黑木耳复合小分子肽粉的制备方法及其应用与流程

本发明属于食品工业领域，涉及一种植物肽类组分提取技术，具体涉及一种黑木耳多肽的制备方法及其应用。技术背景黑木耳含胶体蛋白和水溶性纤维，对于清肠、清血管、清肺作用明显，黑木耳胶质蛋白和水溶性纤维能够清理肠道垃圾，增加肠道蠕动，治疗便秘，对于清理血管和清除肺部垃圾有显著效果。是理发产、纺织工人等粉尘污染行业的保健品。黑木耳中含有蛋白质、脂肪、粗纤维、钙元素、钾元素、铁元素、锌元素、硒元素、维生素e、维生素d、硫胺素、核黄素、烟酸、叶酸、真菌多糖等成分。含有的粗纤维能够促进肠胃蠕动，缓解便秘，还能清除血清胆固醇、降低血脂能，适宜高血脂和便秘人群食用；能增强人体免疫功能，有抗病毒、抗肿瘤的功效，含有的蛋白质能有效提高人体免疫力，增强机体对外界不良因素侵袭的抵抗力，是体弱人群和亚健康人群的理想食品。长期以来，黑木耳的使用方式是作为日常的菜品，同时参与作为多种疾病的辅助食疗配方组分。在这些食用方式中，黑木耳作为菜品食用时，有效成分多肽的人体吸收率仅为5-8％，造成有关疾病日常辅助治疗饮食成本极高，辅助治疗效果不够明显。因此，黑木耳产业开发领域急需一种能够大大提高，多肽有效成分的吸收率，能够丰富和提高黑木耳的保健功能的黑木耳精细加工和有效成分提取技术，获得黑木耳的精加工产品形态，从而助力黑木耳产品系列的产业化开发利用，进一步提高黑木耳种植业的产业经济效益，以及提高多种疾病患者的饮食辅助治疗和康复效果。技术实现要素：本发明的目的是提供一种易于被人体特别是患者通过饮食途径的胃肠道吸收，具有高胃肠道吸收率的黑木耳多肽复合物的，步骤简单，环保，成本低，能改善优化产品风味的制备方法，以及通过该方法获得的黑木耳复合多肽在多种疾病和亚健康症状的辅助治疗产品制备中的应用。为实现上述发明目：一方面本发明提供了一种黑木耳复合小分子肽粉的制备方法，其特征是，所述黑木耳复合小分子肽粉是通通过复合蛋白酶分解预处理过的破碎黑木耳获得。在一些实施方式中，所述黑木耳复合小分子肽粉的制备方法包括步骤：前处理(1)物理破碎；(2)高温水解；(3)匀浆；(4)灭菌；酶解黑木耳多肽(4)添加复合蛋白酶，保温水解；(5)离心，分离发酵液；干燥成型和分装(6)喷雾干燥；(7)制粒，分装。在一些实施方式中，所述过筛是将机械破碎后的黑木耳过20～60目筛。在一具体实施方式中，所述过筛是将机械破碎后的黑木耳过35目筛。在一些实施方式中，所述高温水解的温度是80到100。在一具体实施例中，所述高温水解的温度是100。在一些实施方式中，所述高温水解的温度是80到100在一些实施方式中，所述高温水解的时间是1到6小时。在一具体实施方式中，所述高温水解的时间是3小时。在一些实施方式中，所述匀浆是高温水解后的黑木耳在研磨匀浆设备中作用0.5～2小时。在一具体实施方式中，所述匀浆是高温水解后的黑木耳在研磨匀浆设备中作用1小时。在一具体实施方式中，所述黑木耳复合小分子肽粉是通过复合蛋白酶分解预处理过的破碎木耳获得。高效率的蛋白水解酶除了对底物蛋白质应具有较高的水解率外,并应具有使用安全、价格便宜、生产条件要求不高等特点。酶作为一种具有生理活性的特殊蛋白质,其活化中心不同,相应的水解专一性亦不同,对同一种蛋白质选用不同的蛋白酶进行水解,水解效果会有很大差别。根据ph适用范围不同,试验采用中性蛋白酶和酸性蛋白酶两种酶联合水解,以获取高的水解率。在一些实施方式中，所述蛋白酶复合物包括蛋白外切酶、蛋白内切酶和风味酶。在一些实施方式中，所述蛋白酶包括动物来源，植物来源和微生物来源。所述动物来源的蛋白酶包括胰蛋白酶、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶；所述植物来源的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶；所述微生物来源的蛋白酶包括型芽孢杆菌2709、放线菌166、稀土曲霉3.942，as1.389和as3.350。