一种酶解和糖基化协同改性制备功能性蛋清粉的工艺方法与流程

本发明涉及食品配料加工生产领域，具体的说是一种酶解和糖基化协同改性制备功能性蛋清粉的工艺方法。

背景技术：

我国的鸡蛋产量长期居于世界第一位，由于鸡蛋营养全面、价廉易得，因此，在人们的饮食结构中占有重要的地位。蛋清是鸡蛋中的重要组成部分，具有理想的乳化性和起泡性，鉴于该方面的功能特性使其对食品在制造、加工或保藏中的物理化学性质起着重要作用，因此广泛应用于食品加工的各个领域。蛋清中不含胆固醇，且包含40种不同的蛋白质，每一种对身体都有很大的好处。蛋清中还包含锌、铁、铜、磷、钙和钾等人体健康必需的矿物质。蛋清主要包含卵清蛋白，它在身体酶的新陈代谢中扮演重要的角色，并起到储存蛋白质的作用。另外，蛋清还包含维生素b6，b12，以及核黄素和叶酸。核黄素是身体细胞生长所必需的元素，而叶酸对维持心脏健康很重要。

另外鸡蛋里的蛋清蛋白质具有更好的营养价值，蛋清蛋白的功能性包括：溶解性、持水性、粘度、成胶性、弹性、乳化性以及起泡性等。这些功能特性在烘焙类食品中非常重要，比如应用在面包、饼干、曲奇、蛋糕、软糖及糖衣的生产中并对产品的外观及色泽进行改善。利用蛋清蛋白可以在制作面包和蛋糕的过程中增大面团的体积，在很多产品的制作中可以提高产品的水分含量。部分蛋清蛋白可以在全脂和低脂曲奇中改善产品的颜色、稠度以及咀嚼性。

鸡蛋清中含有的氨基酸，其组成与人体氨基酸组成近似，是良好的食品蛋白质，又因为其优良的凝胶性，保水性、起泡性等性能，所以被广泛应用于面类制品、鱼类制品及肉类制品等中。另外，利用蛋清可以制取溶菌酶，利用蛋清可以用于卵转铁蛋白的分离提取，鸡蛋清可以食用，药用（治疗体表炎症对早期疖肿外伤性肿胀和严重的局部注射反应，局部敷蛋清有止痛、消炎、防止化脓的作用）。

而事实证明，鸡蛋中的蛋白质并不能全部被利用，在食品应用中蛋清蛋白质的功能特性只展现了微小的一部分，这样既严重浪费了蛋白质资源，也相应增长了相关产品的制作成本。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种酶解和糖基化协同改性制备功能性蛋清粉的工艺方法，以提高鸡蛋清蛋白质的加工特性，并提高其蛋白质的利用率，制备出一种不易过敏，易吸收，腥味小，溶解性、发泡性和乳化性均良好的蛋清粉。

为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案为：一种酶解和糖基化协同改性制备功能性蛋清粉的工艺方法，包括以下步骤：

1）、取新鲜鸡蛋清，加水稀释成质量浓度为10%的蛋清液；

2）、将步骤1）中制得的蛋清液升温至45-55℃后，采用氢氧化钠溶液调节蛋清液的ph至7.0-8.0；

3）、向步骤2）中调节过ph值的蛋清液中加入复合蛋白酶进行酶解，制得高活性蛋清酶解液，高活性蛋清酶解液中的小分子肽抗氧化活性保持在28-32%；酶解温度为45-55℃，酶解时间为4-5h；在酶解过程中每25-35min对蛋清液进行震荡混匀，并在酶解过程中不间断的采用氢氧化钠溶液调节蛋清液的ph始终在7.5-8.0之间；

4）、将步骤3）中制得的高活性蛋清酶解液在加热至93-97℃并保温4-6min以使复合蛋白酶失去活性；

5）、将步骤4）中制得的蛋清酶解液冷却至3.5-4.5℃，用超滤膜滤除出分子量在2000-4000da的多肽后制备成小分子量的蛋清多肽液，小分子肽抗氧化活性保持在24-25%；

6）、将步骤5）制备的蛋清多肽液采用氢氧化钠溶液调节ph为8.5-9.0，温度保持在55-65℃，然后加入复合糖进行糖基化改性处理4-4.5h，得到反应液，糖基化程度为200mg/g-300mg/g。

