本发明涉及一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂及其制备方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
黄曲霉毒素（aflatoxion，aft）是黄曲霉(aspergillusflavus)与寄生曲霉（aspergillusparasiticus）产生的次级代谢产物，是一类具有二氢呋喃杂氧萘环结构的衍生物的总称，常见的有afb1、afb2、afg1、afg2、afm1、afm2、afb2a、afgx、afbm2a、afgm2a等几种。这类毒素因含有大环共轭体系，稳定性非常好，分解温度高达280℃。在各种黄曲霉毒素中，以afb1存在最多，致突变性最强，通常所说的aft即是指afb1。在各类食品中aft污染极其常见，具有较强的致癌性、基因毒性、皮肤毒性、致畸性、肾毒性及肝毒性。在我国，谷物、饲料、食品等黄曲霉毒素的感染状况较为严重，对河南、山东、湖北、安徽4省的调查发现饲料中曲霉菌检出率为75.5%，而在全国28个省市区的调查，谷物、饲料中共分离鉴定出73种霉菌，其中检出率最高的是曲霉属，为100%。
黄曲霉毒素去毒方法包括氨化法、碱法、高温法、氧化法和吸附法等，这些方法处理不稳定、营养成分破坏较大，降低感官品质，黄曲霉毒素容易恢复毒性，难以规模化生产。生物酶解毒能够维持被污染物的营养特性，且具有催化条件温和，作用机制明确，专一性强和转化效率高的特点。但是对于黄曲霉毒素，目前尚未找到能完全降解该毒素的菌株或物质，且用生物学方法降解黄曲霉毒素的实际生产应用少，鲜有关于生物酶降解黄曲霉毒素的报道。因此，需要高表达与黄曲霉毒素解毒相关酶量，开发出高活性、高纯度及复合型的新型解毒酶，是解决黄曲霉毒素污染的重要策略。
通过生物酶处理法对黄曲霉毒素进行脱毒后，不会破坏原有产品的品质，而且可能增加产品的营养价值，具有巨大的应用潜力，但是，目前现有的生物去毒法技术采用酶成分较单一，黄曲霉毒素属于脂溶性，属于水溶性的单一黄曲霉毒素分解酶与黄曲霉毒素结合效率低；单一黄曲霉毒素分解酶的作用机制虽明确，但是黄曲霉毒素分解酶在处理过程中容易被体系中物质吸附，损耗大，且分离纯化黄曲霉毒素分解酶的难度大，成本高，难以规模化实际生产。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂及其制备方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂的制备方法，包括下列步骤：
第一步：在无菌环境中，挑取保藏状态下的黄孢原毛平革菌、污叉丝孔菌、云芝、密黏褶菌，分别接种于种子培养基，然后在温度28-32℃、转速150-280rpm的条件下，培养30-60h，获得黄孢原毛平革菌基础菌种、污叉丝孔菌基础菌种、云芝基础菌种和密黏褶菌基础菌种；
第二步：在无菌环境中，将所述黄孢原毛平革菌基础菌种、污叉丝孔菌基础菌种、云芝基础菌种和密黏褶菌基础菌种，按体积比1：20-30分别转接到新的种子培养基，在温度28-32℃、转速150-280rpm的条件下，培养30-50h，获得黄孢原毛平革菌发酵菌种、污叉丝孔菌发酵菌种、云芝发酵菌种、密黏褶菌发酵菌种；
第三步：在无菌环境中，将所述黄孢原毛平革菌发酵菌种、污叉丝孔菌发酵菌种、云芝发酵菌种、密黏褶菌发酵菌种，按体积比100：20-30：10-15：10-20进行混合，获得混合发酵菌种；
第四步：将所述混合发酵菌种接种到固体发酵培养基上，然后在相对湿度50-90%、温度28-37℃环境中，发酵24-48h，接着保持环境条件不变，翻堆一次，继续发酵24-48h，获得发酵成品；
第五步：将所述发酵成品与ph值为3-6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按照体积比1：1-2.8混合后，过滤得到滤液；
第六步：对第五步所得滤液进行超滤浓缩得到浓缩液；
第七步：对第六步所得浓缩液进行喷雾干燥，得到的粉末即为用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂产品。
优选的技术方案为：所述固体发酵培养基的制备方法包括下列步骤：
（1）将椴木粉碎成直径1-10mm的颗粒，在自然干燥条件下放置1-3年，获得椴木粉；
（2）将椴木粉、麸皮、草木灰、长度为1-5mm的玉米秸秆粉、几丁质、纤维二糖、壳聚糖按照质量比100:1-15:0.01-1:1-10:0.5-2:0.5-1:1-2混合均匀，获得混合基质；
（3）将盐溶液与混合基质按照体积质量比1：0.5-3进行混合，灭菌后得到固体发酵培养基；所述盐溶液由10-20克的硫酸铵、10~30克的磷酸氢二钾和0.5-1克的硫酸锰溶于1升水中制得。
