本发明涉及微生物发酵技术和畜禽营养及养殖技术，具体的说是一种畜禽用维生素b2营养型微生态制剂的生产方法。
背景技术：
：近年来，随着人民生活水平的提高,人们的消费观念，膳食结构，发生了巨大的改变，人们从吃的饱，吃的好，吃的精，到吃的安全，吃的健康。为此，人们对畜禽养殖行业和饲料生产行业，提出了更高的要求，从数量型往质量型转变。在畜禽养殖行业和饲料生产行业发展进程中，抗生素是功不可没的。由于抗生素类饲料添加剂摄入，对养殖业的集约化生产起到巨大的推动作用。同时，过早过量的使用抗生素，现已发展成滥用抗生素，随之带来对畜禽的产品品质、对环境污染，对人、畜健康的危害也越来越凸显。食品安全、环境污染、人民健康，已引起政府和人民的高度重视，所以，对畜禽养殖业，过早过多使用抗生素的治理工作和研制开发应用无药残的新型饲料添加剂已迫在眉睫。微生态制剂的开发与利用恰恰解决了上述问题。微生态制剂(益生素、活菌制剂)，定义:有益的活性微生物及代谢产物和促生长物质的制剂。微生态制剂是利用微生物之间的相互拮抗、共生和互生的关系，以及这些微生物所具有的产酸，降解蛋白质，分解糖和脂肪，降解nh3和h2s等功能而发挥其抑制病原微生物，分解饲料中蛋白质为多肽或氨基酸，降解水中残留的氨氮和亚硝酸盐等。它是一种天然的生物活性制剂，无毒副作用、无耐药性、无药物残留，通过促进肠道内有益微生物的生长，抑制有害微生物的生长繁殖，来调整维持胃肠道内的微生态平衡，达到预防疾病和促进生长的目的。同时，这些微生物还可产生促生长因子、多种消化酶和维生素，进而促进营养物质的消化、吸收及动物的生长繁殖。此外，这些微生物还能产生免疫调节因子和干扰素等免疫活性物质，刺激肠道局部免疫器官的生长发育，增强机体免疫力，从而防止各种疾病的发生，是一类新型绿色环保药物，可以替代或半替代抗生素。在国外，1947年，蒙哈德首先使用乳酸杆菌饲喂仔猪可有效的增加仔猪的体重并改善仔猪的身体健康。上世纪70年代，美国率先使用微生态制剂，使用效果非常明显，显现出抗生素无法比拟的优点。80年代开始，微生态制剂开始在世界范围内普及并被人们认可。在国内，微生态制剂最早进行研究和应用的是中科院学部委员魏曦教授和康白教授，最早提出微生态菌群平衡理论，我国农业部2003年公布，饲料级微生物添加剂菌种有枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、乳酸球菌和酵母菌等15种。目前，根据国家大数据库统计资料表明：我国每年微生态制剂的需求量为22.8万吨，按照1万元一吨计算，22.8亿元的市场需求。维生素b2(核黄素)溶于水，缺乏时，发生代谢障碍，有口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等病灶。体内维生素b2的储存是有限的，每天必须由饮食提供，主要存在于蔬菜中。近年来，微生态制剂的研发与生产，方兴未艾，一浪高过一浪。主要产品为：乳酸型、乳酸酵母型、枯草芽孢杆菌型还有日本人倡导的复合型的em，五光十色，五花八门。也有一些研究者，涉足于营养性微生态制剂的研究与开发，是在微生态制剂基础上简单的加入维生素或氨基酸单体复合而成。呈现出一批新产品问世，如多维复合微生态制剂，高肽氨基酸微生态制剂等等。在微生态制剂中，采用优良的维生素b2产生菌种，采用先进微生物发酵技术，进行发酵，发酵液中维生素b2菌数高、活性好、维生素b2含量高，因为维生素b2胞内、胞外都含有维生素b2，为此，可以源源不断的产生维生素b2，此类研究和产品，并没有见到报道，在国内尚属首次。枯草芽孢杆菌具有生物夺氧、抑制病菌、生物拮抗、调整菌群等功能，从而促进有益厌氧菌生长，故其在提高动物机体免疫力、增强消化系统酶活性、防病治病和促进生长中起到了重要作用。具有繁殖速度快、能分泌多种酶类和氨基酸，而且抗逆性强，耐高温、耐酸碱、耐挤压、易贮存、稳定性能好等特点，在现代分子遗传学的科研探索中常作为模式菌株，在现实的生产实践中广泛应用于食品工业、饲料工业、水产养殖、环境保护和保健医药等诸多方面。酵母菌有啤酒酵母、产朊假丝酵母、酿酒酵母、红色酵母等，细胞形态为球形或卵球形，繁殖方式为无性芽殖。酵母菌具有生长繁殖速度快、容易培养、菌体及代谢产物营养丰富，含蛋白质、核酸、维生素和蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化氢酶等多种酶，具有增强动物免疫力，增加饲料适口性，促进动物对饲料的消化吸收能力等功能，可提高动物对磷的利用率，可以用来发酵生产饲用单细胞蛋白。乳酸菌在厌氧或兼性厌氧生长条件下生长。能分泌乳酸、乙酸和肽类抗菌素。主要用于维持消化道菌群的稳定性和平衡，降低ph，抑制致病菌侵入和定植；降解氨、吲哚及粪臭素等有害物质，维持肠道中正常的生态平衡；活菌体和其代谢产物中含有较高的超氧化物歧化酶(sod)，能消除氧自由基的不利作用，增强体液免疫和细胞免疫。b2产生菌为细菌，短小杆菌，在发酵过程中代谢出维生素b2，胞内、胞外均含有。维生素b2的一般作用：1)促进发育和细胞的再生；2)促使皮肤、指甲、毛发的正常生长；3)预防口腔生殖综合症；4)抗疲劳；5)影响机体对铁的吸收；6)与其他物质结合一起，从而影响生物氧化和能量代谢。