7）、将步骤6）制备的反应液在-22--18℃、100-200pa条件下真空冷冻干燥成粉末，即得功能性蛋清粉成品。

优选的，所述步骤1）中的水为离子水或蒸馏水。

优选的，所述步骤3）中的复合蛋白酶包括质量比为1:2:1的碱性蛋白酶、胰蛋白酶以及风味蛋白酶。

优选的，所述步骤3）中复合蛋白酶的酶活性为7300-7700u/g。

优选的，所述步骤2）和步骤3）中使用的氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/l；所述步骤6）中使用的氢氧化钠溶液的浓度为0.5mol/l。

根据权利要求1所述的一种酶解和糖基化协同改性制备功能性蛋清粉的工艺方法，其特征在于：所述步骤6）中的复合糖包括质量比为1﹕1.5-2﹕1的甘露聚糖、壳聚糖以及半乳糖，复合糖在蛋清多肽液中的质量浓度为1.5%-2.5%。

优选的，在所述步骤6）中，将甘露聚糖、壳聚糖以及半乳糖按所述比例混合均匀后直接加入到蛋清多肽液中。

有益效果

本发明采用酶解以及糖基化相结合的方式对蛋清进行分解和改性处理，方法整体工艺简单，反应条件温和，周期短，成品品质好。酶解使蛋白质降解成了小肽结构，并通过超滤膜过滤出一定分子量区间的得小分子肽，使得到的蛋清粉更易溶解、消化。糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰过程。根据糖链和肽链的连接方式的不同，蛋白质的糖基化可分为n-糖基化和o-糖基化。n-糖基化作用可抑制蛋白酶对糖蛋白的降解，延长免疫分子的寿命。在mbl补体活化途径中，甘露聚糖结合的凝集素直接识别多种病原微生物表面的n-氨基半乳糖或甘露糖，进而依次活化和激活补体级联酶促反应的活化途径。o-糖基化的结构比n-糖基化简单，一般糖链较短，但是种类比n-糖基化多得多。肽链中可以糖基化的主要是ser和thr，此外还有酪氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸，连接的位点是这些残基侧链上的羟基氧原子。

酶解提高了蛋清粉的溶解度，糖基化提高了成品的乳化性和稳定性。两种方式相结合，通过符合蛋清本身物理特性的特定条件和工艺参数限制，制备出了一种营养价值髙，功能特性强，溶解度好的高品质蛋清粉。

本发明采用复合酶作为酶解时的酶源，相比采用单酶酶解，效果更佳，酶解效率更高，效果更彻底。蛋清酶解技术可使蛋白质部分降解，从而使其溶解性提高、粘度和热凝固性降低，并可促使呈味氨基酸或小肽释放，改善其风味，解决了常规蛋清粉腥味重的缺陷。此外，蛋白质酶解后产生的小肽比大分子蛋白质更易吸收，并能产生抗氧化、降血脂、降血压等生理活性小分子肽。因此，利用复合酶酶解技术对蛋清粉进行部分降解，制备出的蛋清粉既可满足焙烤食品加工业需求，又可提高原料利用率，改善食品蛋白质的功能特性和营养特性，因此易被人体消化，有益于人体健康。

本发明在糖基化步骤中具体采用ph为8.5-9，温度为55℃-65℃的反应条件，符合蛋清酶解液的整体物理学特性，能够促进反应的快速、完全进行。整个过程具有高效、安全的特点，且无其他添加剂，安全可靠，成本低，增加了蛋清的营养均衡性，拓宽了蛋清在食品加工中的应用范围，同时也降低了作为食品添加剂的蛋清粉的价格，因此在食品工业中具有重要的商业价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为通过本发明制备出的蛋清粉与常规蛋清粉的性能对比图；

图2为通过本发明制备出的蛋清粉与常规蛋清粉应用于制备相同食品后的感官性状对比图。

具体实施方式

本发明的一种酶解和糖基化协同改性制备功能性蛋清粉的工艺方法以鸡蛋清蛋白为对象先进行酶解，然后再对酶解液进行糖基化，包括以下步骤：

鸡蛋→清洗→蛋清分离→纱布过滤→蒸馏水稀释→调ph、温度→恒温酶解→小分子肽抗氧化活性检测→灭酶处理→酶解液→离心过滤→调ph、温度等→糖基化→糖基化改性程度测定→真空冷冻干燥制成成品。