优选的技术方案为：所述种子培养基的制备方法包括下列步骤：
（1）将椴木粉碎成直径1-10mm的颗粒，在自然干燥条件下放置1-3年，获得椴木粉；
（2）将椴木粉与质量分数为0.05-0.1%的氢氧化钠溶液按照质量体积比1：50-100的比例混合，20-35℃条件下浸泡12-24小时，然后过滤收集滤液，接着调节ph值至6-8，获得发酵诱导液；
（3）向每升所述发酵诱导液中添加10-20克的磷酸氢二钾、1-10克的氯化钠、0.1-1克的硫酸锰、10-20克的酵母粉，灭菌后即得种子培养基。
优选的技术方案为：在第四步中，混合发酵菌种的接种量为固体发酵培养基的质量的5-15%。
优选的技术方案为：在第五步中，采用板框压滤机压滤，板框压滤机中涤纶长纤滤布的型号为60-10（240），操作压力0.5-1.0mpa。
优选的技术方案为：在第六步中，超滤浓缩采用的超滤膜为改性聚砜超滤膜，孔径40-60μm，孔密度6×109-7×109孔/cm2，皮层厚度为6-10μm，支撑层厚度为80-100μm。
优选的技术方案为：在第七步中，喷雾干燥的进风温度为165-170℃，排风温度为80-85℃，收集器内温度为45-48℃，雾化器转速为15000-17000rpm。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂，采用上述制备方法制得。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、本发明综合四种微生物表达胞外酶的酶学特征，配制固体发酵培养基，诱导发酵，获得胞外复合酶制剂产品，制备出分解黄曲霉毒素的复合酶制剂产品具有成本较低，安全性好，催化效率较高的特点，可有效分解陈化粮乙醇发酵后的醪液中的黄曲霉毒素，广泛应用于动物饲料工业和食品工业等领域中的黄曲霉毒素脱除。
2、本发明采用的椴木粉富含木质素，能够高效率诱导黄曲霉毒素分解相关酶的表达；本发明获得的复合酶制剂产品含有多种物种来源的黄曲霉毒素分解酶，木质素过氧化物酶，漆酶、脂肪酶，蛋白酶，木质纤维素降解酶系等，能够将吸附于脂肪、纤维素、淀粉、蛋白和其他物质中的黄曲霉毒素游离出，为黄曲霉毒素分解酶等酶结合和高效催化，提供良好的前提条件。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例一：一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂及其制备方法
一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂及其制备方法，发酵菌种为黄孢原毛平革菌、污叉丝孔菌、云芝、密黏褶菌的混合菌种，通过固体发酵代谢产生具有脱除黄曲霉毒素功能的复合胞外酶，使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浸泡固体发酵成品，经过压滤、超滤浓缩、喷雾干燥，得到复合酶制剂产品。
黄孢原毛平革菌，为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏菌种黄孢原毛平革菌phanerochaetechrysosporiumcgmcc3.7212；污叉丝孔菌，为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏菌种污叉丝孔菌dichomitussqualenscgmcc5.82；云芝，为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏菌种云芝trametesversicolor5.1500；密黏褶菌，为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏菌种密黏褶菌gloeophyllumtrabeumaccc51714。
一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂及其制备方法，其特征在于，包括以下技术步骤。
（1）制备固体发酵培养基。
将椴木粉碎成直径10mm的颗粒，在自然干燥条件下放置3年，获得椴木粉；将椴木粉、麸皮、草木灰、长度为5mm的玉米秸秆粉、几丁质、纤维二糖、壳聚糖按照质量比100:15:1:10:2:1:2均匀混合，获得混合基质；配制含2%硫酸铵（w/v），3%磷酸氢二钾（w/v）和0.1%硫酸锰（w/v）的盐溶液，即1升水中溶解有20克的硫酸铵、30克的磷酸氢二钾、1克的硫酸锰，制得盐溶液，将盐溶液与混合基质按照体积质量比1:3进行混合，121℃蒸汽湿热杀菌20min，无菌降温后得到固体发酵培养基，备用。
（2）制备混合发酵菌种。
