本发明涉及甘薯的深加工领域，尤其是涉及一种甘薯叶抗氧化活性物质的制备方法。
技术背景
甘薯（学名：dioscoreaesculenta(lour.)burkill）：又名甜薯，旋花科薯蓣属缠绕草质藤本。地下块茎顶分枝末端膨大成卵球形的块茎，外皮淡黄色，光滑。茎左旋，基部有刺，被丁字形柔毛。单叶互生，阔心脏形；雄花序为穗状花序，单生，雄花无梗或具极短的梗；苞片卵形，顶端渐尖；花被浅杯状，被短柔毛；蒴果三棱形，顶端微凹，基部截形，每棱翅状；种子圆形，具翅。花期初夏。甘薯属喜光的短日照作物，性喜温，不耐寒，较耐旱。主要分布在北纬40°以南。栽培面积以亚洲最多，非洲次之，美洲居第3位。甘薯单叶互生，叶形可分为心脏、三角与掌状等，最大的叶片长达15厘米，宽17厘米，一般的长和宽不超过10厘米，叶缘分全缘、带齿、浅单缺刻、浅复缺刻和深复缺刻，顶端急尖，基部心形，基出脉9～13，被丁字形长柔毛，尤以背面较多；叶柄长5～8厘米，基部色分为紫、褐、绿色等，有刺。叶色有绿、浅绿和紫色等。叶片背面叶脉颜色，分淡红、红、紫、淡紫和绿色等。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种甘薯叶抗氧化活性物质的制备方法，本制备方法工艺简单，廉价环保，以酶解方式脱蛋白的效率较高，蛋白质脱除彻底，以药用活性炭粉末与t-亮氨酸叔丁酯联配脱色效果优异，同时又可大大降低多糖被活性炭吸附的量，提高终产物的含量与纯度。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种甘薯叶抗氧化活性物质的制备方法，包括：脱脂、提取、脱蛋白、脱色，具体包括以下步骤：
脱脂：选取健康、无腐、不黄的甘薯叶子，清洗干净后晾干，粉碎后过100～140目筛，加入甲醇于68～70℃回流4～5h进行脱脂，抽滤后取滤渣，自然挥干甲醇；按照料液比1:60～70加超纯水混合，在微波功率为420～450w、温度为60～63℃的条件下提取时间1～1.5h，取滤液即得甘薯叶溶液；以甲醇脱脂不仅大大提高甘薯叶溶液中抗氧化活性物质的含量，有利于其进一步的提取，还可以防止脂类物质对抗氧化物质的污染与降解；高料液比、微波辅助提取，不仅节约了能源，而且降低了提取液的黏度，叶中抗氧化活性物质向溶液扩散速度加快，对传质有利，利于提取；
提取：取甘薯叶溶液，设定超声频率30～35khz、功率350～400w、温度48～52℃的提取条件，每次提取25～30min，浸取三次后合并、蒸发、浓缩滤液；冷却后用无水乙醇稀释静置过夜，滤出沉淀，干燥后得甘薯叶活性物质粗品；超声波的空化效应可以大大强化甘薯叶溶液中组织的解离，可以加快多糖、多酚、黄酮、蛋白质等的扩散，以超声波辅助提取工艺稳定性好、操作简单、成本低、能耗少；
脱蛋白：将甘薯叶活性物质粗品按料液比1:20～22溶解于蒸馏水中，调节ph为6.5～7.0，先后加入3200～3600u/g木瓜蛋白酶、3800～4500u/g中性蛋白酶，再加入蛋白酶总重量1.2～1.3%的对羟基苯甲酸戊酯与1.8～2‰的(-)-金雀花碱，在48～50℃温度下酶解2.5～3h，酶解结束后沸水浴灭酶，12000～12500r/min离心处理10～15min，取上清液加入乙醇至体积分数达65～70%，静置过夜，离心，沉淀经冷冻干燥即得活性物质粗品；在木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的联合处理过程中，酶蛋白不断作用于蛋白质大分子，使大分子的蛋白分解成小分子的多肽甚至是氨基酸，经过处理，绝大部分游离蛋白质及部分与多糖结合的蛋白质被水解，因此蛋白质含量大大降低；然而随着体系中蛋白质含量的降低，酶分子与蛋白质分子的接触几率会逐渐变小，酶的催化作用也相应减弱，达到一定水解效果所需的时间也相应延长，而在水解过程中加入对羟基苯甲酸戊酯与(-)-金雀花碱则可以保持较高的水解效率，对羟基苯甲酸戊酯与(-)-金雀花碱会产生协同作用，二者协同作用于并活化木瓜蛋白酶活性中心半胱氨酸的硫基，从而降低木瓜蛋白酶与底物之间的能量壁垒，大大提高了木瓜蛋白酶的水解效率，降低了酶解时间，节约了能源损耗与时间成本；