在一些实施方式中，所述蛋白内切酶选自包含木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、1.39中性蛋白酶、2709碱性蛋白酶和酸性蛋白酶的组。在一些实施方式中，所述蛋白外切酶选自包含米曲霉外切酶、黑曲霉外切酶和米曲黑曲外切酶的组。在一些实施方式中，所述风味酶包括酵母风味酶、乳酸菌风味酶和枯草杆菌风味酶。在一些实施方式中，所述蛋白酶复合物选自木瓜内切酶、菠萝蛋白酶、1.398中性蛋白酶、2709碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、米曲霉外切酶和酵母风味酶中的二种或多种。在一些实施方式中，所述蛋白酶复合物由米曲霉外切酶、木瓜内切酶和酵母风味酶组成。底物浓度，加酶量，酶解温度，ph值，时间等适当的条件是影响酶解效果的主要因素。在一些实施方式中，所述木瓜内切酶和酵母风味酶的摩尔百分组成比例为1:10～10:1。在一些实施方试中，所述米曲霉外切酶的用量为1000u/g，所述木瓜内切酶的用量为1000u/g，所述风味酶的用量为100u/g。在一具体实施方式中，所述木瓜内切酶和酵母风味酶的摩尔百分组成比例为4:4:2。在一些实施方式中，所述蛋白水解酶复合物水解黑木耳匀浆包括外切酶作用、内切酶作用。在一些实施方式中，所述蛋白水解酶复合物水解黑木耳匀浆还包括风味酶三个步骤。在一些实施方式中，所述外切酶作用时间为6～20小时，所述内切酶作用时间为20～100小时，所述风味酶作用时间为10～20小时。在一些实施方式中，所述外切酶作用时间为12小时，所述内切酶作用时间为60小时，所述风味酶作用时间为15小时。在一些实施方式中，所述蛋白内切酶的作用ph值为6.0～7.0。在一具体实施例中，所述蛋白内切酶的作用ph值为6.5。在一些实施方式中，所述蛋白外切酶的作用温度为50度到60度。在一些实施方式中，所述蛋白内切酶的作用温度为50度到60度。在一些实施方式中，所述蛋白风味酶的作用温度为50度到60度。在一些实施方式中，所述加热方式为蒸气加热。在一些实施方式中，所述加热方式为微波加热。在一些实施方式中，所述蛋白外切酶的加入量为30`80g蛋白酶每200g黑木耳。在一些实施方式中，所述黑木耳复合小分子肽粉是通过复合芽孢杆菌发酵获得。在一实施方式中，所述芽孢杆菌复合菌由枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组成，所述孢杆菌复合菌中的草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的菌体数目比例为1：:10～10:1。枯草芽孢杆菌是工业、农业和医药工业等领域广泛应用的一种细菌，中性蛋白酶作为枯草芽孢杆菌产生的一种重要产物，近年来在食品加工工业中的应用越来越引起人们重视。蜡样芽孢杆菌是产生碱性蛋白酶的一种重要菌株。黑木耳匀浆经过酶解后得到多肽产物具有由于黑木耳的理化特性包括1)良好的溶解性和高浓度下的低粘度；2)良好而耐酸和耐热稳定性；3)黑木耳多肽速溶型性好，ns1值高达85％。；4)黑木耳多肽具有良好的吸湿性、保湿性和凝胶软化功能。这些良好的理化特性是黑木耳多肽具有高消化吸收性、高抗氧化性、低抗原性，具有保护和改善人体机能、皮肤养护等多种功能。第一方面所制备的的黑木耳复合多肽的检测额方法包括：①水解度及氨基氮的检测用甲醛滴定法(gb/t14771-1993)。