本发明属于生物
技术领域：
，根据青贮饲料的发酵特性，添加不同混合比例的微生物菌粉，控制青贮过程中杂菌的生长，提高玉米青贮饲料的有氧稳定性，提高青贮饲料品质、提高反刍动物生长性能。
背景技术：
：全株玉米的青贮过程中最重要的变化是由微生物发酵引起的，发酵过程是一个由好氧发酵向厌氧发酵转变的过程，其中乳酸菌的发酵是决定着青贮饲料品质的好坏。乳酸菌发酵能够产酸乳酸、乙酸等多种有机酸，降低ph值，抑制芽孢杆菌、霉菌等腐败菌的生长，同时有机酸也是反刍动物重要的营养来源。但是在青贮过程中，在窖池表层由于空气较多，容易滋生霉菌等腐败菌，破坏青贮饲料品质，如何控制青贮表层霉菌的生长是青贮过程至关重要的环节。传统的玉米青贮以自然青贮为主，利用植物自身携带的微生物进行青贮发酵，在这一过程中由于产地、季节、稳定、品种等因素的影响，植物自身携带的微生物菌群结构相差较大，进而导致青贮饲料品质不稳定，差异性大，难以满足现代养殖过程中对青贮饲料的高品质要求。技术实现要素：本发明针对青贮过程中乳酸菌含量低、有氧稳定性差、霉菌过量等问题，发明了利用三种不同微生物，根据青贮过程的特性，开发出一种青贮添加剂综合利用技术，从而起到提高全株玉米青贮品质的目的。首先，本发明提供一种提高青贮饲料有氧稳定性和降低表层霉菌污染的发酵剂，其包括底层青贮饲料发酵剂，和表层青贮饲料发酵剂，所述的底层青贮饲料发酵剂由干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)菌粉和布氏乳杆菌(lactobacillusbuchneri)菌粉制成，所述表层青贮饲料发酵剂由布氏乳杆菌菌粉和酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)菌粉制成。其中，副干酪乳杆菌菌粉活菌数不少于1.0×1010cfu/g，布氏乳杆菌菌粉活菌数不少于5.0×109cfu/g，酿酒酵母菌粉活菌数不少于5.0×108cfu/g。其中，所述底层青贮饲料发酵剂由副干酪乳杆菌菌粉和布氏乳杆菌菌粉按重量比1：1混合而成；所述表层青贮饲料发酵剂由布氏乳杆菌菌粉和酿酒酵母菌粉按重量比1：1混合而成。其中，所述酿酒酵母优选为酿酒酵母cgmccno.6560。其中，所述布氏乳杆菌优选为布氏乳杆菌cgmccno.12850。本发明还提供一种提高青贮饲料有氧稳定性和降低表层霉菌污染的发酵方法，其包括如下步骤：1)采用腊熟期的全株青贮玉米，收获后将玉米粉碎至1～2cm小段；2)青贮玉米堆积过程分为窖池底层和窖池表层，窖池表层是指距离青贮玉米表层40-60cm厚度的堆积层。3)窖池底层玉米在青贮过程中用喷雾的方式添加权利要求1-6任一项所述的底层青贮玉米发酵剂；4)窖池表层玉米在青贮过程中用喷雾的方式添加权利要求1-6任一项所述的表层青贮玉米发酵剂；5)在窖池表面覆盖塑料薄膜，青贮发酵45～60天。其中，按重量比0.08～0.2％添加所述的底层青贮饲料发酵剂，按重量比0.08～0.2％添加所述的表层青贮饲料发酵剂。本发明根据窖池中空气的残留情况，将窖池中的青贮玉米分成两个部分，一是含氧量较低的窖池底部及中部，二是含氧量较高的窖池表层。窖池底部和中部含氧量低，有利于乳酸菌的生长，在青贮过程中添加副干酪乳杆菌和布氏乳杆菌；在窖池表层含氧量较高，霉菌容易滋生，以布氏乳杆菌和酿酒酵母作为主要的青贮剂。本发明通过外源添加乳酸菌，能够快速降低青贮过程中的ph值，起到抑制杂菌生长的目的。在青贮窖池的表层，由于残存空气较多，霉菌容易滋生，破坏青贮饲料的品质，还容易产生真菌毒素超标等问题，通过添加酿酒酵母，既能消耗残存的空气，还能产生乙醇、丙酸等代谢产物，起到抑制真菌生长的目的。