一种果蔬保鲜剂及胰蛋白酶在促进假丝酵母菌生防作用方面的应用的制作方法

本发明涉及一种果蔬保鲜剂及胰蛋白酶在促进假丝酵母菌生防作用方面的应用，属于食品科学技术领域。

背景技术

果蔬采摘后，在贮藏加工的过程中，由于受诸多不利条件的影响，细胞内活性氧代谢平衡遭到破坏，自由基大量产生并积累，对其造成严重损害，也加速了果蔬的褐变、衰老与死亡。因此必须采取措施对采摘后的果蔬进行处理，使果蔬减少呼吸代谢，防止果蔬表面的微生物的生长繁殖，避免果蔬因微生物，如细菌、霉菌，特别是霉菌污染引起的腐烂变质，进而延长果蔬的贮藏时间。目前有许多用于果蔬保鲜贮藏的方法，比如低温贮藏、减压贮藏、化学保鲜和生物保鲜，生物保鲜中包括辐射保鲜和用vc、壳聚糖处理等。

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，可以从动物的胰脏中提取纯化获得结晶。胰蛋白酶难溶于有机溶剂，易溶于水，其相对分子质量为23400，等电点pi为10.5，最适ph为7.8～8.5，其单一肽链含有233个氨基酸残基和六对二硫键。胰蛋白酶具有清除氧自由基的作用，在一定程度下可以促进果蔬的保鲜。

酵母菌能抑制一些毒素、霉菌的生长，而这些霉菌分离自贮藏过程中腐败的水果、蔬菜和粮食。利用微生物之间的寄生、拮抗作用达到生物防治的效果，这种方法比化学药剂处理更安全有效。《果蔬微生物保鲜技术的研究进展》(食品与生物技术学报，李静等，2014年第33卷第4期)中公开了酵母菌具有拮抗效果好、不产生毒素、可以和化学杀菌剂共同使用等优点，可以作为果蔬保鲜剂使用。

但是，单独使用酵母菌的保鲜效果并不理想，目前酵母菌和其他物质协同作用下增强果蔬保鲜效果的技术几乎未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种果蔬保鲜剂，该保鲜剂可以增强假丝酵母菌的生防作用。

本发明还提供胰蛋白酶在促进假丝酵母菌生防作用方面的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种果蔬保鲜剂，包括假丝酵母菌和胰蛋白酶。

所述果蔬保鲜剂中假丝酵母菌的活菌数为1.0×10³～1.0×10¹⁰cfu/ml。

所述果蔬保鲜剂中胰蛋白酶的浓度为5.8×10^-8～5.8mg/ml。

优选的，所述果蔬保鲜剂中胰蛋白酶的浓度为5.8×10^-7～5.8×10^-1mg/ml。

所述假丝酵母菌和胰蛋白酶的添加体积比为9:1。

胰蛋白酶在促进假丝酵母菌生防作用方面的应用。

上述胰蛋白酶在促进假丝酵母菌生防作用方面的应用中，在有氧条件下所述胰蛋白酶的浓度为5.8×10^-8～5.8mg/ml。

优选的，上述胰蛋白酶在促进假丝酵母菌生防作用方面的应用中，在有氧条件下所述胰蛋白酶的浓度为5.8×10^-7～5.8×10^-1mg/ml。

上述胰蛋白酶在促进假丝酵母菌生防作用方面的应用中，在无氧条件下所述胰蛋白酶的浓度为5.8×10^-7～5.8×10^-1mg/ml。

上述生防作用为胰蛋白酶在增强假丝酵母菌抑制霉菌生长的作用。

本发明的有益效果：

本发明通过实验证明胰蛋白酶在增强假丝酵母菌抑制霉菌生长方面有促进作用，即胰蛋白酶可以促进假丝酵母菌的生防作用，进而为果蔬保鲜提供了一种新的途径。从果蔬上分离出来的假丝酵母菌与胰蛋白酶联用时，能够显著抑制果蔬表面的霉菌生长，延长果蔬的保鲜期。

附图说明

图1为实施例4中的胰蛋白酶促进假丝酵母菌生防作用的固体实验效果图；

图2为实施例5中的胰蛋白酶在有氧条件下促进假丝酵母菌生防作用的液体实验效果图；

图3为实施例6中的胰蛋白酶在无氧条件下促进假丝酵母菌生防作用的液体实验效果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明。