饲料级维生素b2能维持机体健康，促进生长发育，维护皮肤和粘膜的完整性。营养缺乏病维生素b2又称核黄素，是维持机体正常结构与功能的必需营养物质，具有多种生理功能，参与碳水化合物、脂肪及蛋白质代谢，促进生长发育；与呼吸链的能量产生有关；强化肝功能、调节肾上腺素的分泌；保护皮肤毛囊黏膜及皮脂腺的功能；在维生素b6、叶酸转化成辅酶及合成色氨酸反应中也发挥着重要作用。维生素b2缺乏可出现眼角炎、舌炎等一系列皮肤黏膜症状，并可以使脂质过氧化酶。维生素b2结构及性质维生素b2又名核黄素(riboflavin,vb2)，它是核醇与7，8-二甲基异略嗪的缩合物；为黄褐色针状结晶，溶解度较小，核黄素5-磷酸较易溶解，二者在碱性溶性液及光照下均易分解，其荧光由于三位亚氨基。在消化道内，肠内微生物也可将其分解为甲酰甲基黄素等。有机锌具有提高免疫力，提高维生素存留率,提高饲料利用率，减少粪中锌的排泄量，减少污染。提高采食量和日增重，提高生产性能并能改善品质。有机硒能有效提高免疫力预防下痢和贫血。增强抗应激能力。提高饲料转化率和适口性，绿色饲料添加剂。无任何毒副作用，无任何药物残留。目前，此项技术，已在黑龙江国营农场、新疆生产建设兵团和哈尔滨、辽宁的沈阳等地区广泛应用，获得了理想的应用效果和经济效益。产品实现了商品化生产。目前，中国科学院沈阳应用生态研究所从海洋中已经分离、纯化、鉴定出多株酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌，经过驯化、培育、提高得到多株产物含量高、活性好、生长速度快的生产菌株。本专利现研制开发的是维生素b2营养型微生态制剂，本产品具有微生态制剂的全部功能，又有维生素b2营养类的全部功能。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种畜禽用维生素b2营养型微生态制剂的生产方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：以维生素b2产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌为菌种，均以玉米浆干粉为主要发酵原料。维生素b2产生菌在含有氯化钙的培养基中进行液体发酵，枯草芽孢杆菌在含有硫酸锌的培养基中进行液体发酵，酿酒酵母菌在含有亚硒酸钠的培养基中进行液体发酵，植物乳杆菌在含有乙酸钠的培养基中进行液体发酵；分别得四种菌发酵液，300目(47μm)膜过滤后，混合分装，得畜禽用维生素b2营养型微生态制剂。发明产品中含有益微生物活菌、维生素b族元素、氨基酸、小肽、有机锰、有机锌、有机硒、有机酸、生物酶和生物活性物质。在畜禽中蛋鸡、肉鸡仔猪、育肥猪的饮水或饲料中添加，可提高肌体免疫力，防病抗病，减少抗生素用量，提高生产性能，改善品质，净化养殖环境,是一种绿色环保优质的营养型微生物生态制剂。所述维生素b2产生菌发酵罐培养基和培养条件：按重量百分比计，葡萄糖0.50～1.50％、玉米浆干粉4.00～6.00％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、硫酸镁0.05～0.15％、氯化钠0.05～0.15％、硫酸锰0.10～0.30‰、氯化钙0.10～0.30％，余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.08mpa～0.10mpa、115℃～121℃、18min～20min；培养条件：接种量10％～20％；罐压0.01mpa～0.10mpa、风量100:80～100:120vvm、转速100rpm～200rpm、温度28℃～32℃；时间48h～64h，ph6.5～7.0，得维生素b2产生菌100～200个亿cfu/ml发酵液；所述枯草芽孢杆菌发酵罐培养基和培养条件：按重量百分比计，葡萄糖0.50～1.50％、玉米浆干粉4.00～6.00％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、硫酸镁0.05～0.15％、氯化钠0.05～0.15％、硫酸锌0.40～0.60％、硫酸锰0.10～0.30‰，余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.08mpa～0.10mpa、115℃～121℃、18min～20min；培养条件：接种量10％～20％；罐压0.01mpa～0.10mpa、风量100:80～100:120vvm、转速100rpm～200rpm、温度28℃～32℃；时间48h～64h，ph6.5～7.5，得枯草芽孢杆菌100～200个亿cfu/ml发酵液；所述酿酒酵母菌发酵罐培养基和培养条件：按重量百分比计，葡萄糖2.0～4.0％、玉米浆干粉2.0～4.0％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、硫酸镁0.05～0.15％、氯化钠0.05～0.15％、硫酸锰0.10～0.30‰、亚硒酸钠0.4～1.2‰，余量为水；发酵罐灭菌条件：灭菌0.08mpa～0.10mpa、115℃～121℃、18min～20min