制备种子培养基。配制质量分数0.1%的氢氧化钠溶液；将椴木粉与氢氧化钠溶液按照质量体积比1:100混合，35℃条件下浸泡24小时，60目过滤，收集滤液，用磷酸调酸碱度至ph8，获得发酵诱导液；在发酵诱导液中，按照质量体积比分别添加2%磷酸氢二钾、1%氯化钠、0.1%硫酸锰、2%酵母粉，121℃蒸汽湿热杀菌20min，无菌降温后得到种子培养基，备用。
获得液体基础菌种。在无菌环境中，分别挑取保藏状态下的黄孢原毛平革菌、污叉丝孔菌、云芝、密黏褶菌，接种于种子培养基，温度32℃、转速280rpm，培养60h，获得基础菌种。转速是指摇床转速。
获得发酵菌种。在无菌环境中，将各个基础菌种，分别按体积比1:30转接到种子培养基，温度32℃、转速280rpm，培养50h，获得各菌种的发酵菌种。
将黄孢原毛平革菌、污叉丝孔菌、云芝、密黏褶菌的发酵菌种，在无菌环境中，按体积比100:30:15:20进行混合，获得混合发酵菌种。
（3）混合菌种固体发酵。
将混合发酵菌种按照质量比15%，接种到固体发酵培养基上，均匀混合，在湿度90%、温度37℃环境中，发酵48h；保持环境条件不变，翻堆一次，继续发酵48h，获得发酵成品。
（4）制取酶制剂。
板框压滤。将0.1mol/l柠檬酸和0.1mol/l柠檬酸钠混合，配制成ph6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。将发酵成品与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按照体积比1:2.8混合后，采用板框压滤机压滤，压滤机中涤纶长纤滤布为60-10(240)型号，操作压力1.0mpa。
超滤浓缩。将板框压滤后的滤液，进行超滤浓缩处理。超滤膜为改性聚砜超滤膜，孔径60μm，孔密度7×109孔/cm2，皮层厚度10μm，支撑层厚度100μm。
喷雾干燥。超滤浓缩后的浓缩液，采用喷雾干燥处理。喷雾干燥的进风温度为170℃，排风温度为85℃，收集器内温度为48℃，雾化器转速为17000rpm，喷雾干燥得到的固体产物即为用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂产品。
一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂及其制备方法，所述的复合酶制剂可应用于陈化粮乙醇发酵蒸馏后醪液的黄曲霉毒素脱毒，并可用于花生及其制品、食用油、油料饼粕及饲料领域的黄曲霉毒素脱毒。
实施例二：一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂及其制备方法
一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂的制备方法，包括下列步骤：
第一步：在无菌环境中，挑取保藏状态下的黄孢原毛平革菌、污叉丝孔菌、云芝、密黏褶菌，分别接种于种子培养基，然后在温度28℃、转速150rpm的条件下，培养30h，获得黄孢原毛平革菌基础菌种、污叉丝孔菌基础菌种、云芝基础菌种和密黏褶菌基础菌种；
第二步：在无菌环境中，将所述黄孢原毛平革菌基础菌种、污叉丝孔菌基础菌种、云芝基础菌种和密黏褶菌基础菌种，按体积比1：20分别转接到新的种子培养基，在温度28℃、转速150rpm的条件下，培养30h，获得黄孢原毛平革菌发酵菌种、污叉丝孔菌发酵菌种、云芝发酵菌种、密黏褶菌发酵菌种；
第三步：在无菌环境中，将所述黄孢原毛平革菌发酵菌种、污叉丝孔菌发酵菌种、云芝发酵菌种、密黏褶菌发酵菌种，按体积比100：20：10：10进行混合，获得混合发酵菌种；
第四步：将所述混合发酵菌种接种到固体发酵培养基上，然后在相对湿度50%、温度28℃环境中，发酵24h，接着保持环境条件不变，翻堆一次，继续发酵24h，获得发酵成品；
第五步：将所述发酵成品与ph值为3的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按照体积比1：1混合后，过滤得到滤液；
第六步：对第五步所得滤液进行超滤浓缩得到浓缩液；
第七步：对第六步所得浓缩液进行喷雾干燥，得到的粉末即为用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂产品。
优选的实施方式为：所述固体发酵培养基的制备方法包括下列步骤：
（1）将椴木粉碎成直径1mm的颗粒，在自然干燥条件下放置1年，获得椴木粉；
（2）将椴木粉、麸皮、草木灰、长度为1mm的玉米秸秆粉、几丁质、纤维二糖、壳聚糖按照质量比100:1:0.01:1:0.5:0.5:1混合均匀，获得混合基质；
（3）将盐溶液与混合基质按照体积质量比1：0.5进行混合，灭菌后得到固体发酵培养基；所述盐溶液由10克的硫酸铵、10克的磷酸氢二钾和0.5克的硫酸锰溶于1升水中制得。