脱色：将甘薯叶活性物质粗品溶解于100～120倍蒸馏水中，加入混合溶液1.05～1.2%的药用活性炭粉末与0.5～0.8‰的t-亮氨酸叔丁酯，其中t-亮氨酸叔丁酯中含有11.2～11.5%的l-t-亮氨酸叔丁酯；在28～32℃、3000～4500r/min条件下振荡混合8～10min，脱色完成后，以12500～13000r/min高速离心30～45min，取上清液即得脱色后的活性物质水溶液，经低温干燥后即得甘薯叶抗氧化活性物质；甘薯叶抗氧化活性物质中甘薯叶多糖含量为55～60%，多酚类含量为18.5～25.8%；药用活性炭粉末属于亲油性材料，利用活性炭粉末中的毛细管的表面吸附原理来吸附有机色素，可以达到较好的脱色、除浊效果，同时，毛细管的表面吸附作用会吸附部分的甘薯叶多糖类、多酚类等活性物质，多糖水溶液中的l-t-亮氨酸叔丁酯与d-t-亮氨酸叔丁酯可以与甘薯叶多糖、多酚形成共溶体系，通过一系列诸如氢键、团聚、吸附等作用可以大大降低多糖、多酚表面的极性、提高多糖、多酚的亲水性，使多糖、多酚与其聚集体远离活性炭的毛细管微孔，从而大大降低多糖、多酚被活性炭吸附的量，提高终产物薯叶抗氧化活性物质中的多糖、多酚类的含量；甘薯叶多糖多为富硫酸基多糖，其具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、消炎抗菌等功效，多酚类物质具有很强的抗氧化作用，因此甘薯叶活性物质可以作为一种新型的高效绿色营养品使用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1）水解脱蛋白过程中加入的对羟基苯甲酸戊酯与(-)-金雀花碱的协同作用可以活化木瓜蛋白酶活性中心半胱氨酸的硫基，从而降低酶与底物之间的能量壁垒，大大提高木瓜蛋白酶的水解效率，降低酶解时间，节约能源损耗与时间成本；
2）多糖水溶液中的l-t-亮氨酸叔丁酯与d-t-亮氨酸叔丁酯可以与甘薯叶多糖形成共溶体系，通过一系列诸如氢键、团聚、吸附等作用可以大大降低多糖、多酚的表面极性、提高亲水性，使多糖、多酚与其糖聚集体远离活性炭的毛细管微孔，从而大大降低多糖、多酚被活性炭吸附的量，提高终产物甘薯叶抗氧化活性物质中的多糖、多酚类的含量；
3）甘薯叶多糖多为富硫酸基多糖，其具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、消炎抗菌等功效，多酚类物质具有很强的抗氧化作用，因此甘薯叶活性物质可以作为一种新型的高效绿色营养品使用。
附图说明
图1是本发明实施例3中的活性物质对dpph自由基与羟自由基的清除结果示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种甘薯叶抗氧化活性物质的制备方法，包括以下步骤：
1）选取健康、无腐、不黄的甘薯叶子，清洗干净后晾干，粉碎后过100目筛，加入甲醇于68℃回流4h进行脱脂，抽滤后取滤渣，自然挥干甲醇；按照料液比1:60加超纯水混合，在微波功率为420w、温度为60℃的条件下提取时间1h，取滤液即得甘薯叶溶液；2）取甘薯叶溶液，设定超声频率30khz、功率350w、温度48℃的提取条件，每次提取25min，浸取三次后合并、蒸发、浓缩滤液；冷却后用无水乙醇稀释静置过夜，滤出沉淀，干燥后得甘薯叶活性物质粗品；3）将甘薯叶活性物质粗品按料液比1:20溶解于蒸馏水中，调节ph为6.5，先后加入3200u/g木瓜蛋白酶、3800u/g中性蛋白酶，再加入蛋白酶总重量1.2%的对羟基苯甲酸戊酯与1.8‰的(-)-金雀花碱，在48℃温度下酶解2.5h，酶解结束后沸水浴灭酶，12000r/min离心处理10min，取上清液加入乙醇至体积分数达65%，静置过夜，离心，沉淀经冷冻干燥即得活性物质粗品；4）将甘薯叶活性物质粗品溶解于100倍蒸馏水中，加入混合溶液1.05%的药用活性炭粉末与0.5‰的t-亮氨酸叔丁酯，其中t-亮氨酸叔丁酯中含有11.2%的l-t-亮氨酸叔丁酯；在28℃、3000r/min条件下振荡混合8min，脱色完成后，以12500r/min高速离心30min，取上清液即得脱色后的活性物质水溶液，经低温干燥后即得甘薯叶抗氧化活性物质；甘薯叶抗氧化活性物质中甘薯叶多糖含量为55～60%，多酚类含量为18.5～25.8%。