本发明中的具体实施方式为：一种酶解和糖基化协同改性制备功能性蛋清粉的工艺方法，包括以下步骤：

1）、取新鲜鸡蛋清，加如离子水或蒸馏水稀释成质量浓度为10%的蛋清液；

2）、将步骤1）中制得的蛋清液升温至45-55℃后，采用氢氧化钠溶液调节蛋清液的ph至7.0-8.0；

3）、向步骤2）中调节过ph值的蛋清液中加入复合蛋白酶进行酶解，制得高活性蛋清酶解液，高活性蛋清酶解液中的小分子肽抗氧化活性保持在28-32%；酶解温度为45-55℃，酶解时间为4-5h，复合蛋白酶包括质量比为1:2:1的碱性蛋白酶、胰蛋白酶以及风味蛋白酶，复合蛋白酶的酶活性为7300-7700u/g。在酶解过程中每25-35min对蛋清液进行震荡混匀，并在酶解过程中不间断的采用氢氧化钠溶液调节蛋清液的ph始终在7.5-8.0之间；

4）、将步骤3）中制得的高活性蛋清酶解液在加热至93-97℃并保温4-6min以使复合蛋白酶失去活性；

5）、将步骤4）中制得的蛋清酶解液冷却至3.5-4.5℃，以3000r/min的转速对步骤4）中冷却后的酶解液进行离心处理15min，取上清液用超滤膜滤除分子量在2000-4000da的多肽后制备成小分子量的蛋清多肽液，小分子肽抗氧化活性保持在24-25%；

6）、将步骤5）制备的蛋清多肽液采用氢氧化钠溶液调节ph为8.5-9.0，温度保持在55-65℃，然后加入复合糖进行糖基化改性处理4-4.5h，得到反应液，糖基化程度为200mg/g-300mg/g。复合糖包括质量比为1﹕1.5-2﹕1的甘露聚糖、壳聚糖以及半乳糖，复合糖在蛋清多肽液中的质量浓度为1.5%-2.5%。在生产中，首先将甘露聚糖、壳聚糖以及半乳糖按所述比例混合均匀，然后直接加入到蛋清多肽液中。

7）、将步骤6）制备的反应液在-22--18℃、100-200pa条件下真空冷冻干燥成粉末，即得功能性蛋清粉成品。

本实施例中，所述步骤2）和步骤3）中使用的氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/l；所述步骤6）中使用的氢氧化钠溶液的浓度为0.5mol/l。

其中：步骤3）和5）中测量小分子肽抗氧化活性的方法为：

用无水乙醇配置0.1mmol/l的dpph溶液，避光保存。将2ml测试样品溶液及2mldpph溶液加入到同一试管中，摇匀，室温下暗处静置30min后测定其吸光度as，同时测定2mldpph溶液与2ml溶剂（蒸馏水或者相应的缓冲溶液）混合后的吸光度ac，以及2ml测试样品溶液与2ml无水乙醇混合后的吸光度ab。小分子肽抗氧化活性的表示如下：

小分子肽抗氧化活性（%）(1)

步骤6）中糖基化程度的检测方法为：

采用邻苯二甲醛(opa)法对蛋白中糖基化程度进行测定：opa试剂4ml于试管中，注入20010mg/ml样品液，混匀后于35℃反应2min，以opa试剂中加入200水为空白，在340nm波长处测定其吸光度。反应的糖基化程度(dg)按式(2)计算。

(2)

式中：at为t时刻样品的吸光度。a0为未反应样品的吸光度。

在众多的化学修饰方法中,本发明采用的糖基化反应过程中蛋白质与糖以共价键结合，无需使用催化剂，仅加热就可使其自发进行。而酶解是提高蛋清粉凝胶性比较理想的一种方法。主要优势在于改性后可以显著改善蛋白质的乳化性、溶解性、凝胶性、起泡性、热稳定性等，从而达到改变其功能特性的目的。因此改性蛋白质具有优良的溶解性能、发泡性能和乳化性能，使它在各类冷饮、奶糖和焙烤食品及化妆品中广泛应用，解决世界范围内的蛋白质缺乏危机提供了新途径。

本发明制得的改性后的蛋清粉与常规的未改性蛋清粉特性进行性能检测对比，其结果如图表1所示。

由图1可知：改性后的蛋清粉较未改性的蛋清粉其水溶性、起泡性、乳化性、保水性,并且不易过敏均有所不同程度的提高，表明改性后的蛋清粉功能特性有一定的改善，增加了蛋白质的利用范围。

将本发明制得的改性后的蛋清粉与常规的未改性蛋清粉分别用到食品中，其性能结果如图表2所示。

由图表2可知，通过酶解后糖基化改性的鸡蛋清蛋白应用在食品中，使食品的质地和口感都得到较大的提高，其原因是改性后的蛋清粉其结构发生了改变，使其功能特性也得到了改善。

