化床干燥，对益生菌进行微胶囊包被。所述壁材溶液的组成如下：酶解大豆分离蛋白4-10％、壳聚糖0.5-1％、普鲁兰多糖0.2-0.5％、黄原胶0.2-1％、卡拉胶0.1-0.5％、甘油0.5-2％、海藻糖0.2-0.5％，余量为蒸馏水；上述均为重量体积百分比。按上述组成独立称取各种组分，混合于蒸馏水中加热溶解，ph自然，完全溶解后冷却至室温，即得所述壁材溶液。所述酶解大豆分离蛋白的制备方法如下：配制浓度为10-13％的大豆分离蛋白溶液，加热到30-45℃，调整ph到3-5,加入大豆分离蛋白重量0.1-1％的酸性蛋白酶，保温酶解0.5-1.5小时，酶解后溶液喷雾干燥获得酶解大豆分离蛋白。所述羊肚菌酶解粉的制备方法如下：(1)羊肚菌子实体干燥粉碎；(2)水溶均质：将粉碎后的羊肚菌子实体加入不锈钢筒中，加入子实体质量3-6倍的水，浸泡3-5小时，然后将此羊肚菌子实体液通过胶体磨，胶体磨操作条件为：调整胶体磨定子与转子的间隙为0.5-1微米，胶体磨流量为0.4-1吨/小时；(3)升温酶解：将经过胶体磨处理的羊肚菌子实体液转移到不锈钢酶解罐中加热到50-60℃，调整ph到4.5-6.0,加入羊肚菌子实体重量0.05-0.1％的纤维素酶、0.01-0.1％的β-葡聚糖酶、0.01-0.1％的蛋白酶，保温酶解0.5-1.5小时，酶解过程中不断搅拌；(4)干燥：酶解后的醪液过滤后干燥获得羊肚菌酶解粉。所述植物乳杆菌优选菌株tlj-2014，该菌株已于2014年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编：100101)，保藏编号为cgmccno.9405，分类命名为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)。本发明中植物乳杆菌tlj-2014菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。理化特征为：过氧化氢酶(-)，明胶液化(-)，吲哚实验(+)，运动性(-)，发酵产气(-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氢气体(-)，ph4.0mrs培养基中生长(+)。本发明植物乳杆菌tlj-2014采用下述流程进行选育：原始出发菌种→试管活化→硫酸二乙酯(des)诱变→亚硝基胍(ntg)诱变→等离子体诱变→平板初筛→摇瓶复筛→传代稳定性试验。本发明所采用的出发菌株在mrs葡萄糖培养基中，其乳酸的生产速率为1.5g/l/d,当培养基ph为3.5时几乎停止生长。出发菌株为李政采集于宁夏盐池县育肥羊场的青储饲料，采集时间2013年9月15日。为了提高其乳酸生产速率、耐酸能力和亚硝酸盐的分解速率，依次采用des和ntg技术对该菌种进行诱变，诱变后菌株采用mrs碳酸钙平板进行初筛，然后采用500ml摇瓶发酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株，然后做传代实验，评价其遗传稳定性。植物乳杆菌tlj-2014遗传稳定性结果表明：经过连续传代十次，各项性能指标都比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把植物乳杆菌tlj-2014作为选育得到的目的菌株。经验证发现：该诱变菌株的乳酸生产速率可以达到35g/l/d，该菌株经过71小时发酵后乳酸浓度达到95g/l；能够在ph为1.80的条件下存活，能够耐1％胆盐。本发明另一目的是提供该胶囊作为饲料添加剂的应用。本发明的胶囊作为饲料添加剂可广泛用于动物饲料中，但本发明优选用于禽类动物的饲料中。胶囊产品在饲料中的添加量为3-5％，或每头家禽每日使用10-20克。有益效果：本发明提供的益生菌胶囊，其壁材中添加了改性大豆分离蛋白，改性大豆分离蛋白比大豆分离蛋白乳化能力提高25％、胶凝能力提高15-25％，改性大豆分离蛋白与黄原胶、卡拉胶及壳聚糖的配合使用，凝胶强度提高了10％以上，增强了胶囊的耐胃酸性；本发明胶囊采用改性大豆分离蛋白，具有很好的肠溶性，胶囊到达肠道后在1-1.5小时内即可完全崩解释放出益生菌，并迅速增殖成为优势菌群，从而达到抑制病原菌生长等作用。