本发明制备的青贮玉米饲料在奶牛饲喂过程中，能够提高奶牛产奶量30％以上，同时改善牛奶品质。具体实施方式通过以下实施例对本发明的青贮方法、制备工艺和应用进行详述，所述说明是描述性的，并不限制本发明的保护范围。实施例1布氏乳杆菌cgmccno.12850的筛选1、初筛采集发酵成熟的玉米青贮及苜蓿青贮样品20份，分别称取10g样品，加入90ml无菌水制成菌悬液，于180r/min振荡30min，梯度稀释至合适梯度，涂布于mrs培养基上，培养获得75株乳酸菌。mrs液体培养基的制作方法是：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，ph6.2～6.6，蒸馏水1000ml，高压蒸汽灭菌后备用。mrs固体培养基的制作方法是：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂2％，ph6.2～6.6，蒸馏水1000ml，高压蒸汽灭菌后备用。2、复筛(1)布氏乳杆菌的筛选将初筛得到的菌落分别接种于糖发酵培养基中，布氏乳杆菌可以分解葡萄糖产酸产气、可以分解麦芽糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、松三糖、蜜二糖。不能分解乳糖、甘露醇、纤维二糖、半乳糖、山梨醇、甘露糖、棉籽糖、山梨糖、水杨苷、七叶苷、淀粉。培养获得布氏乳酸菌15株。糖发酵培养基的配制方法是：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，吐温800.1％，盐溶液a(磷酸二氢钾10g，磷酸氢二钾10g蒸馏水100ml)0.5％(体积比)，盐溶液b(七水硫酸镁11.5g，二水硫酸锰2.4g，七水硫酸亚铁0.68g，蒸馏水100ml)0.5％(体积比)。以上成分溶解后调ph至6.8～7.2，分装试管。高压灭菌121℃20～30min。阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖、覃糖、棉籽糖、松三糖、淀粉、菊粉、甘露糖、山梨醇、肌醇、七叶苷、水杨苷、扁桃苷、葡萄糖酸钠各10克，将以上各糖配制成10％水溶液，经过滤灭菌后用无菌操作加到无菌基础培养基中。(2)耐酸能力配制不同ph的mrs液体培养基，将上述mrs液体培养基用0.1mol/l的盐酸分别调节ph值至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5。将筛选获得的布氏乳杆菌接种到不同ph的mrs培养基中，37℃静置培养24小时，稀释涂布平板法计数。其中，菌株dbnbs03具有较强的耐酸性，在ph为3.5的mrs培养基中仍能够检测出存活的布氏乳杆菌，存活率约为11.7％。(3)产酸能力测定有机酸使用采用高效液相色谱同时定量法。仪器：采用岛津10a高效液相色谱仪，岛津spd-10a检测器。色谱条件：shodexkc-811色谱柱(8mm×300mm)，3mm高氯酸为流动相，检测波长210nm，流速1ml/min，进样量5μl，柱温50℃。有机酸标准溶液的配制：分别准确称取乳酸、乙酸1.1765g、0.05050g，用超纯水定溶于25ml容量瓶中，配制乳酸、乙酸标准母液，再分别稀释为相应浓度的标准液，于4℃下冷藏备用。样品的制备：将培养该布氏乳杆菌的mrs培养基8000rpm离心10分钟后，用0.45nm滤膜过滤，浸提液待机分析。