水解度的定义为黑木耳原料蛋白质中肽键被裂解的百分数,公式为:dh＝h/htot×100％＝(cnh2/cspiw)-c0nhi/htot×100％；式中h为水解后蛋白被裂解的肽键数mmol/g,htot为原料蛋白质的肽键数mmol/g；对特定蛋白质htot是一个常数,黑木耳蛋白htot＝7.8mmol/g。；cnh2为水解蛋白液中氨基酸态氮的含量mmol/l,cspiw为水解蛋白液中蛋白质的含量mg/ml,c0nh2原料蛋白质中游离氨基氮的含量mmol/g；对黑木耳蛋白,取值为0.33mmol/g。②多肽的检测采用毛细管电泳和凝胶渗透色谱法测其分子量。多肽分子量的确定。取多肽标准品按以上同样方法检测。凝胶渗透色谱检测测定分子量。另一方面，本发明提供了第一方面所述黑木耳复合小分子肽粉的制备方法在制备保护和改善人体机能的食品中的应用。在一些实施方式中，所述功能食品保护和改善人体机能包括:(1)被主动吸收，有助于迅速恢复体能；；(2)消除疲劳；(3)燃烧脂肪；(4)减轻运动引起的肌肉损伤；(5)调节血脂，降胆固醇；(6)提高免疫力；(7)促进小肠功能性障碍和术后营养物质吸收(8)降血压；(9)缓冲血糖上升；(10)抗氧化、延缓衰老；(11)抗过敏；(12)加速乙醇分解，减轻酒精的毒害作用；(13)提高注意力。在一些实施方式中，所述功能食品可以是含片。在一些实施方式中，所属功能食品可以是胶囊。本发明的制备方法获得的黑木耳复合多肽，具有显著的医学辅助治疗作用，具体表现有以下几方面：1、主动吸收，迅速恢复体能在蛋白质、肽和氨基酸三种形式的物质之间，蛋白质大分子最吸收难度最大。但是肽的被吸收速度比氨基酸快，因为活性肽是数个氨基酸分子的集合体，活性肽是数个氨基酸分子集中起来被整体吸收，而氨基酸需要一个一个地被吸收，活性肽能比氨基酸更迅速地被人体吸收。在恢复体力方面，活性肽也发挥着优异的功效。人体在进行激烈运动时，为了补给能量就需要消耗肌肉中的氨基酸。就是说，身体需要能量的时候就会从肌肉中获取。肌肉中的氨基酸被消耗掉后，肌肉组织就会受到损伤、肌肉产生疲劳感、难以发挥原有的力量。服用黑木耳活性多肽5分钟进入血液，10分钟转换为体能，在运动前、运动中补给活性肽可以给身体提供充足的能量，能够抑制肌肉力量的下降、长时间维持充沛的体力。2、消除疲劳大脑疲劳是由氧化血红蛋白浓度的上升引起的，服用木耳活性肽可以抑制氧化血红蛋白浓度的上升，因而能够缓和大脑的精神压力。3、燃烧脂肪活性肽具有阻碍脂肪吸收、加速脂肪分解、促进基础代谢的作用，可以增加饮食后能量的消耗、促进体内脂肪的燃烧。传统减肥常采取减少饮食、增加运动的方式，使体重下降，这种减肥方式减少的体重并不全是脂肪，常使体肌肉组织的蛋白也同时丧失，导致减肥者体质下降，身心健康受损，甚至体质过度衰弱。黑木耳低聚肽摄入后，快速进入血液，可满足运动者对蛋白质的代谢需求，防止肌肉、皮肤、血液等因运动消耗蛋白、肌肉受损现象的发生。活性肽可以解决“在生长激素分泌旺盛的时间段内补充蛋白质”的难题，具有快速、整体被吸收功能的特点，在摄取10分钟后，人体便可以有效地获得充分的蛋白源。3、减轻运动引起的肌肉损伤活性肽与氨基酸相比，活性肽被肠道吸收的速度更快，运动后食用木耳肽可迅速地补充蛋白质，由srt负荷引起的肌肉损伤及由此产生的肌肉疼痛、肿胀都明显减轻。通过循环的不断重复，肌肉就会变地越来越强壮起来。5、调节血脂、降胆固醇胆固醇和甘油三脂是血脂的主要成分，高脂血症导致动脉硬化，是冠心病、脑卒中、高血压最危险的病因。摄入活性肽后，可刺激人体内的甲状腺体，使甲状腺激素分泌量增加。甲状腺激素具有促进胆固醇酸化、阻碍肠壁对胆固醇吸收而加速排除体外的作用。活性肽对于降低人体胆固醇具有选择作用特性，当人体胆固醇处于正常值状态下，摄入活性肽对胆固醇无降低效应，高胆固醇患者摄入小分子肽后，则产生胆固醇降低效应，而且降低的脂蛋白类型属于对人体有害的低密度脂蛋白，对人体有益的、可以携带血脂分子到肝脏进行分解、排除体外的高密度脂蛋白作用。