本发明利用羊肚菌酶解粉，经过酶解处理不仅使其营养成分有效释放到产品中，同时也使得羊肚菌的特殊香味通过酶解得到有效释放，使产品兼具羊肚菌的营养特性，具有良好适口性，提高动物饲喂效果，与同类近似市售产品相比，可有效提高畜禽对此产品的喜好度10-15％(通过采食量的比较)。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。实施例1本发明植物乳杆菌tlj-2014的具体选育过程如下：1.des诱变选育1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌l一环，接入装有50ml培养基mrs(无琼脂，葡萄糖20g/l)的250ml三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。2)取5ml菌液，5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。3)用ph7.0磷酸缓冲液稀释成107个/ml菌悬液。4)取32mlph7.0的磷酸钾缓冲液、8ml菌悬液、0.4mldes在预先放入转子的150ml三角瓶中充分混合，使des最终浓度为1％(v/v)。5)在37℃摇床中150rpm反应30min，取1ml混合液，加入0.5ml25％na2s2o3溶液中止反应。6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2ml，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/l葡萄糖的碳酸钙mrs培养基)平皿中。在37℃培养2～3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株转印到ph为1.5、1.8和2.0的lphmrs培养基(低ph值改性mrs培养基)上和亚硝酸钠筛选培养基(单一氮源为2g/l亚硝酸钠的改性mrs筛选培养基)上。7)在37℃培养2～3天后，挑选菌落较大，分别能在lphmrs培养基、亚硝酸钠筛选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取出的菌落命名为植物乳杆菌l1。2.亚硝基胍诱变1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌l1一环，接入装有50ml培养基mrs(无琼脂)(葡萄糖浓度为60g/l)的250ml三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。2)取5ml菌液5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。3)用ph6.0磷酸缓冲液稀释成107个/ml菌悬液。4)取10ml菌悬液转移至100ml三角瓶中，加入10mg的ntg，配制成终浓度为10mg/ml的ntg溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于ntg溶解。5)在37℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2ml，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/l葡萄糖的碳酸钙mrs培养基)平皿中。在37℃培养2～3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株转印到ph为1.5、1.8和2.0的lphmrs培养基(低ph值改性mrs培养基)上和亚硝酸钠筛选培养基(单一氮源为2g/l亚硝酸钠的改性mrs筛选培养基)上。7)挑选菌株方法：挑选菌落较大，分别能在lphmrs培养基、亚硝酸钠筛选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取100支符合以上条件的菌落。3.摇瓶复筛1)在超净台上分别取各试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50ml培养基mrs(无琼脂)(葡萄糖浓度为100g/l)的250ml三角瓶中，200rpm，37℃培养15h左右，使菌体处于对数生长中期。