此菌株和实验室其他有效菌株及某些国内外产品分离菌株(国内是从宝来利来某产品分离得到的，命名bl-1，国外是从拉曼某产品分离得到的，命名为lm-1)的产酸能力比较如下表1所示：表1乳酸菌菌株产酸能力测定通过表1可知，dbnbs03与国内外部分产品及实验室之前所筛选出的乳酸菌菌株相比能够产生更多的乙酸，当其作为青贮饲料发酵剂作用于青贮时，青贮饲料中会产生大量乙酸。乙酸具有抗真菌作用，其含量的增加能够抑制青贮饲料中酵母的生长繁殖，有效防止或延缓青贮饲料有氧变质的发生。(4)菌株鉴定利用细菌通用引物对筛选出的菌株进行16srdnapcr扩增后鉴定，经ncbi序列比对，dbnbs03结果相似性最高(100％)的为布氏乳杆菌，故分子鉴定dbnbs03为布氏乳杆菌。(5)抑菌能力测定指示菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、荧光假单胞菌、葡萄酒酵母、红酵母、黑曲霉、灰绿青霉。乳酸菌选用mrs培养基，单核细胞增生李斯特氏菌选用tsa+ye培养基，酵母和霉菌选用ypd培养基，其他指示菌选择营养肉汤培养基，用麦氏比浊法制成1×1010cfu/ml的菌悬液,用于本试验；制备乳酸菌菌液：初筛分离得到的布氏乳杆菌dbnbs03，以5％接种量接种于mrs液体培养液中，37℃，静止培养至稳定期，取发酵液12000rpm离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤，除去菌体及其他杂质上清液备用；抑菌活性测定：抑菌活性测定采用琼脂扩散法，1.2％的琼脂，按每平皿10ml倾倒在无菌平皿中晾干；制备含0.7％琼脂适宜指示菌生长的软琼脂培养基，冷至50℃左右，每100ml接入0.6ml过夜培养的指示菌菌液，在底层有琼脂的平皿上倾倒6ml含有指示菌的软琼脂培养基，晾干；用打孔器在涂有指示菌的培养基上打孔，孔直径6mm；在孔中加入50μl发酵上清液，超净工作台上放置3h；置于适宜培养条件下进行培养，测量抑菌圈大小并记录。表2：布氏乳杆菌dbnbs03对指示菌的抑制作用通过表2可知，布氏乳杆菌菌株dbnbs03对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母以及霉菌的生长都有显著的抑制作用，布氏乳杆菌能够产生细菌素或类细菌素，不仅能抑制革兰氏阳性菌，而且对革兰氏阴性菌和真菌也有抑制作用，可以有效抑制常见的病原菌，并且能够有效抑制青贮饲料中酵母菌的增殖，有助于提高青贮饲料的有氧稳定性。(6)抗氧化能力测定布氏乳杆菌菌株dbnbs03、宝来利来产品中菌株bl-1、拉曼产品中菌株lm-1液体活化后，以质量分数为3％接种量接种于mrs液体培养基，37℃静置培养18h，3000r/min，离心15min，收集菌体。离心后的菌体用ph值为7.4的磷酸缓冲溶液(pbs)洗涤3次，重新悬浮于pbs缓冲溶液中，调整菌数至109cfu/ml，将菌体液超声波冰浴破碎，细胞残骸于10000r/min离心10min，上清液即为无细胞提取物。二苯代苦味酰基(dpph·)自由基测定dpph·溶于无水乙醇，反应时1ml提取液加1ml浓度为0.2mmol/l的dpph·，室温下静置30min后，在517nm处测吸光度变化。dpph·的清除率(％)＝[1－(a1－a2)/a3]×100式中：a1表示未加样品的dpph溶液的原始吸光度；a2表示样品在测定波长时的吸光度；a3表示加样后dpph溶液的吸光度。