活性肽可增加褐色脂肪里面线粒体的活性，促进脂肪代谢。还能增加去甲肾上腺素的转化率，减少对脂肪酶的抑制，从而促进脂肪代谢。摄入黑木耳小分子肽，也可以起到防止血清胆固醇和血脂升高的作用。在用肠细胞做的培养试验表明：活性肽通过侵入胆固醇细胞、破坏了胆固醇的dna结构，抑制了胆固醇的增殖。6、提高免疫力的作用活性肽里含有可以提高免疫力的氨基酸。其中具有代表性的就是：精氨酸和谷氨酸。精氨酸可以增强免疫细胞中的大食细胞的免疫功能，同时攻击侵入体内的病毒。另外，大量病毒侵入人体的时候，谷氨酸可以产生免疫细胞、击退病毒。所以，活性肽能够改善机体的细胞免疫功能，它可以促进t淋巴细胞增殖，增强巨噬细胞的功能，增强nk细胞的活性。研究报道，活性肽还可以促进肿瘤坏死因子的产生。7.小肠发生功能性障碍和术后病人可吸收。8.降血压血管紧张素i在血管紧张素转换酶的作用下转变为血管紧张素ii，这种转换产物，能使末梢血管收缩作用增强，从使血压增高；活性肽具有抑制血管紧张素转换酶(ace)的活性、防止血管末梢收缩的功能，因此降血压效果显著。活性肽对正常血压人群没有影响，安全可靠，摄入后可保持原正常血压不变，不产生降压作用。而对高血压患者却可使血压达到正常水平。活性肽降压效果平稳，不会出现药物降压过程中的大幅波动，也没有药物降压危害肝、肾等其它器官的副作用，尤其对于原发性高血压患者有更为显著的效果。9、缓冲血糖上升活性肽是构成α-葡萄糖苷酶抑制素的有效成分。人体小肠中含有一种α-葡萄糖苷酶，主要功能是快速分解进入小肠的各种糖，供应人体对葡萄糖的需求。活性肽构成的α-葡萄糖苷酶抑制素具有阻止、延缓α-葡萄糖苷酶对淀粉、蔗糖、低聚糖等碳水化合物的降解作用，缓解碳水化合物向葡萄糖转化、进入血液、导致血糖升高现象，从而达到降低血糖指标的目的，防止血液中血糖上升引起的并发症。由于摄入活性肽产生的降血糖机理与胰岛素分泌无关，不增加胰岛素功能负担，因此活性肽是缓冲人体血糖指标上升的安全可靠的保健食品。10、抗氧化、延缓衰老活性肽可以提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性，抑制脂质过氧化，清除羟自由基，有利于减少组织氧化，保护机体。维护细胞正常代谢，延缓细胞衰老，使人延年益寿。同时加速受损细胞修复，保持肌体活力，减少色素沉着的发生，从而阻止和推迟"寿斑"的出现。11、抗过敏过敏反应是现代社会的一种流行致病因素，人体对分子量在3400以下的活性肽无过敏反应，活性肽为恢复期病人、消化功能减退的老年人，特别是对牛乳蛋白过敏的婴幼儿，以及容易引起食物过敏的人们提供了安全、无过敏反应的蛋白营养源。12、加速乙醇分解，降低酒精的毒害作用活性肽可以提高血液中的丙氨酸和亮氨酸的含量，在丙氨酸和亮氨酸的共同作用下，可有效的降低血液中的乙醇浓度，加速乙醇分解，降低酒精的毒害作用。亮氨酸可使积聚脑组织的酒精，降低对骨骼的麻痹与异常收缩的作用，减少饮酒者的行为失常、失语等酒精中毒现象的发生。饮酒前摄入活性肽5～10g，可使经验饮酒上限值提高1.5～2倍，所以活性肽对于防止醉酒、避免酒精中毒、防止乙醇伤害身体具有实际保护作用。13、有提高注意力的功效实验证明，食用活性肽20分钟后，「α2波」脑波增加了，这有助于提高注意力，使得思路明晰、精神轻松。本发明的黑木耳复合多肽的制备方法以价格低廉的黑木耳为原料，经过微生物发酵转变成高附加值、高营养的疾病辅助治疗多肽产品，成本低、回报高、适用广、具有广阔的市场前景，包括：1、解决食用吸收率低的问题，吸收率大大提高。2、解决食用过程工序繁琐的问题，克服了黑木耳食用前需要一个个小时以上浸泡时间，然后才能烹制的缺陷。3、通过微粉加工和酵素分解，保健功能得到极大加强4、制成胶囊和饮片，携带方便，食用方便。附图说明、图1黑木耳破碎匀浆经过酵素产生的复合蛋白酶解的毛细管电泳结果图2.