；培养条件：接种量10％～20％；罐压0.01mpa～0.10mpa、风量100:120～100:80vvm、转速80rpm～120rpm、温度28℃～32℃；时间36h～56h，ph6.0～6.5，得酿酒酵母菌20～40个亿cfu/ml发酵液；所述植物乳杆菌发酵罐培养基和培养条件：按重量百分比计，葡萄糖1.0～3.0％、玉米浆干粉1.0～3.0％、乙酸钠1.0～3.0％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、硫酸镁0.05～0.15％、氯化钠0.05～0.15％、硫酸锰0.10～0.30‰、余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.08mpa～0.10mpa、115℃～121℃、18min～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01mpa～0.1mpa、风量100:30～80vvm、转速30rpm～80rpm、温度34℃～38℃、时间36～56h，ph3.5～4.5；得植物乳杆菌40～80个亿cfu/ml发酵液。将得到的含有氯化钙的维生素b2产生菌发酵液，含有硫酸锌的枯草芽孢杆菌发酵液，含有亚硒酸钠的酿酒酵母菌发酵液，含有乙酸钠的植物乳杆菌发酵液，按重量比1～1.2:1～1.2:1～1.2:1～1.2在洁净、无菌条件下，倒入灭过菌的容器中，搅拌、混匀,用乙酸将ph值调到4.0～5.0，通过100目～300目无菌膜过滤得滤液；或将得到的含有氯化钙的b2产生菌发酵液，含有硫酸锌的枯草芽孢杆菌发酵液，含有亚硒酸钠的酿酒酵母菌发酵液，含有乙酸钠的植物乳杆菌发酵液，分别用乙酸将ph值调到4.0～5.0，再用100～300目膜过滤后，按重量比1～1.2:1～1.2:1～1.2:1～1.2在洁净、无菌条件下，倒入灭过菌的容器中，搅拌、混匀得滤液，分装到棕色产品瓶中，得到畜禽用维生素b2营养型微生态制剂。畜禽用维生素b2营养型微生态制剂产品中含有维生素b2产生菌25～50个亿cfu/ml、枯草芽孢杆菌25～50个亿cfu/ml、酿酒酵母菌5～10个亿cfu/ml、植物乳杆菌10～20个亿cfu/ml。畜禽用维生素b2营养型微生态制剂的主要质量含量为()：维生素b族元素2.0％～3.0％、氨基酸20％～30％、小肽20％～30％、有机锌0.10～0.15％、有机锰0.1～0.3‰、有机硒0.1～0.3‰。一种畜禽用维生素b2营养型微生态制剂的生产方法，较佳方案如下：维生素b2产生菌发酵罐培养基和培养条件：按重量百分比计，葡萄糖1.00％、玉米浆干粉5.00％、磷酸氢二钾0.10％、硫酸镁0.10％、氯化钠0.10％、硫酸锰0.20‰、氯化钙0.20％，余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10mpa、121℃、20min；培养条件：接种量20％；罐压0.05mpa、风量100:100vvm、转速100rpm、温度30℃；时间48h，ph6.5，得含有维生素b2产200个亿cfu/ml的发酵液、枯草芽孢杆菌发酵罐培养基和培养条件：按重量百分比计，葡萄糖1.00％、玉米浆干粉5.00％、磷酸氢二钾0.10％、硫酸镁0.10％、氯化钠0.10％、硫酸锌0.40％、硫酸锰0.20‰，余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10mpa、121℃、20min；培养条件：接种量20％；罐压0.05mpa、风量100:100vvm、转速100rpm、温度30℃；时间48h，ph7.0，得到枯草芽孢杆菌200个亿cfu/ml发酵液；酿酒酵母菌发酵罐培养基和培养条件：重量百分比计，葡萄糖3.0％、玉米浆干粉3.0％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.1％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.2‰、亚硒酸钠0.80‰、余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10mpa、121℃、20min；培养条件：接种量20％；罐压0.05mpa、风量100:100vvm、转速100rpm、温度30℃、时间48h、ph6.0，得酿酒酵母菌cfu20个亿cfu/ml发酵液；植物乳杆菌发酵罐培养基和培养条件：按重量百分比计，葡萄糖2.0％、玉米浆干粉2.0％、乙酸钠2.0％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.1％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.2‰、余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10mpa、121℃、20min；培养条件：接种量20％；罐压0.05mpa、风量100:50vvm、转速50rpm、温度36℃、时间48h，ph4.0；得植物乳杆菌40个亿cfu/ml发酵液。