本发明涉及一种分离水溶性膳食纤维和胶原蛋白的方法，具体涉及一种从罗汉果废液中分离水溶性膳食纤维和胶原蛋白的方法。
背景技术
罗汉果味甘性凉，归肺、大肠经，有润肺止咳，生津止渴的功效，适用于肺热或肺燥咳嗽，百日咳及暑热伤津口渴等，此外还有润肠通便的功效。现代医学研究证实，罗汉果含一种比蔗糖甜约400倍的天然甜味剂——罗汉果甜苷，但它不产生热量，所以是糖尿病、肥胖等不宜吃糖者的理想替代饮料，因此，在罗汉果生产中，以提取和分离罗汉果中的甜苷为主，而把其它成分当成废弃物或废水处理，不仅造成了资源浪费，由此产生的污染问题也制约了整个罗汉果产业的发展。但是，除罗汉果甜苷以外，罗汉果中还含有大量的营养成分，比如，低聚果糖、果胶、纤维素、十多种人体必需氨基酸、脂肪酸、黄酮类化合物、维生素c、微量元素等。
罗汉果中的低聚果糖、果胶等构成了其特有的水溶性膳食纤维成分。膳食纤维是一种多糖，它既不能被胃肠道消化吸收，也不能产生能量。因此，曾一度被认为是一种“无营养物质”而长期得不到足够的重视。然而，随着营养学和相关科学的深入发展，人们逐渐发现了膳食纤维具有相当重要的生理作用。在膳食构成越来越精细的今天，膳食纤维更成为学术界和普通百姓关注的物质，并被营养学界补充认定为第七类营养素，和传统的六类营养素——蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质与水并列。
cn107033209a公开了一种同时提取无农残罗汉果甜苷和水溶性膳食纤维的方法，是通过榨汁提取、煮沸、层析、超滤、纳滤、浓缩等步骤，得到罗汉果甜苷和水溶性膳食纤维，但是，该方法在获得产品的同时，已将罗汉果中的蛋白质除去；cn106617115a公开了从罗汉果生产废液中分离可溶性膳食纤维的方法，是通过絮凝、脱盐、脱色、浓缩干燥等步骤，得到罗汉果可溶性膳食纤维，同样，该方法也将罗汉果中的蛋白质除去。因此，虽然上述两个方法都提取出了可溶性膳食纤维，但同时也把罗汉果中丰富的蛋白质当成杂质除去，并没有加以利用，也没有将罗汉果资源的综合利用做到极致。
纳米胶原蛋白，即纳米级别大小的胶原蛋白，其分子量非常小，一般为300～650道尔顿，多为二肽到四肽，生物活性、吸收利用率、效用时间和作用远优于其它大型胶原蛋白。现在已经有大量的化妆品、保健品开始用纳米胶原替代原大型胶原蛋白或明胶等。纳米胶原蛋白修复效果好，吸收率超高的特性，已经被广泛用于各种专业领域，例如术后护理等。而罗汉果含丰富的蛋白质，蛋白质在罗汉果干物质中所占的比例为7.1～7.8%；在其水解物中，除色氨酸未被测定外，18种氨基酸齐全。在测定的氨基酸中，含量较高的有谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、丙氨酸（49.9～66.8mg/kg）、亮氨酸。谷氨酸是人体中需要量最大的非必需氨基酸，是合成谷胱甘肽的重要原料，可见，罗汉果具有较高的营养价值。罗汉果中的天然蛋白质由于氨基酸种类齐全、肽链短、空间结构类似等原因，为纳米胶原蛋白的生产提供了有利条件。但是，纳米胶原蛋白的提纯技术难度极高，对生产企业的工艺要求和研发实力，都有较高的门槛要求。目前，获得纳米胶原蛋白的主要方法是萃取法，但是该方法中的提纯技术和萃取技术的设备成本高昂、操作要求极高，由于纳米胶原蛋白的提纯技术是全球生物领域的前沿科技，截止目前拥有制备纳米级胶原蛋白的企业屈指可数。