优选的实施方式为：所述种子培养基的制备方法包括下列步骤：
（1）将椴木粉碎成直径1mm的颗粒，在自然干燥条件下放置1年，获得椴木粉；
（2）将椴木粉与质量分数为0.05%的氢氧化钠溶液按照质量体积比1：50的比例混合，20℃条件下浸泡12小时，然后过滤收集滤液，接着调节ph值至6，获得发酵诱导液；
（3）向每升所述发酵诱导液中添加10克的磷酸氢二钾、1克的氯化钠、0.1克的硫酸锰、10克的酵母粉，灭菌后即得种子培养基。
优选的实施方式为：在第四步中，混合发酵菌种的接种量为固体发酵培养基的质量的5%。
优选的实施方式为：在第五步中，采用板框压滤机压滤，板框压滤机中涤纶长纤滤布的型号为60-10（240），操作压力0.5mpa。
优选的实施方式为：在第六步中，超滤浓缩采用的超滤膜为改性聚砜超滤膜，孔径40μm，孔密度6×109孔/cm2，皮层厚度为6μm，支撑层厚度为80μm。
优选的实施方式为：在第七步中，喷雾干燥的进风温度为165℃，排风温度为80℃，收集器内温度为45℃，雾化器转速为15000rpm。
实施例三：一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂及其制备方法
一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂的制备方法，包括下列步骤：
第一步：在无菌环境中，挑取保藏状态下的黄孢原毛平革菌、污叉丝孔菌、云芝、密黏褶菌，分别接种于种子培养基，然后在温度30℃、转速210rpm的条件下，培养45h，获得黄孢原毛平革菌基础菌种、污叉丝孔菌基础菌种、云芝基础菌种和密黏褶菌基础菌种；
第二步：在无菌环境中，将所述黄孢原毛平革菌基础菌种、污叉丝孔菌基础菌种、云芝基础菌种和密黏褶菌基础菌种，按体积比1：25分别转接到新的种子培养基，在温度30℃、转速220rpm的条件下，培养40h，获得黄孢原毛平革菌发酵菌种、污叉丝孔菌发酵菌种、云芝发酵菌种、密黏褶菌发酵菌种；
第三步：在无菌环境中，将所述黄孢原毛平革菌发酵菌种、污叉丝孔菌发酵菌种、云芝发酵菌种、密黏褶菌发酵菌种，按体积比100：25：12：15进行混合，获得混合发酵菌种；
第四步：将所述混合发酵菌种接种到固体发酵培养基上，然后在相对湿度70%、温度32℃环境中，发酵36h，接着保持环境条件不变，翻堆一次，继续发酵36h，获得发酵成品；
第五步：将所述发酵成品与ph值为4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按照体积比1：1.9混合后，过滤得到滤液；
第六步：对第五步所得滤液进行超滤浓缩得到浓缩液；
第七步：对第六步所得浓缩液进行喷雾干燥，得到的粉末即为用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂产品。
优选的实施方式为：所述固体发酵培养基的制备方法包括下列步骤：
（1）将椴木粉碎成直径5mm的颗粒，在自然干燥条件下放置2年，获得椴木粉；
（2）将椴木粉、麸皮、草木灰、长度为3mm的玉米秸秆粉、几丁质、纤维二糖、壳聚糖按照质量比100:8:0.05:5:1.2:0.8:1.5混合均匀，获得混合基质；
（3）将盐溶液与混合基质按照体积质量比1：1.7进行混合，灭菌后得到固体发酵培养基；所述盐溶液由15克的硫酸铵、20克的磷酸氢二钾和0.7克的硫酸锰溶于1升水中制得。
优选的实施方式为：所述种子培养基的制备方法包括下列步骤：
（1）将椴木粉碎成直径6mm的颗粒，在自然干燥条件下放置2年，获得椴木粉；
（2）将椴木粉与质量分数为0.08%的氢氧化钠溶液按照质量体积比1：75的比例混合，27℃条件下浸泡18小时，然后过滤收集滤液，接着调节ph值至7，获得发酵诱导液；
（3）向每升所述发酵诱导液中添加15克的磷酸氢二钾、5.5克的氯化钠、0.7克的硫酸锰、15克的酵母粉，灭菌后即得种子培养基。
优选的实施方式为：在第四步中，混合发酵菌种的接种量为固体发酵培养基的质量的10%。
5、根据权利要求1所述的用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂的制备方法，其特征在于：在第五步中，采用板框压滤机压滤，板框压滤机中涤纶长纤滤布的型号为60-10（240），操作压力0.7mpa。
优选的实施方式为：在第六步中，超滤浓缩采用的超滤膜为改性聚砜超滤膜，孔径50μm，孔密度6.5×109孔/cm2，皮层厚度为8μm，支撑层厚度为90μm。
优选的实施方式为：在第七步中，喷雾干燥的进风温度为167℃，排风温度为82℃，收集器内温度为46℃，雾化器转速为16000rpm。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。