将得到的含有氯化钙的维生素b2产生菌发酵液，含有硫酸锌的枯草芽孢杆菌发酵液，含有亚硒酸钠的酿酒酵母菌发酵液，含有乙酸钠的植物乳杆菌发酵液，按重量比1:1:1:1在洁净、无菌条件下，倒入灭过菌的容器中，搅拌、混匀,用乙酸将ph值调到4.0，通过300目无菌膜过滤得滤液；或将得到的含有氯化钙的维生素b2产生菌发酵液，含有硫酸锌的枯草芽孢杆菌发酵液，含有亚硒酸钠的酿酒酵母菌发酵液，含有乙酸钠的植物乳杆菌发酵液，分别用乙酸将ph值调到4.0，再用300目膜过滤后，按重量比1:1:1:1在洁净、无菌条件下，倒入灭过菌的容器中，搅拌、混匀得滤液，分装到棕色产品瓶中，得到畜禽用维生素b2营养型微生态制剂。畜禽用维生素b2营养型微生态制剂产品中含有维生素b2产生菌50个亿cfu/ml、枯草芽孢杆菌50个亿cfu/ml、酿酒酵母菌5个亿cfu/ml、植物乳杆菌10个亿cfu/ml。畜禽用维生素b2营养型微生态制剂的主要质量含量为：维生素b族元素2.5％、氨基酸20％、小肽20％、有机锌0.10％、有机锰0.20‰、有机硒0.20‰。具体种子液的制备：1)单菌落分离：将经活化的维生素b2产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌斜面菌种，分别在新配置的维生素b2产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌培养基的培养皿上涂布，经培养，分别得到维生素b2产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的单菌落种子。2)一级固体种子培养：维生素b2产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的单菌落种子，分别接种到维生素b2产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的单菌落种子培养基中，固体种子培养瓶为200ml茄形扁瓶，经培养，分别得到维生素b2产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的一级固体种子；3)二级液体种子培养：将步骤2)中分别得到的维生素b2产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的一级固体种子(茄形扁瓶)接种到二级发酵罐培养基中。发酵罐的接种量为：一级固体种子(茄形扁瓶)与液体重量比为1瓶：100公斤，经培养，分别得到维生素b2产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的发酵液。4)维生素b2产生菌液体发酵液浓度≥200亿个cfu/ml以上。5)枯草芽孢杆菌液体发酵液浓度≥200亿个cfu/ml以上。6)酿酒酵母菌液体发酵液浓度≥20亿个cfu/ml以上。7)植物乳杆菌液体发酵液浓度≥40亿个cfu/ml以上。本发明主要优点是：1)发酵需要原料价低易得，主要原料是玉米浆，价格低，易得，添加的辅助料：硫酸锰、硫酸锌、亚硒酸钠、乙酸钠易得。2)发酵工艺简单易于控制，设备是全自动控制的发酵罐，可以补料、调酸碱，发酵时间48小时，易于控制。3)所得产品中含有b2产生菌50个亿cfu/ml、枯草芽孢杆菌50个亿cfu/ml、酿酒酵母菌5个亿cfu/ml、植物乳杆菌10个亿cfu/ml。主要质量含量为：维生素b族元素2.5％、氨基酸20％、小肽20％、有机锌0.10％、有机锰0.20‰、有机硒0.20‰。4)效果好，可以在畜禽中蛋鸡、肉鸡仔猪、育肥猪的饮水或饲料中添加，可提高肌体免疫力，防病抗病，减少抗生素用量，提高生产性能，改善品质，净化养殖环境。本发明主要特点是：1)在枯草芽孢菌发酵中加入无机的硫酸锌，通过微生物发酵转化成有机锌，有机锌极易被动物吸收利用，锌元素在饲料中添加，对动物提高免疫力，提高维生素存留率,提高饲料利用率，减少粪中锌的排泄量，减少污染。提高采食量和日增重，提高生产性能并能改善品质中有着重要作用。2)在酿酒酵母发酵中加入无机的亚硒酸钠，通过微生物发酵转化成有机硒，有机硒极易被动物吸收利用，硒元素对动物能有效提高免疫力预防下痢和贫血。增强抗应激能力。提高饲料转化率和适口性中有着重要作用。3)在植物乳杆菌发酵中加入无机的乙酸钠，通过微生物发酵转化成有机酸，有机酸极易被动物吸收利用，各种有机酸在对动物能提高免疫力，预防下痢，增强抗应激能力，提高饲料转化率中有着重要作用。主要创新点：1)本产品微生物发酵法，分别生产出高浓度维生素b2产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌液体菌；2)每个菌液都各有特色和功能，b2为菌种发酵，b2胞内、胞外均含有。枯草芽孢杆菌为菌种，以玉米浆和锌为培养基发酵，含有机锌，酿酒酵母菌为菌种以玉米浆和亚硒酸钠为培养基发酵，含有硒，植物乳杆菌为菌种，以玉米浆和乙酸钠为培养基发酵，含多种有机酸，产品有特色。3)产品经国家检测部门检测，产品达到国内领先水平。具体实施方式本发明各实施例采用的维生素b2产生菌、植物乳杆菌由中国科学院沈阳应用生态研究所农业微生物技术组所提供。