超氧阴离子自由基(o2·)测定反应体系包括浓度为150mmol/l的tris－hcl(ph8.2)、浓度为3mmol/l的二乙三胺五乙酸、浓度为1.2mmol/l邻苯三酚和0.5ml样品，总反应体积为3.5ml。25℃恒温水浴反应10min，测od325。o2·清除率(％)＝[1－(a11－a10)/(a01－a00)]×100式中:a00为不含样品和邻苯三酚；a01为不含样品，含邻苯三酚；a10为含样品，不含邻苯三酚；a11为含样品和邻苯三酚。表3不同菌株对dpph和超氧阴离子自由基(o2·)的清除作用(％)dpph·是一种稳定的以氮为中心的自由基，若能清除它，则表示菌株具有降低羟自由基、烷自由基或超氧自由基等自由基的有效浓度。超氧阴离子自由基(o2·)是第一氧自由基，可以通过一系列反应生成其它氧自由基，具有重要的生物功能。研究结果表明，dbnbs03菌株的发酵上清液清除dpph·的能力最强，清除率为90.9％，发酵液上清和无细胞提取物对o2·的清除作用分别为15.9％及10.4％，其清除自由基的作用明显高于其它菌株。将该布氏乳杆菌dbnbs03(lactobacillusbuchneridbnbs03)，于2016年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：cgmccno.12850。实施例2副干酪乳杆菌和布氏乳杆菌cgmccno.12850培养mrs液体培养基的制作方法是：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，ph6.2～6.6，蒸馏水1000ml，高压蒸汽灭菌后备用。发酵条件：两种菌株按照1％的接种量，在100l发酵罐上进行培养，发酵温度37℃，通风量1：0.2，转速80r/min，罐压0.05mpa，发酵时间20h。菌粉制备：发酵结束后，5000r/min离心浓缩，添加由脱脂乳:海藻糖:可溶性淀粉:谷氨酸钠:甘油＝1:1:1:1:1配置的保护液，菌泥与保护液比例1：10，乳化；将乳化液放入-80℃的超低温冰箱内，预冻3h。将上述预冻好的乳化液放入真空冷冻干燥机中，冻干条件为真空度0.2mba，冷阱温度为-55℃，真空冷冻干燥30h，即得到副干酪乳杆菌(市售获得)和布氏乳杆菌冻干粉，副干酪乳杆菌活菌数为1.0×1010cfu/g，布氏乳杆菌活菌数为5.0×109cfu/g。实施例3酿酒酵母cgmccno.6560菌粉制备酵母完全培养基ypd：酵母提取物10g，蛋白陈20g，葡萄糖20g，定容至1000ml。发酵条件：酿酒酵母cgmccno.6560按照1％的接种量，在100l发酵罐上进行培养，发酵温度37℃，通风量1：0.4，转速120r/min，罐压0.05mpa，发酵时间36h。菌粉制备：发酵结束后，5000r/min离心浓缩，添加脱脂乳:海藻糖:可溶性淀粉:谷氨酸钠:甘油＝1:1.2:1:1:0.8配置的保护液，菌泥与保护液比例1：10，乳化；将乳化液放入-80℃的超低温冰箱内，预冻3h。将上述预冻好的乳化液放入真空冷冻干燥机中，冻干条件为真空度0.2mba，冷阱温度为-55度，真空冷冻干燥30h，即得到酿酒酵母菌冻干粉，其活菌数为5.0×108cfu/g。实施例4全株青贮玉米的制备1)全株玉米的制备本发明所用玉米为青贮专用玉米，采用腊熟期的全株玉米，收获后将玉米粉碎至1～2cm小段。2)青贮发酵剂的制备复配发酵剂a：副干酪乳杆菌和布氏乳杆菌按照1：1(质量比)混合，1g菌粉溶解在100ml水中。复配发酵剂b:布氏乳杆菌和酿酒酵母k1按照1：0.5(质量比)混合，1g菌粉溶解在100ml水中。