实施例2：
一种甘薯叶抗氧化活性物质的制备方法，包括以下步骤：
1）脱脂：选取健康、无腐、不黄的甘薯叶子，清洗干净后晾干，粉碎后过140目筛，加入甲醇于70℃回流5h进行脱脂，抽滤后取滤渣，自然挥干甲醇；按照料液比1:70加超纯水混合，在微波功率为450w、温度为63℃的条件下提取时间1.5h，取滤液即得甘薯叶溶液；以甲醇脱脂不仅大大提高甘薯叶溶液中抗氧化活性物质的含量，有利于其进一步的提取，还可以防止脂类物质对抗氧化物质的污染与降解；
2）提取：取甘薯叶溶液，设定超声频率35khz、功率400w、温度52℃的提取条件，每次提取30min，浸取三次后合并、蒸发、浓缩滤液；冷却后用无水乙醇稀释静置过夜，滤出沉淀，干燥后得甘薯叶活性物质粗品；超声波的空化效应可以大大强化甘薯叶溶液中组织的解离，可以加快多糖、多酚、黄酮、蛋白质等的扩散，以超声波辅助提取工艺稳定性好、操作简单、成本低、能耗少；
3）脱蛋白：将甘薯叶活性物质粗品按料液比1:22溶解于蒸馏水中，调节ph为7.0，先后加入3600u/g木瓜蛋白酶、3800～4500u/g中性蛋白酶，在50℃温度下酶解3h，酶解结束后沸水浴灭酶，12500r/min离心处理15min，取上清液加入乙醇至体积分数达70%，静置过夜，离心，沉淀经冷冻干燥即得活性物质粗品；在木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的联合处理过程中，酶蛋白不断作用于蛋白质大分子，使大分子的蛋白分解成小分子的多肽甚至是氨基酸，经过处理，绝大部分游离蛋白质及部分与多糖结合的蛋白质被水解，因此蛋白质含量大大降低；
4）脱色：将甘薯叶活性物质粗品溶解于120倍蒸馏水中，加入混合溶液1.2%的药用活性炭粉末，在32℃、4500r/min条件下振荡混合10min，脱色完成后，以13000r/min高速离心45min，取上清液即得脱色后的活性物质水溶液，经低温干燥后即得甘薯叶抗氧化活性物质；甘薯叶抗氧化活性物质中甘薯叶多糖含量为55～60%，多酚类含量为18.5～25.8%；药用活性炭粉末属于亲油性材料，利用活性炭粉末中的毛细管的表面吸附原理来吸附有机色素，可以达到较好的脱色、除浊效果，甘薯叶多糖多为富硫酸基多糖，其具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、消炎抗菌等功效，多酚类物质具有很强的抗氧化作用，因此甘薯叶活性物质可以作为一种新型的高效绿色营养品使用。
实施例3：
一种甘薯叶抗氧化活性物质的制备方法，包括：脱脂、提取、脱蛋白、脱色，具体包括以下步骤：
脱脂：选取健康、无腐、不黄的甘薯叶子，清洗干净后晾干，粉碎后过120目筛，加入甲醇于68℃回流4h进行脱脂，抽滤后取滤渣，自然挥干甲醇；按照料液比1:65加超纯水混合，在微波功率为440w、温度为62℃的条件下提取时间1h，取滤液即得甘薯叶溶液；以甲醇脱脂不仅大大提高甘薯叶溶液中抗氧化活性物质的含量，有利于其进一步的提取，还可以防止脂类物质对抗氧化物质的污染与降解；高料液比、微波辅助提取，不仅节约了能源，而且降低了提取液的黏度，叶中抗氧化活性物质向溶液扩散速度加快，对传质有利，利于提取；
提取：取甘薯叶溶液，设定超声频率33khz、功率360w、温度50℃的提取条件，每次提取25min，浸取三次后合并、蒸发、浓缩滤液；冷却后用无水乙醇稀释静置过夜，滤出沉淀，干燥后得甘薯叶活性物质粗品；超声波的空化效应可以大大强化甘薯叶溶液中组织的解离，可以加快多糖、多酚、黄酮、蛋白质等的扩散，以超声波辅助提取工艺稳定性好、操作简单、成本低、能耗少；