本发明各实施例所采用的酿酒酵母菌为：中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，cicc编号为1355；枯草芽孢杆菌为中国工业微生物微生物菌种保藏管理中心保藏的枯草芽孢杆菌枯草亚种(bacillussubtilissubsp，subtilis)，cicc编号为20822。玉米浆粉由山东西王糖业公司鹤伴山生物科技有限公司提供。一种畜禽用维生素b2营养型微生态制剂的生产方法可按下列步骤具体操作：下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。实施例1维生素b2产生菌为细菌，梭状芽孢杆菌(clostridium)(菌体大小2～3×3～5μm)，由中国科学院沈阳应用生态研究所农业微生物技术组所提供。在发酵过程中代谢出维生素b2，胞内、胞外均含有，发酵用主要原料玉米浆干粉(由山东西王糖业公司鹤伴山生物科技有限公司提供)。单菌落纯化与优选、一级固体种子培养(均为葡萄糖1％、牛肉膏1％、蛋白胨1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.1％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.2‰、余量为水、琼脂2％的培养基，培养条件28度、36小时，培养箱静置)、二级液体发酵培养具体操作步骤如下：维生素b2产生菌为细菌具有速度快、对碳氮培养基要求不苛刻，耐高温、耐酸碱、稳定性能好、应用范围广等特点。二级液体发酵培养：采取深层发酵法生产种子液，将培养好的茄形扁瓶菌一级固体种子，用200ml无菌水洗入至500ml无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差接种到发酵罐中，(发酵罐可以是500立升、1吨、2吨)，装液量不超过70％。显微镜下检查菌菌体运动活泼，健壮，整齐，无杂菌，无异味，无污染等异常现象，镜检b2产生菌活菌数可达200个亿cfu/ml(采用血球计数法计算菌数)，无杂菌污染等异常现象，得维生素b2产生菌发酵液，待处理使用。维生素b2产生菌液体发酵培养基和培养条件试验a、维生素b2产生菌液体发酵培养基配方试验。设计为7因素3水平，试验设计和试验结果如下表1：表1维生素b2产生菌液体发酵培养基配方试验因子/水平ⅰⅱⅲ葡萄糖(g/l)1.02.03.0玉米浆干粉(％)4.05.06.0磷酸氢二钾(％)0.050.100.15硫酸镁(％)0.050.100.15氯化钠(％)0.050.100.15硫酸锰(‰)0.100.200.30氯化钙(‰)0.100.200.30菌数测定结果(cfu/ml)19.0×10920.9×10920.6×109b、维生素b2产生菌液体发酵培养条件试验试验设计为5因素3水平，试验设计和试验结果如下表2：表2维生素b2产生菌液体发酵条件试验通过表1、表2的试验结果确定：维生素b2产生菌发酵罐的培养基和培养条件为(按重量百分比计)：葡萄糖2.0％、玉米浆干粉5.0％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.1％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.2‰、氯化钙0.2‰、余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10mpa、121℃、20min；培养条件：菌种的体积接种量20％；罐压0.05mpa、风量100:100vvm、转速100rpm、温度30℃、时间48h。实施例2枯草芽孢杆菌，枯草亚种(bacillussubtilissubsp，subtilis)，cicc编号为20822(菌体大小1～3×3～5μm)。主要分解蛋白作用合成氨基酸和肽类物质。发酵用主要原料玉米浆干粉(由山东西王糖业公司鹤伴山生物科技有限公司提供)。单菌落纯化与优选、一级固体种子培养(均为牛肉膏1％、蛋白胨1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.1％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.2‰、余量为水、琼脂2％的培养基；培养条件28度、36小时，培养箱静置)、二级液体发酵培养具体操作步骤如下。枯草芽孢杆菌具有生长速度快、耐高温、耐酸碱、耐挤压、稳定性能好、应用范围广等特点。二级液体发酵培养：采取深层发酵法生产种子液，将培养好的茄形扁瓶菌一级固体种子，用200ml无菌水洗入至500ml无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差接种到发酵罐中，(发酵罐可以是500立升、1吨、2吨)，装液量不超过70％。显微镜下检查菌菌体运动活泼，健壮，整齐，无杂菌，无异味，无污染等异常现象，镜检枯草芽孢杆菌菌活菌数可达200亿cfu/ml(采用血球计数法计算菌数)，无杂菌污染等异常现象，得枯草芽孢杆菌发酵液，待处理使用。