目前，随着我国罗汉果提取物行业迅猛的发展，罗汉果资源的综合利用迫在眉睫，亟待找到一种从罗汉果废液中分离水溶性膳食纤维和纳米胶原蛋白的方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种所得水溶性膳食纤维和纳米胶原蛋白产品质量含量、收率高，工艺过程可操作性强，成本低，零污染，适宜于工业化生产的从罗汉果废液中分离水溶性膳食纤维和胶原蛋白的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：从罗汉果废液中分离水溶性膳食纤维和胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）酶解：调节罗汉果生产废液ph值至中性，加入蛋白酶制剂，加热保温酶解，得酶解液；
（2）超滤：将步骤（1）所得酶解液用超滤膜过滤，收集超滤膜透过液；
（3）水溶性膳食纤维的分离：将步骤（2）所得超滤膜透过液，上葡聚糖凝胶层析柱进行层析，收集流出液，减压浓缩，浓缩液干燥，得水溶性膳食纤维；
（4）纳米胶原蛋白的分离：将步骤（3）收集流出液后的葡聚糖凝胶层析柱，用洗脱剂进行洗脱，洗脱液用纳滤膜过滤，收集纳滤膜截留液，减压浓缩，浓缩液冷冻干燥，得纳米胶原蛋白。
优选地，步骤（1）中，所述罗汉果生产废液是指大孔吸附树脂吸附罗汉果水提取液中甜苷之后的层析流出液。
优选地，步骤（1）中，所述罗汉果生产废液中，总固含量为6～10%，其中，水溶性膳食纤维的含量占总固含量的百分含量为20～70%，总蛋白的含量占总固含量的百分含量为10～50%，水溶性膳食纤维的含量与总蛋白的含量之和占总固含量的百分含量≤100%。
优选地，步骤（1）中，调节罗汉果生产废液ph值至7。调节ph值的目的，一是，满足蛋白酶酶解的最佳ph值条件，二是，中和罗汉果生产废液中的酸。若ph值过高或过低，都不利于蛋白酶酶解蛋白质。
优选地，步骤（1）中，所述蛋白酶制剂的用量为罗汉果生产废液固含量的1～5‰。酶解的目的是将罗汉果生产废液中的植物蛋白分解成小分子的纳米胶原蛋白；若蛋白酶的用量过少，将难以充分酶解蛋白质；若蛋白酶的用量过多，将造成物料的浪费。
优选地，步骤（1）中，所述蛋白酶制剂为中性蛋白酶制剂。
优选地，步骤（1）中，所述加热保温酶解的温度为45～55℃，时间为1～2h。若酶解温度过高或过低，都不利于蛋白酶酶解蛋白质。
优选地，步骤（2）中，所述超滤膜的截留分子量为8000～30000da。超滤的目的是除去酶解液中的淀粉、蛋白酶等分子量大的物质；若超滤膜截留分子量过小，部分膳食纤维、纳米胶原蛋白将难以透过超滤膜，影响进入后续步骤的量，造成膳食纤维、纳米胶原蛋白的收率偏低；若超滤膜截留分子量过大，大分子量的杂质将透过超滤膜进入透过液，进入后续步骤而无法分离，将影响葡聚糖凝胶层析柱的分离效果。
优选地，步骤（2）中，所述过滤的压力为0.5～1.2mpa。
优选地，步骤（3）中，所述葡聚糖凝胶与超滤膜透过液中有机物干重的体积质量比为20～50:1。葡聚糖凝胶层析的目的是吸附超滤膜透过液中的纳米胶原蛋白；若葡聚糖凝胶的用量过少，则纳米胶原蛋白的吸附不彻底；若葡聚糖凝胶的用量过多，则易造成物料的浪费。
优选地，步骤（3）中，所述葡聚糖凝胶的类型为sephadexg-10、sephadexg-15、sephadexg-25或sephadexg-50等中的一种或几种。葡聚糖凝胶层析的分离原理为分子筛机制，葡聚糖凝胶表面分布着不同尺寸的孔径，不同的有机物分子进入葡聚糖凝胶层析柱后，它们中的不同组分按其大小进入相应的孔径内；本发明罗汉果生产废液中，由于膳食纤维的分子大于葡聚糖凝胶的所有孔径，因此，不能进入葡聚糖凝胶颗粒内部，在层析过程中不被保留，直接流出至柱外；而由于纳米胶原蛋白分子小于所有孔径，因此，能自由进入葡聚糖凝胶颗粒内部，在层析过程中保留的时间长，最后在洗脱剂的作用下被集中洗脱，从而将两者分离、富集。
优选地，步骤（3）中，上柱的流速为0.1～1.0bv/h。