下面以三个实施例对本发明的工艺方法进行进一步的阐述：

实施例一、一种酶解和糖基化协同改性制备功能性蛋清粉的工艺方法，包括以下步骤：

（1）选材：选择新鲜的鸡蛋。

（2）清洗：将鸡蛋表面清洗干净。

（3）测其水分含量及蛋白质含量：将鸡蛋清少量于培养皿置于干燥箱中一定时间，测其水分含量。并用半微量凯氏定氮法测其蛋白质含量。

（4）蛋清分离：将鸡蛋打开，分离蛋清与蛋黄，收集蛋清。

（5）蒸馏水稀释：用蒸馏水将鸡蛋清稀释为10%的蛋清液。

（6）调ph、温度：调节水浴锅的温度45℃，并用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调制鸡蛋清溶液的ph=7.0。

（7）恒温酶解：于鸡蛋清溶液中加入7300u/g的复合蛋白酶进行酶解，酶解过程中控制温度为45℃，每25min震荡混匀一次，酶解4h，并滴加氢氧化钠溶液使底物溶液的ph维持在7.5，将得到的肽液取2ml作为测试样品溶液及2mldpph溶液加入到同一试管中，摇匀，室温下暗处静置30min后测定其吸光度as，同时测定2mldpph溶液与2ml溶剂（蒸馏水或者相应的缓冲溶液）混合后的吸光度ac，以及2ml测试样品溶液与2ml无水乙醇混合后的吸光度ab。测得高活性蛋清酶解液中的小分子肽抗氧化活性为28%。

（8）灭酶处理：将酶解后的鸡蛋清溶液在93℃煮沸4min，使酶失去活性，灭酶静置后得到酶解液。

（9）离心过滤：将酶解液在3000/min的转速下离心15min。

（10）超滤：取上清液用超滤膜分离出分子量在2000~4000da的多肽。

（11）用无水乙醇配置0.1mmol/l的dpph溶液，避光保存。将步骤（10）得到的肽液作为样品。将2ml测试样品溶液及2mldpph溶液加入到同一试管中，摇匀，室温下暗处静置30min后测定其吸光度as，同时测定2mldpph溶液与2ml溶剂（蒸馏水或者相应的缓冲溶液）混合后的吸光度ac，以及2ml测试样品溶液与2ml无水乙醇混合后的吸光度ab。测得的小分子肽抗氧化活性为24%。

（12）调节ph、温度：调节水浴锅的温度为55℃，调节步骤（8）制得的酶解液的ph至8.5。

（13）糖基化：在酶解液中加入复合糖反应4h，得到反应液。

所述的复合糖的质量比为1：1.5：1的甘露聚糖、壳聚糖、半乳糖，复合糖加入后其在蛋清酶解液中的质量浓度为1.5%。

（14）糖基化程度测定：opa试齐4ml于试管中，注入20010mg/ml样品液，混匀后于35℃反应2min，以opa试剂中加入200水为空白，在340nm波长处测定其吸光度，测得其糖基化程度为250mg/g。

（15）将步骤（13）得到的反应液真空冷冻干燥成粉末，即为多功能蛋清粉成品。

实施例二、一种酶解和糖基化协同改性制备功能性蛋清粉的工艺方法，包括以下步骤：

（1）选材：选择新鲜的鸡蛋。

（2）清洗：将鸡蛋表面清洗干净。

（3）测其水分含量及蛋白质含量：将鸡蛋清少量于培养皿置于干燥箱中一定时间，测其水分含量。并用半微量凯氏定氮法测其蛋白质含量。

（4）蛋清分离：将鸡蛋打开，分离蛋清与蛋黄，收集蛋清。

（5）蒸馏水稀释：用蒸馏水将鸡蛋清稀释为10%的蛋清液。

（6）调ph、温度：调节水浴锅的温度50℃，并用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调制鸡蛋清溶液的ph=7.5。

（7）恒温酶解：于鸡蛋清溶液中加入7500u/g的复合蛋白酶进行酶解，酶解过程中控制温度为50℃，每30min震荡混匀一次，酶解4.5h，并滴加氢氧化钠溶液使底物溶液的ph维持在7.8，将得到的肽液取2ml作为测试样品溶液及2mldpph溶液加入到同一试管中，摇匀，室温下暗处静置30min后测定其吸光度as，同时测定2mldpph溶液与2ml溶剂（蒸馏水或者相应的缓冲溶液）混合后的吸光度ac，以及2ml测试样品溶液与2ml无水乙醇混合后的吸光度ab。测得高活性蛋清酶解液中的小分子肽抗氧化活性为30%。