实施例中的霉菌及假丝酵母菌均是从腐烂的果蔬上分离鉴定得到。

实施例中的培养基为马铃薯蔗糖培养基，每100ml培养基包括：去皮的马铃薯20g，蔗糖2g(配固体培养基时加2g琼脂)，蒸馏水100ml，煮沸过程中可适当的补水。

实施例中出现的其他材料、试剂和仪器若无特别说明均可从商业途径中获得。

实施例1

本实施例的果蔬保鲜剂包括假丝酵母菌、胰蛋白酶。其中假丝酵母菌的活菌数为1.0×10³cfu/ml，在果蔬保鲜剂中胰蛋白酶的浓度为5.8×10^-5mg/ml。该果蔬保鲜剂由假丝酵母菌菌悬液和胰蛋白酶溶液配制而成，假丝酵母菌菌悬液和胰蛋白酶溶液的添加体积比为9:1。

实施例2

本实施例的果蔬保鲜剂包括假丝酵母菌、胰蛋白酶。其中假丝酵母菌的活菌数为1.0×10⁶cfu/ml，在果蔬保鲜剂中胰蛋白酶的浓度为5.8×10^-3mg/ml。该果蔬保鲜剂由假丝酵母菌菌悬液和胰蛋白酶溶液配制而成，假丝酵母菌菌悬液和胰蛋白酶溶液的添加体积比为9:1。

实施例3

本实施例的果蔬保鲜剂包括假丝酵母菌、胰蛋白酶。其中假丝酵母菌的活菌数为1.0×10¹⁰cfu/ml，在果蔬保鲜剂中胰蛋白酶的浓度为5.8×10^-3mg/ml。该果蔬保鲜剂由假丝酵母菌菌悬液和胰蛋白酶溶液配制而成，假丝酵母菌菌悬液和胰蛋白酶溶液的添加体积比为9:1。

实施例4

本实施例为胰蛋白酶在促进假丝酵母菌的生防作用的固体实验，具体包括如下步骤：

1、将购买的新鲜的果蔬放于常温下，让其自然腐败，从腐败的果蔬上分离表面的各种微生物，用不断划线法进行微生物的纯培养，经菌种鉴定分离，得到假丝酵母菌和霉菌，保存备用。

2、假丝酵母菌的培养：用接种环从固体平板上挑取假丝酵母菌的单菌落，接入到20ml的培养基中进行活化，30℃过夜培养，待用。

3、霉菌的培养：用接种环从固体平板上挑取霉菌的单菌落，接入到20ml的培养基中进行活化，30℃过夜培养，待用。

4、将上述培养的假丝酵母菌和霉菌采用平板涂布法进行如下操作：

(1)阴性对照组：在马铃薯固体培养基平板中间划一条直线，直线的一侧涂布100ul的无菌水，另一侧涂布100ul的霉菌菌悬液，设置两个平行试验。

(2)阳性对照组：在马铃薯固体培养基平板中间划一条直线，直线的一侧涂布100ul的过滤除菌的两性霉素b溶液，另一侧涂布100ul的霉菌菌悬液，设置两个平行试验。

(3)实验组1：在马铃薯固体培养基平板中间划一条直线，直线的一侧涂布100ul的假丝酵母菌培养液，另一侧涂布100ul的霉菌菌悬液，设置两个平行试验。

(4)实验组2：在马铃薯固体培养基平板中间划一条直线，直线的一侧涂布100ul的胰蛋白酶溶液，另一侧涂布100ul的霉菌菌悬液，设置两个平行试验。所使用的胰蛋白酶浓度为5.8×10^-3mg/ml。

(5)实验组3：首先将假丝酵母菌培养液与胰蛋白酶溶液以9:1的比例混合制成胰蛋白酶假丝酵母菌混合液，并使胰蛋白酶的终浓度为5.8×10^-3mg/ml。然后在马铃薯固体培养基平板中间划一条直线，直线的一侧涂布100ul的胰蛋白酶假丝酵母菌混合液，另一侧涂布100ul的霉菌菌悬液，设置两个平行试验。

以上五组均处理完成后，将其培养在30℃的恒温培养箱中，3天后观察结果。

结果如图1所示，其中图1a为阴性对照组的结果；图1b为实验组1的结果；图1c为实验组2的结果；图1d为实验组3的结果；图1e为阳性对照组的结果。

结果表明图1a平板上长满了霉菌；图1b中霉菌的生长并没有蔓延到涂了假丝酵母菌的右侧，说明假丝酵母菌对霉菌的生长有抑制作用；图1c单独使用胰蛋白酶对霉菌的生长并没有抑制作用；图1d胰蛋白酶与假丝酵母菌混合使用时能够明显抑制霉菌的生长，并且效果明显优于图1b，说明胰蛋白酶能够促进假丝酵母菌的生防作用；图1e是阳性对照。结合实验结果可以得到胰蛋白酶能够促进假丝酵母菌的生防作用。