优选地，步骤（3）中，所述葡聚糖凝胶层析柱的高径比为5～10:1。若葡聚糖凝胶层析柱的高径比过小或流速过快，纳米胶原蛋白都将难以充分吸附；若葡聚糖凝胶层析柱的高径比过大或流速过小，都将延长生产的周期并增加生产的成本。
优选地，步骤（3）中，所述减压浓缩的真空度为-0.07～-0.09mpa，温度为60～80℃，浓缩至固含量为25～50%（更优选30～40%）。
优选地，步骤（3）中，所述干燥为微波干燥，微波干燥的频率为2400～2500mhz，真空度为-0.08～-0.09mpa，时间为1～3h。使用微波干燥的目的是防止水溶性膳食纤维在干燥过程中吸潮。
优选地，步骤（4）中，所述洗脱的流速为0.5～2.0bv/h。本发明方法利用葡聚糖凝胶的特性，采用分子筛法，将特定分子量范围内的纳米胶原蛋白“筛选”出来。
优选地，步骤（4）中，所述洗脱剂的用量为2～5bv。
优选地，步骤（4）中，所述洗脱剂为质量浓度为0.1～1.0%（更优选0.4～0.8%）的氯化盐水溶液。若洗脱剂的浓度过低或用量过少，都将导致纳米胶原蛋白洗脱不彻底；若洗脱剂的浓度过高或用量过多，都将导致物料的浪费，并加大后续除盐步骤的处理量和处理难度。
优选地，步骤（4）中，所述氯化盐为氯化钠和/或氯化钾。使用氯化钠或氯化钾的水溶液作为洗脱剂的目的是防止纳米胶原蛋白在洗脱过程中变性。
优选地，步骤（4）中，所述纳滤膜的截留分子量为500～1000da。纳滤的目的是除去洗脱液中的盐、氨基酸及其它小分子杂质，提高纳米胶原蛋白的纯度。
优选地，步骤（4）中，所述过滤的压力为0.5～3.0mpa。
优选地，步骤（4）中，所述减压浓缩的真空度为-0.07～-0.09mpa，温度为60～80℃，浓缩至固含量为25～50%。
优选地，步骤（4）中，所述冷冻干燥的温度为-40～-10℃，时间为1～5h。使用冷冻干燥的目的是防止纳米胶原蛋白在干燥过程中受热分解，保持其生物活性。
本发明方法的有益效果如下：
（1）本发明方法提供了一种全新的从罗汉果废液中分离水溶性膳食纤维和胶原蛋白的方法，所得罗汉果水溶性膳食纤维产品质量含量高达97%，收率高达95.1%，所得罗汉果纳米胶原蛋白产品的纯度高达92%，总蛋白回收率高达90.0%；
（2）本发明方法工艺过程可操作性强，成本低，适宜于工业化生产，不仅实现了变废为宝，将罗汉果资源综合利用，创造可观的经济效益，还解决了环境污染的问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的罗汉果生产废液为大孔吸附树脂吸附罗汉果水提取液中甜苷之后的层析流出液，总固含量为6.9%，其中，水溶性膳食纤维的含量占总固含量的42.5%，总蛋白的含量占总固形物的31.2%；本发明实施例所使用的中性蛋白酶制剂购于南宁庞博生物工程有限公司；本发明实施例所使用的sephadexg-25型葡聚糖凝胶、sephadexg-15型葡聚糖凝胶和sephadexg-50型葡聚糖凝胶均购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明实施例中，采用分光光度法检测超滤膜透过液中的有机物含量，采用酶重量法-液相色谱法检测罗汉果水溶性膳食纤维的含量，采用凯氏定氮法检测总蛋白和纳米胶原蛋白的含量。
实施例1
（1）酶解：调节200kg罗汉果生产废液ph值至7，加入60g中性蛋白酶制剂，在50℃下，加热保温酶解1.5h，得酶解液；
（2）超滤：将步骤（1）所得酶解液用截留分子量为10000da的超滤膜，在0.6mpa下，过滤，收集超滤膜透过液190kg（有机物含量为6.30%）；
（3）水溶性膳食纤维的分离：将步骤（2）所得190kg超滤膜透过液，以流速0.5bv/h，上葡聚糖凝胶层析柱（sephadexg-25型葡聚糖凝胶，凝胶体积为350l，高径比为10:1）进行层析，收集流出液，在真空度为-0.08mpa，70℃下，减压浓缩至固含量为30%，浓缩液在频率为2450mhz，真空度为-0.09mpa下，微波干燥2.5h，得水溶性膳食纤维5.6kg；