复配发酵剂c:副干酪乳杆菌和酿酒酵母k1按照1：0.5(质量比)混合，1g菌粉溶解在100ml水中。发酵剂d:酿酒酵母k1按照1g菌粉溶解在100ml水中。3)青贮发酵饲料的制备试验组：在青贮发酵窖池底层喷洒复配的发酵剂a，添加比例0.1％，与青贮饲料混合均匀后压实；在青贮发酵窖池表层部分喷洒复配的发酵剂b，添加比例0.1％，混合均匀后压实，覆盖塑料薄膜。对照组1：自然发酵。对照组2：全窖青贮玉米喷洒复配的发酵剂a，添加比例0.1％，与青贮饲料混合均匀后压实，覆盖塑料薄膜。对照组3：在青贮发酵窖池底层喷洒复配的发酵剂a，添加比例0.1％，与青贮饲料混合均匀后压实；在青贮发酵窖池表层部分喷洒复配的发酵剂c，添加比例0.1％，混合均匀后压实，覆盖塑料薄膜。对照组4：在青贮发酵窖池底层喷洒复配的发酵剂a，添加比例0.1％，与青贮饲料混合均匀后压实；在青贮发酵窖池表层部分喷洒复配的发酵剂d，添加比例0.1％，混合均匀后压实，覆盖塑料薄膜。具体见表4。表4青贮饲料实验组和对照发酵剂使用方法实施例5青贮饲料性质测定1)青贮发酵过程中ph变化将青贮发酵好的饲料样品混合均匀后取10g置于洗净的玻璃烧杯中，加蒸馏水90g，充分搅拌，静置后用纱布和滤纸过滤，使用ph计测量酸碱度。表5青贮过程中ph变化情况从青贮过程中可以看出，实验组ph在60天的实验期内一直呈现下降趋势，30d后下降速率减缓，呈现稳定趋势；不同的对照呈现不同的下降趋势，其中对照组1(自然青贮组)ph相对较高。2)青贮过程中表层霉菌数量评测青贮过程中由于表层处于有氧过程，霉菌等腐败菌容易生长，本发明测定实验组和对照青贮15d后窖池表层的霉菌数量。通过计数霉菌生长区块来评估青贮过程中表层霉菌的控制情况。霉菌面积小于0.01m2记为1个，当大于0.01m2小于0.05m2是记2个，大于0.05m2是记为3个，通过数值计算青贮表层霉菌污染情况。表6青贮过程中表层霉菌污染情况汇总通过计数青贮饲料表层霉菌数量，可以看出采用分层发酵，尤其是布氏乳杆菌和酿酒酵母复合组分配方，在控制青贮饲料霉变比对照组显著降低。3)有氧稳定性的变化有氧稳定性是指青贮饲料开封后，接触空气过程，颜色、品质的变化情况，有氧稳定性差，青贮饲料容易变质，不利用青贮饲料的使用。表7实验组和对照组青贮开封后有氧稳定性的影响从表7可以看出，相比于对照组，实验处理组从开封到开始升温的时间和从开始升温到变质的时间明显延长。实施例6青贮饲料的奶牛饲喂实验1)青贮饲料饲喂实验饲喂分为对照组和实验组，实验组采用青贮效果最好实验处理组即分层发酵时表层添加布氏乳杆菌和酿酒酵母，底层添加副干酪乳杆菌和布氏乳杆菌的青贮组，对照组采用自然青贮(对照组1)作为奶牛饲喂对照组。在饲喂7天后，收集奶牛全天的产奶量。对照组和实验组各安排7头处于产奶高峰期的奶牛，实验为期15天，计算均值。2)产奶量及主要成分表8奶牛产奶量及主要成分变化项目对照组试验组产奶量(kg/头·天)29.2±1.538.9±1.8蛋白含量(％)3.1±0.23.3±0.1脂肪含量(％)4.2±0.24.5±0.2乳糖(％)4.3±0.24.5±0.2从表8可以看出，饲喂实验处理过的青贮饲料，能够显著提高奶牛产奶量，每天增加30％以上的产奶量；同时对于牛奶品质也有所改善，蛋白含量和脂肪含量较对照组也有所增加。由此可见，本发明的青贮发酵剂及其生产工艺不但能够提高青贮饲料有氧稳定性、减少霉菌含量，还能提高奶牛产奶量，提高养殖效益。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12