（8）灭酶处理：将酶解后的鸡蛋清溶液在95℃煮沸5min，使酶失去活性，灭酶静置后得到酶解液。

（9）离心过滤：将酶解液在3000/min的转速下离心15min。

（10）超滤：取上清液用超滤膜分离出分子量在2000~4000da的多肽。

（11）用无水乙醇配置0.1mmol/l的dpph溶液，避光保存。将步骤（10）得到的肽液作为样品。将2ml测试样品溶液及2mldpph溶液加入到同一试管中，摇匀，室温下暗处静置30min后测定其吸光度as，同时测定2mldpph溶液与2ml溶剂（蒸馏水或者相应的缓冲溶液）混合后的吸光度ac，以及2ml测试样品溶液与2ml无水乙醇混合后的吸光度ab。测得的小分子肽抗氧化活性为24%。

（12）调节ph、温度：调节水浴锅的温度为60℃，调节步骤（8）制得的酶解液的ph至9.0。

（13）糖基化：在酶解液中加入复合糖反应4.2h，得到反应液。

所述的复合糖的质量比为1：1.8：1的甘露聚糖、壳聚糖、半乳糖，复合糖加入后其在蛋清酶解液中的质量浓度为2%。

（14）糖基化程度测定：opa试齐4ml于试管中，注入20010mg/ml样品液，混匀后于35℃反应2min，以opa试剂中加入200水为空白，在340nm波长处测定其吸光度，测得其糖基化程度为200mg/g。

（15）将步骤（13）得到的反应液真空冷冻干燥成粉末，即为多功能蛋清粉成品。

实施例三、一种酶解和糖基化协同改性制备功能性蛋清粉的工艺方法，包括以下步骤：

（1）选材：选择新鲜的鸡蛋。

（2）清洗：将鸡蛋表面清洗干净。

（3）测其水分含量及蛋白质含量：将鸡蛋清少量于培养皿置于干燥箱中一定时间，测其水分含量。并用半微量凯氏定氮法测其蛋白质含量。

（4）蛋清分离：将鸡蛋打开，分离蛋清与蛋黄，收集蛋清。

（5）蒸馏水稀释：用蒸馏水将鸡蛋清稀释为10%的蛋清液。

（6）调ph、温度：调节水浴锅的温度55℃，并用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调制鸡蛋清溶液的ph=8.0。

（7）恒温酶解：于鸡蛋清溶液中加入7700u/g的复合蛋白酶进行酶解，酶解过程中控制温度为55℃，每35min震荡混匀一次，酶解4.5h，并滴加氢氧化钠溶液使底物溶液的ph维持在8.0，将得到的肽液取2ml作为测试样品溶液及2mldpph溶液加入到同一试管中，摇匀，室温下暗处静置30min后测定其吸光度as，同时测定2mldpph溶液与2ml溶剂（蒸馏水或者相应的缓冲溶液）混合后的吸光度ac，以及2ml测试样品溶液与2ml无水乙醇混合后的吸光度ab。测得高活性蛋清酶解液中的小分子肽抗氧化活性为32%。

（8）灭酶处理：将酶解后的鸡蛋清溶液在97℃煮沸6min，使酶失去活性，灭酶静置后得到酶解液。

（9）离心过滤：将酶解液在3000/min的转速下离心15min。

（10）超滤：取上清液用超滤膜分离出分子量在2000~4000da的多肽。

（11）用无水乙醇配置0.1mmol/l的dpph溶液，避光保存。将步骤（10）得到的肽液作为样品。将2ml测试样品溶液及2mldpph溶液加入到同一试管中，摇匀，室温下暗处静置30min后测定其吸光度as，同时测定2mldpph溶液与2ml溶剂（蒸馏水或者相应的缓冲溶液）混合后的吸光度ac，以及2ml测试样品溶液与2ml无水乙醇混合后的吸光度ab。测得的小分子肽抗氧化活性为25%。

（12）调节ph、温度：调节水浴锅的温度为65℃，调节步骤（8）制得的酶解液的ph至9.0。

（13）糖基化：在酶解液中加入复合糖反应4.5h，得到反应液。

所述的复合糖的质量比为1：2：1的甘露聚糖、壳聚糖、半乳糖，复合糖加入后其在蛋清酶解液中的质量浓度为2.5%。

（14）糖基化程度测定：opa试齐4ml于试管中，注入20010mg/ml样品液，混匀后于35℃反应2min，以opa试剂中加入200水为空白，在340nm波长处测定其吸光度，测得其糖基化程度为300mg/g。

（15）将步骤（13）得到的反应液真空冷冻干燥成粉末，即为多功能蛋清粉成品。