脱蛋白：将甘薯叶活性物质粗品按料液比1:21溶解于蒸馏水中，调节ph为6.8，先后加入3500u/g木瓜蛋白酶、4000u/g中性蛋白酶，再加入蛋白酶总重量1.2%的对羟基苯甲酸戊酯与2‰的(-)-金雀花碱，在50℃温度下酶解2.5h，酶解结束后沸水浴灭酶，12000r/min离心处理14min，取上清液加入乙醇至体积分数达68%，静置过夜，离心，沉淀经冷冻干燥即得活性物质粗品；在木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的联合处理过程中，酶蛋白不断作用于蛋白质大分子，使大分子的蛋白分解成小分子的多肽甚至是氨基酸，经过处理，绝大部分游离蛋白质及部分与多糖结合的蛋白质被水解，因此蛋白质含量大大降低；然而随着体系中蛋白质含量的降低，酶分子与蛋白质分子的接触几率会逐渐变小，酶的催化作用也相应减弱，达到一定水解效果所需的时间也相应延长，而在水解过程中加入对羟基苯甲酸戊酯与(-)-金雀花碱则可以保持较高的水解效率，对羟基苯甲酸戊酯与(-)-金雀花碱会产生协同作用，二者协同作用于并活化木瓜蛋白酶活性中心半胱氨酸的硫基，从而降低木瓜蛋白酶与底物之间的能量壁垒，大大提高了木瓜蛋白酶的水解效率，降低了酶解时间，节约了能源损耗与时间成本；
脱色：将甘薯叶活性物质粗品溶解于110倍蒸馏水中，加入混合溶液1.1%的药用活性炭粉末与0.6‰的t-亮氨酸叔丁酯，其中t-亮氨酸叔丁酯中含有11.4%的l-t-亮氨酸叔丁酯；在30℃、4000r/min条件下振荡混合8min，脱色完成后，以12500r/min高速离心40min，取上清液即得脱色后的活性物质水溶液，经低温干燥后即得甘薯叶抗氧化活性物质；甘薯叶抗氧化活性物质中甘薯叶多糖含量为55～60%，多酚类含量为18.5～25.8%；药用活性炭粉末属于亲油性材料，利用活性炭粉末中的毛细管的表面吸附原理来吸附有机色素，可以达到较好的脱色、除浊效果，同时，毛细管的表面吸附作用会吸附部分的甘薯叶多糖类、多酚类等活性物质，多糖水溶液中的l-t-亮氨酸叔丁酯与d-t-亮氨酸叔丁酯可以与甘薯叶多糖、多酚形成共溶体系，通过一系列诸如氢键、团聚、吸附等作用可以大大降低多糖、多酚表面的极性、提高多糖、多酚的亲水性，使多糖、多酚与其聚集体远离活性炭的毛细管微孔，从而大大降低多糖、多酚被活性炭吸附的量，提高终产物薯叶抗氧化活性物质中的多糖、多酚类的含量；甘薯叶多糖多为富硫酸基多糖，其具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、消炎抗菌等功效，多酚类物质具有很强的抗氧化作用，因此甘薯叶活性物质可以作为一种新型的高效绿色营养品使用。
实施例4：
选取实施例3中的甘薯叶抗氧化活性物质进行自由基清除率测定：
1）dpph自由基清除率测定：分别配制浓度为5mg/ml、10mg/ml、25mg/ml、50mg/ml的活性物质溶液各2.0ml，分部加入2.0ml0.04mg/mldpph溶液（无水乙醇作为溶剂），充分混匀后室温下避光反应30min，在波长517nm处测定其吸光度a1，同时测定无水乙醇（2.0ml）与dpph(2.0ml)混合液的吸光度ac，无水乙醇（2.0ml）和样品液(2.0ml)混合液的吸光度a2，在其他条件不变下，以vc替换活性物质作为阳性对照。则dpph自由基清除率计算公式为：
2）羟自由基清除率测定：取1ml的feso4溶液（10mmol/l）于试管中，加入1ml的水杨酸-乙醇溶液（10mmol/l），摇匀后加入1ml浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、25mg/ml、50mg/ml的活性物质溶液，最后加入8.8mmol/lh2o2溶液1ml启动反应，37℃，水浴1h，冷却至室温，在波长510nm测吸光度。在其他条件不变下，以vc替换活性物质作为阳性对照，则羟自由基清除率计算公式为：
式中：b1为蒸馏水代替活性物质做空白；b2为样品液；bc为蒸馏水代替h2o2的活性物质本底溶液。
dpph自由基与羟自由基清除率测定结果如图1所示，由图1可知，本发明的实施例3中的甘薯叶抗氧化活性物质对dpph自由基和羟自由基均具有较为明显的清除作用，同时其自由基清除率均呈现剂量依赖性。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。