多肽的分子量标准(注:i2512(mw),ii6214(mw),iii8159(mw),iv10700(mw),v14404(mw),vi16949(mw))图3标准分子量工作曲线图4蛋白微波酸解多肽凝胶渗透色谱具体实施方式下面的实施例用来进一步说明本发明，而不应该是对本发明范围的限制：实施例一：黑木耳多肽干粉的制备1.取黑木耳100公斤，挑选、清洗，在机械辊筒中破碎。加入黑木耳重量5倍55℃的蒸馏水，于高压均质机中，破碎黑木耳组织破碎匀浆2小时。2.用6.0mol/lhcl溶液，控制ph值5.5。按照底物质量浓度为5％，按米曲霉外切酶用量8％，木瓜蛋白酶液用量15％，在55℃恒温条件下，米曲霉风味酶用量5％，先后用是外切酶作用20小时，木瓜蛋白酶作用60小时，米曲霉风味酶作用10小时。3.冷却至室温，3000r/min离心5分钟，上清液70℃灭酶50分钟，减压浓缩，得到多肽浓缩液；将离心剩余残渣加入3-5倍的55℃蒸馏水，进行2次酶消化，方法与以上步骤2相同。(6)分离纯化，用特殊方法，将小分子肽液体中的残留酶和其它物质分离开，小分子肽液提取完成，其分子量在180至480道尔顿。(7)用反渗透浓缩设置除去水分，成为湿粉，用微波真空机干燥或喷雾干燥成干粉。实施例二.黑木耳多肽的检测1材料与方法1.1原料及仪器实施例一的黑木耳分离蛋白匀浆液，,蛋白含量≥89％；中性蛋白酶,无锡杰能科生物工程有限公司,雪梅牌(食品级)；碱性蛋白酶,无锡杰能科生物工程有限公司,雪梅牌(食品级)；多肽分子量标准,amershambio2sciences公司,毛细管电泳专用；微波炉,lg电子电器有限公司,ms22089t；甲醛,西安化学试剂厂,分析纯；高效毛细管电泳仪,ce2212,北京大学制造；凝胶渗透色谱仪,24142515,美国waters。检测方法1.水解度及氨基氮的检测用甲醛滴定法(gb/t14771-1993)。水解度的定义为原料蛋白质中肽键被裂解的百分数,公式为:dh＝h/htot×100％＝(cnh2/cspiw)-c0nhi/htot×100％；式中h为水解后蛋白被裂解的肽键数mmol/g,htot为原料蛋白质的肽键数mmol/g；对于某一的特定蛋白质htot是一个常数,黑木耳蛋白htot＝8.8mmol/g；cnh2为水解蛋白液中氨基酸态氮的含量mmol/l,cspiw为水解蛋白液中蛋白质的含量mg/ml,c0nh2原料蛋白质中游离氨基氮的含量mmol/g；对黑木耳蛋白,取值为0.43mmol/g。2.多肽的检测采用毛细管电泳和凝胶渗透色谱法测其分子量2高效毛细管电泳检测1)多肽的检测。将蛋白分解物溶于(60mmol/ltris/hcl+1％sds+5％22巯基乙醇,ph值＝6.0)的混合液中,置沸水中5min,离心分离10min(4000r/min),取上清液经0.45μm滤膜过滤,超声脱气后进样分析。石英毛细管分别以双蒸水、0.1mol/lnaoh、0.1mol/lhcl冲洗3min后,用缓冲液(100mmol/ltris/hcl+0.1％sds+0.1％peo,ph值＝8.5)冲洗至基线平稳,不加样品运行缓冲液5min,然后以气动进样的方式进样10s,加电压10kv运行,阴极紫外(214nm)检测。结果见图1。从图1可以看出:保留时间10.44、11.90、13.22、14.19、14.70、16.16、19.38min处出现肽峰,且峰形独立,无拖尾现象,说明分离效果良好。2多肽分子量的确定。取amershambiosciences公司多肽标准品按以上同样方法检测,结果见图2。