枯草芽孢杆菌液体发酵培养基和培养条件试验a、枯草芽孢杆菌液体发酵培养基配方试验，设计为7因素3水平，试验设计和试验结果如下表3：表3枯草芽孢杆菌液体发酵培养基配方试验因子/水平ⅰⅱⅲ葡萄糖(g/l)0.501.001.50玉米浆干粉(％)4.005.006.00磷酸氢二钾(％)0.050.100.15硫酸镁(％)0.050.100.15氯化钠(％)0.050.100.15硫酸锌(％)0.150.300.45硫酸锰(‰)0.100.200.30菌数测定结果(cfu/ml)19.0×10920.9×10920.6×109b、枯草芽孢杆菌液体发酵培养条件试验试验设计为5因素3水平，试验设计和试验结果如下表4：表4枯草芽孢杆菌液体发酵培养条件试验因子/水平ⅰⅱⅲ罐压(mpa)0.010.050.1风量(vvm)100:80100:100100:120转速(rpm)80100120温度(℃)283032时间(h)364856菌数测定结果(cfu/ml)20.2×10920.8×10920.6×109通过表3、表4的试验结果确定的芽孢菌种子罐的培养基和培养条件为：枯草芽孢杆菌的种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0％、玉米浆干粉5.0％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.1％、氯化钠0.1％、硫酸锌0.1％、硫酸锰0.2‰、余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10mpa、121℃、20min；培养条件：菌种的体积接种量20％；罐压0.05mpa、风量100:100vvm、转速100rpm、温度30℃、时间48h。通过实施例2可以看出枯草杨胞杆菌富硒锌量可达到1.5‰～4.5‰。实施例3酿酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)，cicc编号为1355(菌体大小12～14×13～15μm)；是真菌微生物，主要产生蛋白酶、氨基酸、维生素、生物素等。发酵用主要原料玉米浆干粉(由山东西王糖业公司鹤伴山生物科技有限公司提供)。单菌落纯化与优选、一级固体种子培养(均为葡萄糖3％、酵母膏1％、蛋白胨1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.1％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.2‰、余量为水、琼脂2％的培养基；培养条件28度、36小时，培养箱静置)、二级液体发酵培养具体操作步骤如下。二级液体发酵培养(选择培养基和培养条件试验)：采取深层发酵法生产发酵液，将培养好的茄形扁瓶酵母一级固体种子，用200ml无菌水洗入至500ml无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差接种到发酵罐中，(发酵罐可以是500立升、1吨、2吨)，装液量不超过70％，通气发酵培养。培养成熟时，菌液有一种酒香味，显微镜下检查酿酒酵母菌体健壮，酿酒酵母菌活菌数可达20亿cfu/ml(采用血球计数法计算菌数)，无杂菌污染等异常现象，得酿酒酵母发酵液，待处理使用。酿酒酵母菌二级液体种子培养基和培养条件试验a、酿酒酵母菌二级液体种子培养基配方试验0.2～0.3试验设计为7因素3水平，试验设计和试验结果如下表2：表5酿酒酵母菌液体发酵培养基配方试验因子/水平ⅰⅱⅲ葡萄糖(g/l)2.003.004.00玉米浆干粉(％)2.003.004.00磷酸氢二钾(％)0.050.100.15硫酸镁(％)0.050.100.15氯化钠(％)0.050.100.15硫酸锰(‰)0.100.200.30亚硒酸钠(‰)0.700.800.90菌数测定结果(cfu/ml)20.2×10820.8×10820.6×108b、酿酒酵母液体发酵培养条件试验试验设计为5因素3水平，试验设计和试验结果如下表3：表6酿酒酵母菌液体发酵培养条件试验通过表5、表6的试验结果确定的酿酒酵母菌种子罐的培养基和培养条件为：葡萄糖3.0％、玉米浆干粉3.0％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.1％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.2‰、亚硒酸钠0.80‰、余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10mpa、121℃、20min；培养条件：菌种的体积接种量20％；罐压0.05mpa、风量100:100vvm、转速100rpm、温度30℃、时间48h。酿酒酵母菌显微镜检查：酵母细胞形态大小约为2～5×5～30μm酵母多数为单细胞微生物,常呈卵圆形或者圆柱形。酿酒酵母菌培养皿检查：平板培养基上的酵母菌落呈白色粒状凸起，有酒香味.通过实施例3可以看出酿酒酵母富硒含量可达到700～900ppm。实施例4植物乳杆菌(菌体大小2～4×3～5μm)(由中国科学院沈阳应用生态研究所农业微生物技术组所提供)是细菌微生物，主要产生蛋白酶、氨基酸、维生素、生物素等。