2)分别取5ml菌液，接入装有50ml碳酸钙筛选液体培养基(含250g/l葡萄糖的碳酸钙mrs培养基)平皿中、ph为1.5、1.8和2.0的lphmrs液体培养基(低ph值改性mrs培养基)和亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/l亚硝酸钠的改性mrs筛选培养基)上(注：采用250ml三角瓶)。200rpm，37℃培养3-4天，每天分别检测碳酸钙筛选液体培养基中l-乳酸产生速率、lphmrs液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。发酵结束后，比较100株菌种的碳酸钙筛选液体培养基中l-乳酸产生速率、lphmrs液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。3)选择兼具高l-乳酸产生速率、耐受低ph(该菌种仅能在最低为ph1.8的培养基中生长)和亚硝酸盐的消耗速率高的菌株，将其命名为l2菌。4.遗传稳定性试验将l2菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。菌株命名为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)tlj-2014。5.发酵罐试验1)取斜面上的植物乳杆菌l2一环，接入装有50ml培养基mrs(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/l)的250ml三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。2)将对数期的菌种接入装有3lmrs液体培养基(初始葡萄糖为150g/l)的5l发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5l/min)，后期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌l2的乳酸产量达到95g/l。3)将对数期的菌种接入装有3lph为1.8的lphmrs液体培养基(初始葡萄糖为50g/l)的5l发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5l/min)，后期厌氧，整个过程用0.5mol/l的氢氧化钠将发酵液ph控制在1.8，总培养时间为48小时。发酵结束后，检测植物乳杆菌l2的生物量为2.5g/l，说明植物乳杆菌l2能够在ph1.8的环境中生存。4)将对数期的菌种接入装有3l亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/l亚硝酸钠的改性mrs筛选培养基)的5l发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5l/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/l的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌l2对亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，l2对亚硝酸钠的降解速率可以达到563mg/h/l。实施例2一种益生菌微胶囊产品，由壁材、植物乳杆菌、水苏糖、羊肚菌酶解粉组成。对益生菌微胶囊产品进行包被的方法如下：将经发酵罐发酵培养后的植物乳杆菌cgmccno.9405发酵液中添加发酵液质量3％的水苏糖和8％的羊肚菌酶解粉，然后与壁材溶液混合，得混合溶液；采用超声波真空喷雾干燥的方法，一级真空干燥，二级惰性保护气体加震动流化床干燥，对益生菌进行微胶囊包被。所述超声波喷雾干燥的方法采用发明专利申请201110415081.8公开的方法。具体为开启超声波喷雾干燥设备，待干燥室内真空压力维持在2.5-3.0kpa后，调整流速为0-20ml/min,干燥室内的温度在20-30℃左右；二级干燥流化床内充保护气体二氧化碳，温度维持在10-20℃。所述的超声波喷嘴的频率为20khz-30khz。