对比图1、2可看出:其中10.44、11.90min肽峰位于2512da以下,说明分解物中含有分子量低于2512da的小分子肽；13.22、14.19min肽峰位于2512～6214标准峰,说明分解物中含有分子量位于2512～6214da的肽；14.70、16.16min肽峰位于6214～8159标准峰,说明分解物中含有分子量位于6214～8159da的肽；19.38min肽峰位于8159～10700标准峰,但靠近8159标准峰,说明分解物中含有少量分子量大于8159da的肽。另外黑木耳大豆蛋白分解后的多肽分子量集中在2000～8000。相比蛋白质大分子量来说(100000～600000da[6]),所得的多肽已经在小分子量范围以内。3凝胶渗透色谱检测3.1凝胶渗透仪器系统。waters2414视差折光检测器(refractiveindexdetector)；515高压梯度泵；7725i手动进样器；凝胶色谱柱:ultranydrogeltmlinear7.8×300mmcolumn。色谱条件:流动相0.1mnano3,柱温35℃,流速0.8ml/min。标准样品:聚乙二醇分子量标准(ploycethylenegloycolmolecularweight),产地为polmerstandardsservice2usa,范围为106、194、440、628、960、1460、4290、7130、12900、20600。2标准曲线的制作。将标准样品用流动相配制成0.01％的溶液,经0.45μm微孔滤膜过滤后分别进样,以标准分子量的对数lnmw对保留时间作图,可得到标准分子量工作曲线,如图3。3样品测试结果。将蛋白分解产物用高纯水浸泡过夜,4000r/min离心分离后取上清液,经0.45μm滤膜过滤,超声脱气后进样分析,结果见图4将图3、4对照可知,25～40min出现6个肽峰(40min以后小分子峰无法积分出),用millennium32色谱工作站积分可得,分子量分别是12826、3735、1389、945、481、121da,且大分子量分子含量较少,多数已集中在小分子量阶段,与毛细管电泳检测结果相似。且有更低分子量的分子存在,应是水解过程中产生的氨基酸小分子。采用多次、间断微波加热,每次1min,在较短的时间(15min)内不会使蛋白酶失活。采用多次、间断微波加热,每次1min,在较短的时间(15min)内不会使蛋白酶失活实施例三.黑木耳多肽用于制备颗粒剂将步骤3所得浓缩液充分混匀，喷雾干燥。1.用制粒机将实施例一所得黑木耳小分子活性肽干粉制成一定规格的颗粒，用真空包装机包装成所需要的各种定量包装制成颗粒剂。5.颗粒剂的包装：5g/袋，20袋/盒。用法用量：早晚各一次，每次1袋，温开水冲服。实施例四黑木耳多肽复合功能口服液的制备实施例一所得黑木耳多肽浓缩液和大枣及生姜提取液充分混匀充分混合调配，乳化，灌装，巴氏灭菌，贴标后出厂。将实施例一所得黑木耳多肽浓缩液和大枣及生姜提取液充分混匀，黑木耳小分子肽含量在150mg/100ml以上，黑木耳、大枣、鲜姜原料比例10：15：1.3，产品可溶性固形物3.4g/100g以上。木耳多肽产品功能验证实例1.恢复体能和减轻运动引起的肌肉损伤的验证试验人群分组：验证组60名健康成年人，25～40周岁，男30名，女30名，对照组40人，25～40周岁，男20名，女30名。试验方法：验证组60名健康成年人和对照组40人分别参与同一场50000米跑步，比赛前验证组服用实施例的功能饮料，对照组未服用该功能饮料。2万米后，验证族仍能保持原速度前进，而对照组的运动员运动速度开是减慢。验证组在比赛结束后剂58人无肌肉损伤及由此产生的肌肉疼痛、肿胀感觉，2人有轻微酸胀感觉；对照组38人感觉重度到中度肌肉疼痛、肿胀。结果表明，在运动前、运动中补给活性肽可以给身体提供充足的能量，能够抑制肌肉力量的下降、长时间维持充沛的体力。2.消除大脑疲劳的验证试验人群分组：验证组60名健康成年人，25～40周岁，男30名，女30名，对照组40人，25～40周岁，男20名，女30名。