（4）纳米胶原蛋白的分离：将步骤（3）收集流出液后的葡聚糖凝胶层析柱，用1000l（即2.86bv），质量浓度为0.5%的氯化钠水溶液，以流速1bv/h，进行洗脱，洗脱液用截留分子量为800da的纳滤膜，在2.0mpa下，过滤，收集纳滤膜截留液，在真空度为-0.09mpa，65℃下，减压浓缩至固含量为30%，浓缩液在-20℃下，冷冻干燥1.5h，得纳米胶原蛋白4kg。
经酶重量法-液相色谱法检测，本实施例所得水溶性膳食纤维的质量含量为96.5%，水溶性膳食纤维的收率为92.1%；经凯氏定氮法检测，本实施例所得纳米胶原蛋白的纯度为90.8%，总蛋白的回收率为84.4%。
实施例2
（1）酶解：调节300kg罗汉果生产废液ph值至7，加入80g中性蛋白酶制剂，在55℃下，加热保温酶解1h，得酶解液；
（2）超滤：将步骤（1）所得酶解液用截留分子量为15000da的超滤膜，在1.0mpa下，过滤，收集超滤膜透过液280kg（有机物含量为6.25%）；
（3）水溶性膳食纤维的分离：将步骤（2）所得280kg超滤膜透过液，以流速0.3bv/h，上葡聚糖凝胶层析柱（sephadexg-15型葡聚糖凝胶，凝胶体积为800l，高径比为8:1）进行层析，收集流出液，在真空度为-0.07mpa，80℃下，减压浓缩至固含量为35%，浓缩液在频率为2400mhz，真空度为-0.08mpa下，微波干燥2h，得水溶性膳食纤维9kg；
（4）纳米胶原蛋白的分离：将步骤（3）收集流出液后的葡聚糖凝胶层析柱，用1600l（即2bv），质量浓度为0.7%的氯化钾水溶液，以流速0.5bv/h，进行洗脱，洗脱液用截留分子量为500da的纳滤膜，在3.0mpa下，过滤，收集纳滤膜截留液，在真空度为-0.08mpa，70℃下，减压浓缩至固含量为25%，浓缩液在-10℃下，冷冻干燥2h，得纳米胶原蛋白6.53kg。
经酶重量法-液相色谱法检测，本实施例所得水溶性膳食纤维的质量含量为93%，水溶性膳食纤维的收率为95.1%；经凯氏定氮法检测，本实施例所得纳米胶原蛋白的纯度为89%，总蛋白的回收率为90.0%。
实施例3
（1）酶解：调节100kg罗汉果生产废液ph值至7，加入20g中性蛋白酶制剂，在45℃下，加热保温酶解2h，得酶解液；
（2）超滤：将步骤（1）所得酶解液用截留分子量为25000da的超滤膜，在0.8mpa下，过滤，收集超滤膜透过液95kg（有机物含量为6.50%）；
（3）水溶性膳食纤维的分离：将步骤（2）所得95kg超滤膜透过液，以流速0.1bv/h，上葡聚糖凝胶层析柱（sephadexg-50型葡聚糖凝胶，凝胶体积为300l，高径比为5:1）进行层析，收集流出液，在真空度为-0.09mpa，60℃下，减压浓缩至固含量为35%，浓缩液在频率为2500mhz，真空度为-0.09mpa下，微波干燥1.5h，得水溶性膳食纤维2.73kg；
（4）纳米胶原蛋白的分离：将步骤（3）收集流出液后的葡聚糖凝胶层析柱，用900l（即3bv），质量浓度为0.5%的氯化钠水溶液，以流速1.5bv/h，进行洗脱，洗脱液用截留分子量为1000da的纳滤膜，在1.0mpa下，过滤，收集纳滤膜截留液，在真空度为-0.08mpa，75℃下，减压浓缩至固含量为40%，浓缩液在-25℃下，冷冻干燥2.5h，得纳米胶原蛋白1.94kg。
经酶重量法-液相色谱法检测，本实施例所得水溶性膳食纤维的质量含量为97%，水溶性膳食纤维的收率为90.3%；经凯氏定氮法检测，本实施例所得纳米胶原蛋白的纯度为92%，总蛋白的回收率为82.9%。