发酵液和壁材溶液组成的混合悬浮液经过超声波喷嘴进行雾化后，随即进入真空干燥室进行干燥，液滴在短时间内便形成胶囊，然后经过3-25秒的干燥时间，落到干燥室的底部；然后进入震动流化床，即进行二级震动流化床干燥，经20-40min，在出料口收集，即得到益生菌胶囊。胶囊的含水量为8％，菌存活率93％。所述壁材溶液的组成如下：酶解大豆分离蛋白4％、壳聚糖1％、普鲁兰多糖0.2％、黄原胶1％、卡拉胶0.1％、甘油0.5％、海藻糖0.5％，余量为蒸馏水；上述均为重量体积百分比。按上述组成独立称取各种组分，混合于蒸馏水中加热溶解，ph自然，完全溶解后冷却至室温，即得所述壁材溶液。所述酶解大豆分离蛋白的制备方法如下：配制浓度为13％的大豆分离蛋白溶液，加热到45℃，调整ph到3,加入大豆分离蛋白重量1％的酸性蛋白酶，保温酶解0.5小时，酶解后溶液喷雾干燥获得酶解大豆分离蛋白。所述羊肚菌酶解粉的制备方法如下：(1)羊肚菌子实体干燥粉碎；(2)水溶均质：将粉碎后的羊肚菌子实体加入不锈钢筒中，加入子实体质量3倍的水，浸泡5小时，然后将此羊肚菌子实体液通过胶体磨，胶体磨操作条件为：调整胶体磨定子与转子的间隙为0.5-1微米，胶体磨流量为0.4吨/小时；(3)升温酶解：将经过胶体磨处理的羊肚菌子实体液转移到不锈钢酶解罐中加热到50℃，调整ph到4.5,加入羊肚菌子实体重量0.05％的纤维素酶、0.01％的β-葡聚糖酶、0.01％的蛋白酶，保温酶解1.5小时，酶解过程中不断搅拌；(4)干燥：酶解后的醪液过滤后干燥获得羊肚菌酶解粉。实施例3一种益生菌微胶囊产品，由壁材、植物乳杆菌、水苏糖、羊肚菌酶解粉组成。对益生菌微胶囊产品进行包被的方法如下：将经发酵罐发酵培养后的植物乳杆菌cgmccno.9405发酵液中添加发酵液质量5％的水苏糖和5％的羊肚菌酶解粉，然后与壁材溶液混合，得混合溶液；采用超声波真空喷雾干燥的方法，一级真空干燥，二级惰性保护气体加震动流化床干燥，对益生菌进行微胶囊包被。所述壁材溶液的组成如下：酶解大豆分离蛋白10％、壳聚糖0.5％、普鲁兰多糖0.5％、黄原胶0.2％、卡拉胶0.5％、甘油2％、海藻糖0.2％，余量为蒸馏水；上述均为重量体积百分比。按上述组成独立称取各种组分，混合于蒸馏水中加热溶解，ph自然，完全溶解后冷却至室温，即得所述壁材溶液。所述酶解大豆分离蛋白的制备方法如下：配制浓度为10％的大豆分离蛋白溶液，加热到35℃，调整ph到5,加入大豆分离蛋白重量0.1％的酸性蛋白酶，保温酶解1.5小时，酶解后溶液喷雾干燥获得酶解大豆分离蛋白。所述羊肚菌酶解粉的制备方法如下：(1)羊肚菌子实体干燥粉碎；(2)水溶均质：将粉碎后的羊肚菌子实体加入不锈钢筒中，加入子实体质量6倍的水，浸泡3小时，然后将此羊肚菌子实体液通过胶体磨，胶体磨操作条件为：调整胶体磨定子与转子的间隙为0.5-1微米，胶体磨流量为1吨/小时；(3)升温酶解：将经过胶体磨处理的羊肚菌子实体液转移到不锈钢酶解罐中加热到60℃，调整ph到6.0,加入羊肚菌子实体重量0.05％的纤维素酶、0.1％的β-葡聚糖酶、0.1％的蛋白酶，保温酶解0.5小时，酶解过程中不断搅拌；(4)干燥：酶解后的醪液过滤后干燥获得羊肚菌酶解粉。实施例4益生菌胶囊产品人工胃液试验测定。将实施例1-2中的胶囊产品置于37℃的人工胃液中保温并不断搅拌，2h后取出，用灭菌生理盐水洗涤，用解囊液溶解，测定菌存活率，并与未包埋的菌液进行比较。试验结果见表1。表1胶囊崩解及菌存活率试验结果实施例5本发明实施例1胶囊产品作为饲料添加剂在哺乳母猪中的饲喂效果试验。在宁夏中卫选择猪场进行了为期21天的饲喂试验。试验采用单因素对比设计，随机选取50头健康的、产仔头数与出生均重相近的、胎次均为2或3胎的哺乳母猪，随机分为2组(即试验组和对照组)，每组15个重复。其中：试验组日粮添加由实施例1制备得的本产品，对照组为添加市场同类产品。记录仔猪断奶重、腹泻率、死亡率等结果，具体见表2。表2哺乳母猪饲喂试验结果项目试验组对照组备注产活仔数(头数)10.911.0出生均重(kg)1.461.4821天断奶小猪(头)108.3021天断奶窝重(kg)66.444.421天断奶均重(kg)6.645.35头净增重(kg)5.183.87仔猪腹泻率(％)6.011.4死亡率(％)1.84.1试验结果表明：本发明产品可改善母猪和仔猪机体免疫能力，减少抗生素用量，增加养殖质量和效益。当前第1页12