发酵用主要原料玉米浆干粉(由山东西王糖业公司鹤伴山生物科技有限公司提供)。单菌落純化、一级固体种子培养(均为葡萄糖2％、牛肉膏1％、酵母膏1％、蛋白胨1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.1％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.2‰、余量为水、琼脂2％的培养基；培养条件28度、36小时，培养箱静置)、二级液体种子培养、菌数的检查及其确定，具体操作步骤如下：二级液体发酵培养(选择培养基和培养条件试验)：采取深层发酵法生产发酵液，将培养好的植物乳杆菌茄形扁瓶一级固体种子，用200ml无菌水洗入至500ml无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差接种到发酵罐中，(发酵罐可以是500立升、1吨、2吨)，装液量不超过70％，通气发酵培养。培养成熟时，菌液有一种乳酸香味，显微镜下检查菌体健壮，植物乳杆菌活菌数可达40亿cfu/ml(采用血球计数法计算菌数)以上，无杂菌污染等异常现象，得植物乳杆菌发酵液，待处理使用。植物乳杆菌二级液体种子培养基和培养条件试验a、植物乳杆菌液体发酵培养基配方试验试验设计为7因素3水平，试验设计和试验结果如下表6：表7植物乳杆菌液体发酵培养基配方试验因子/水平ⅰⅱⅲ葡萄糖(g/l)1.002.003.00玉米浆干粉(％)1.002.003.00乙酸钠(％)1.002.003.00磷酸氢二钾(％)0.050.100.15硫酸镁(％)0.050.100.15氯化钠(％)0.050.100.15硫酸锰(‰)0.100.200.30菌数测定结果(cfu/ml)40.8×10841.8×10840.7×108b、植物乳杆菌液体发酵培养条件试验试验设计为5因素3水平，试验设计和试验结果如下表7：表8植物乳杆菌液体发酵罐培养条件试验因子/水平ⅰⅱⅲ罐压(mpa)0.010.050.10风量(vvm)100:30100:50100:80转速(rpm)305080温度(℃)343638时间(h)364856菌数测定结果(cfu/ml)42.2×10842.8×10841.6×108通过表7、表8的试验结果确定的植物乳杆菌种子罐的培养基和培养条件为：葡萄糖2.0％、玉米浆干粉2.0％、乙酸钠2.0％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.1％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.2‰、余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10mpa、121℃、20min；培养条件：菌种的体积接种量20％；罐压0.05mpa、风量100:50vvm、转速50rpm、温度36℃、时间48h。获得发酵液。植物乳杆菌显微镜检查：细胞形态大小约为2～4×3～5μm凸起，直径为3mm士1mm，菌落背面为黄色。植物乳杆菌培养皿检查：植物乳杆菌培平板培养基上菌落呈白色凸起粒微白色，湿润，菌落背面为黄色，边缘整齐有乳酸味。实施例5将实施例1,2,3,4中获得的维生素b2产生菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、酿酒酵母菌发酵液、植物乳杆菌发酵液，在洁净、无菌条件下，按照重量比1：1：1：1体积比倒入灭过菌的容器中，搅拌、混匀,用乙酸将ph值调到4.0～5.0，通过100目～200目无菌膜过滤系统，过滤后清液分装到200ml～1000ml棕色产品瓶中，得到畜禽用维生素b2营养型微生态制剂。表9发酵菌液后处理指标因子水平结果乙酸4.020ml/1000ml.保质期12个月乙酸5.010ml/1000ml保质期12个月膜过滤目数100清澈透明、粒度适合、可用于鸡料和猪料拌料膜过滤目数300清澈透明、粒度适合、可用于鸡饮水线、装液瓶100美观大方、易于订价、应用方便、易于经销商装液瓶1000体积偏大、易于终端，饲料厂家、wip客户在洁净、无菌条件下，倒入灭过菌的容器中，搅拌、混匀，用乙酸将ph值调到4，通过100目无菌膜过滤系统，过滤后清液分装到200ml棕色产品瓶中，得到畜禽用维生素b2营养型微生态制剂。产品中含有维生素b2产生菌50个亿cfu/ml、枯草芽孢杆菌50个亿cfu/ml、酿酒酵母菌5个亿cfu/ml、植物乳杆菌10个亿cfu/ml。禽用维生素b2营养型微生态制剂的主要质量含量为：维生素b族元素2.5％、氨基酸20％、小肽20％、有机锌0.10‰、有机锰0.20‰、有机硒0.20‰。实施例6将实施例5获得的畜禽用维生素b2营养型微生态制剂产品在28周龄的蛋鸡饮用水系统中添加应用；畜禽用微生态制剂：枯草芽孢杆菌50个亿cfu/ml、酿酒酵母菌5个亿cfu/ml、植物乳杆菌10个亿cfu/ml。辽宁威兰生物技术有限责任公司生产。畜禽用维生素b2营养型微生态制剂：维生素b2产生菌50个亿cfu/ml、枯草芽孢杆菌50个亿cfu/ml、酿酒酵母菌5个亿cfu/ml、植物乳杆菌10个亿cfu/ml。