实施例5

本实施例为胰蛋白酶在有氧条件下对假丝酵母菌的生防作用的液体实验，具体包括如下步骤：

1、将浓度为5.8×10¹mg/ml的胰蛋白酶的母液用无菌水稀释到所需浓度，待用。

2、假丝酵母菌的培养：从平板上挑取分离好的假丝酵母菌的单菌落，接入到20ml的培养基中进行活化，活化6h后或者测定当假丝酵母菌的od值为0.7左右时，用已灭菌的马铃薯液体培养基稀释假丝酵母菌，稀释到其od为0.2，待用。

3、取已灭菌的15ml的离心管，加入已稀释的假丝酵母菌的菌悬液9ml，再加入1ml不同浓度的胰蛋白酶，使胰蛋白酶的终浓度分别为5.8×10^-7mg/ml、5.8×10^-6mg/ml、5.8×10^-5mg/ml、5.8×10^-4mg/ml、5.8×10^-3mg/ml、5.8×10^-2mg/ml、5.8×10^-1mg/ml，将不同终浓度的胰蛋白酶作为实验组。取已灭菌的15ml的离心管加入10ml的假丝酵母菌菌悬液作为阴性对照组，阳性对照加入9ml假丝酵母菌菌悬液和1ml的两性霉素b溶液。

待所有的试剂都加入完全之后，再分别将各组处理的试剂分装到4个试管中，每个试管2ml，其余的试剂弃去，分装完成后各个试管用棉塞封口，可透过氧气。最后放到恒温培养箱中过夜培养12h，测定其od值。

结果如图2所示，纵坐标为假丝酵母菌的od值，横坐标为胰蛋白酶浓度，其中，1表示阴性对照；2表示5.8×10^-7mg/ml；3表示5.8×10^-6mg/ml；4表示5.8×10^-5mg/ml；5表示5.8×10^-4mg/ml；6表示5.8×10^-3mg/ml；7表示5.8×10^-2mg/ml；8表示5.8×10^-1mg/ml；9表示阳性对照(两性霉素b溶液)。

结果表明，实验所用的胰蛋白酶浓度均能够促进假丝酵母菌的生长，其中在胰蛋白酶的浓度为5.8×10^-6mg/ml和5.8×10^-3mg/ml时对假丝酵母菌的促进作用最佳，即在有氧条件下胰蛋白酶能够促进假丝酵母菌的生长。

实施例6

本实施例为胰蛋白酶在无氧条件下对假丝酵母菌生防作用的液体实验，具体包括如下步骤：

1、将浓度为5.8×10¹mg/ml的胰蛋白酶的母液用无菌水稀释到所需浓度，待用。

2、假丝酵母菌的培养：从平板上挑取分离好的假丝酵母菌的单菌落，接入到20ml的培养基中进行活化，活化菌6h后或者测定当假丝酵母菌的od值为0.7左右时，用已灭菌的马铃薯液体培养基稀释假丝酵母菌，稀释到其od为0.2，待用。

3、取已灭菌的15ml的离心管，加入已稀释的假丝酵母菌的菌悬液9ml，再加入1ml不同浓度的胰蛋白酶，使胰蛋白酶的终浓度为5.8×10^-7mg/ml、5.8×10^-6mg/ml、5.8×10^-5mg/ml、5.8×10^-4mg/ml、5.8×10^-3mg/ml、5.8×10^-2mg/ml、5.8×10^-1mg/ml，将不同终浓度的胰蛋白酶作为实验组，阴性对照加入10ml的假丝酵母菌菌悬液，阳性对照加入9ml假丝酵母菌菌悬液和1ml的两性霉素b溶液。

待所有的试剂都加入完全之后，再分别将各组处理的试剂分装到4个试管中，每个试管2ml，分装完成后各个试管用封口膜封好离心管的管口，隔绝空气，最后放到恒温培养箱中过夜培养12h，测定其od值。

结果如图3所示，纵坐标为假丝酵母菌的od值，横坐标为胰蛋白酶浓度，其中，0表示阴性对照；1表示5.8×10^-7mg/ml；2表示5.8×10^-6mg/ml；3表示5.8×10^-5mg/ml；4表示5.8×10^-4mg/ml；5表示5.8×10^-3mg/ml；6表示5.8×10^-2mg/ml；7表示5.8×10^-1mg/ml；8表示阳性对照(两性霉素b溶液)。

结果表明，在无氧条件下胰蛋白酶浓度为5.8×10^-6mg/ml时能够促进假丝酵母菌的生长，在其他浓度下，胰蛋白酶对假丝酵母菌的生长几乎没有影响。在无氧条件下一定浓度的胰蛋白酶能够促进假丝酵母菌的生长。