维生素b族元素2.5％、氨基酸20％、小肽20％、有机锌0.10％、有机锰0.20‰、有机硒0.20‰。对照组：畜禽用微生态制剂按照0.2％剂量在饮水系统中添加。试验组1：畜禽用维生素b2营养型微生态制剂按照0.2％剂量在饮水系统中添加。试验组2：畜禽用维生素b2营养型微生态制剂按照0.5％剂量在饮水系统中添加。试验结果见表10。表10畜禽用维生素b2营养型微生态制剂对蛋鸡的产蛋率和料蛋比的影响注：试验期为30天。通过可以看出畜禽用维生素b2营养型微生态制剂，可以提高其产蛋率，降低其料蛋比，与对照组相比，试验组1产蛋率提高7.7％，料蛋比下降4.6％，试验组2产蛋率提高9.6％，料蛋比下降6.2％。实施例7将实施例5获得的畜禽用维生素b2营养型微生态制剂，在42日龄的肉鸡饮用水系统中添加应用；对照组：实施例6中所述的畜禽用微生态制剂按照0.2％剂量在饮水系统中添加。试验组1：实施例6中所述的畜禽用维生素b2营养型微生态制剂按照0.2％剂量在饮水系统中添加。试验组2：实施例6中所述的畜禽用维生素b2营养型微生态制剂按照0.5％剂量在饮水系统中添加。试验结果见表11。表11畜禽用维生素b2营养型微生态制剂对肉鸡的平均日增重和料肉比的影注：试验期为30天。可以使肉鸡的平均日增重增加，料肉比降低，与对照组相比，试验组1平均日增重增加7.1％，料肉比下降5.4％；试验组2平均日增重增加10.6％，料肉比下降7.2％。实施例8将实施例5获得的畜禽用维生素b2营养型微生态制剂，在仔猪的日增重、腹泻率和死淘率进行应用试验；对照组：实施例6中所述的畜禽用微生态制剂按照0.2％剂量在日粮中添加。试验组1：实施例6中所述的畜禽用维生素b2营养型微生态制剂按照0.2％剂量在日粮中添加。试验组2：实施例6中所述的畜禽用维生素b2营养型微生态制剂按照0.5％剂量在日粮中添加。试验结果见表12。表12畜禽用维生素b2营养型微生态制剂对仔猪的日增重、腹泻率和死淘率的影响注：试验期为30天。可以使仔猪的平均日增重增加，腹泻率降低，死淘率降低，与对照组相比，试验组1平均日增重增加6.8％，腹泻率下降19.8％，死淘率下降20.8％；试验组2平均日增重增加9.0％，腹泻率下降26.9％，死淘率下降27.9％。实施例9将实施例5获得的畜禽用维生素b2营养型微生态制剂，在育肥猪日粮中日增重和料重比进行应用试验；对照组：实施例6中所述的畜禽用微生态制剂按照0.2％剂量在日粮中添加。试验组1：实施例6中所述的畜禽用维生素b2营养型微生态制剂按照0.2％剂量在日粮中添加。试验组2：实施例6中所述的畜禽用维生素b2营养型微生态制剂按照0.5％剂量在日粮中添加。试验结果见表13。表13畜禽用维生素b2营养型微生态制剂对育肥猪日增重和料重比的影响注：试验期为60天。通过试验可以使育肥猪的平均日增重增加，料重比降低，与对照组相比，试验组1平均日增重增加7.1％，料重比下降5.6％；试验组2平均日增重增加8.8％，料重比下降6.4％。实施例10将实施例5获得的畜禽用维生素b2营养型微生态制剂，在育肥猪日粮中添加0,2剂量进行应用试验；对照组1(添加畜禽用微生态制剂)：实施例6中所述畜禽用微生态制剂按照0.2％剂量(质量)在日粮中添加。对照组2(添加畜禽用微生态制剂+无机微量)：实施例6中所述畜禽用微生态制剂0.2％添加(硫酸锌0.1％、单体维生素b22.5％、硫酸锰0.20‰、亚硒酸钠0.20‰。试验组1(添加畜禽用维生素b2营养型微生态制剂)：实施例6中所述畜禽用维生素b2营养型微生态制剂按照0.2％剂量在日粮中添加。试验组2(添加畜禽用维生素b2营养型微生态制剂，并且发酵日粮)：畜禽用维生素b2营养型微生态制剂按照0.2％剂量在日粮中添加并且发酵48小时。试验结果见表14。表14维生素b2营养型微生态制剂发酵饲料对育肥猪日增重和料重比的影响注：试验期为60天。通过试验可以看出，试验效果为：普通型+有机微量并且发酵日粮≥普通型+有机机微量≥普通型+有机微量≥普通型+无机微量≥普通型。分析主要原因：1、试验组2畜禽用维生素b2营养型微生态制剂并且发酵，有1+1+1≥3的效果，即有微生物作用有机微量作用和发酵后四种菌的发酵产物作用b2菌可以持续发酵有b2产生，有机微量利于消化吸收；2、试验组1畜禽用维生素b2营养型微生态制剂，有1+1≥2的效果。微生物作用有机微量作用；3、对照组2微生态制剂+无机微量。无机微量利用率低。试验结果是使育肥猪的平均日增重增加，料重比降低，与对照组相比，对照组2平均日增重增加5.2％，料重比下降4.2％；试验组1平均日增重增加8.7％，料重比下降6.1％。试验组2平均日增重增加10.4％，料重比下降6.8％。实施例11按实施例2－4的过程进行操作，与实施例2－4不同之处在于，为提高产品质量，缩短生产周期，申请人还试用了中国科学院沈阳应用生态研究所分离、纯化并鉴定的高活性微生物菌株(如：高活性的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌，并将它们同实施例1产物按实施例5方式复合应用)，再按实施例6-10过程分别进行实验，其应用效果更佳。当前第1页12