试验方法：安排验证组60名健康成年人和对照组40人都参与阅读4小时，验证组在阅读前服用实施例的功能饮料，对照组未服用该功能饮料。4小时阅读结束后，检测验证组60名健康成年人和对照组40人的血液氧化血红蛋白浓度的上升。结果，验证组60名健康成年人只有5人的血液氧化血红蛋白比例上升1～3％，对照组40名健康成年人有35的血液氧化血红蛋白比例上升20～30％。3.阻碍脂肪吸收、加速脂肪分解、促进基础代谢的验证试验人群分组：验证组60名肥胖成年人，25～40周岁，男30名，女30名，对照组40名肥胖成年人，25～40周岁，男20名，女20名。试验方法：安排验证组60名健康成年人和对照组40人都参与服用试验，每日服用200ml实施例的功能饮料代替午餐，对照组未服用该功能饮料。3个月后，验证组56人肥胖体型显著，对照组未有改观。4.调节血脂、降胆固醇功能的验证取雄性小鼠60只，按体重随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型组、具体实施例1-4。正常组，饲喂普通蒸馏水；模型组，饲喂高脂饲料(1％胆固醇、0.5％猪胆盐、12％猪油，基础饲料86.5％)喂养；模型组给予深海鱼油(5mg/kg)，每天两次，每次2毫升；具体实施例1-4，饲喂高脂饲料(1％胆固醇、0.5％猪胆盐、12％猪油，基础饲料86.5％)喂养；具体实施例1-5组，饲喂具体实施例1-4内容物(5mg/kg)，每天两次，每次2毫升；连续喂养3周。每日一次，连续给药21天，末次给药后1.5h(禁食12h)，小鼠摘眼球取血，分离血清，以试剂盒方法测tg、tc。统计学分析所有实验数据均以mean±sd表示，采用t检验进行统计学分析，p＜0.05认为有统计学差异。实验结果统计学分析所有实验数据均以mean±sd表示，采用t检验进行统计学分析，p＜0.05认为有统计学差异。实验结果#p＜0.01vs正常组；*p＜0.05，**p＜0.01vs模型组小结：具体实施例1-4的内容物能显著降低总胆固醇(tc)和甘油三酯(tg)的含量，而且具体实施例4中内容物组分的合用具备协同增效作用。5.提高免疫力功能的验证对小鼠腹腔巨噬细胞功能/活性的影响)试验用动物：试验动物为昆明小鼠，雌雄各半，体重18～22克。取实验用昆明小鼠随机分成4组，空白组每天正常喂食，实验组3组，给予受试产品(实施例1-3制备的组合物)，每日给药2次，10天后，于末次给药后30分钟(空白组于喂食后30分钟)，各组小鼠腹腔注射6％鸡红细胞悬液1.5ml/只，抽取小鼠腹腔液，于显微镜下观察，记录5分钟内视野中巨噬细胞吞噬鸡红细胞数，并以公式：吞噬百分率＝被吞噬的红细胞数/视野内的红细胞总数×100％；吞噬指数＝被吞噬的红细胞总数/视野内的巨噬细胞数。计算吞噬百分率，实验结果见下表。小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响表两组疗效比较组别吞噬百分率吞噬指数空白组25.2±3.890.41±0.15实施例1组46.4±5.130.62±0.13实施例2组49.7±4.650.69±0.35实施例3组52.9±6.250.72±0.23从上表数据可以看出实验组的小鼠在连续使用本发明药物后，巨噬细胞的总数得到小幅度增强，同时巨噬细胞的活性得到大幅度的提升，可见本发明的药物组合物具有良好的增强抵抗力的作用。6.缓冲血糖上升的功能验证invivo评价买进7周大小的雄性sd系大白鼠(charlesriver公司)后，进行1周的预备饲养(饲料用mf颗粒(东洋酵母社制造)，然后用于实验。将实施例1所得到的活性肽组合物(20mg/ml)溶解于去离子水1ml制成样品溶液，用营养导管，经口送入绝食16小时后的大白鼠胃部。5分钟后，强行经口投入糖质(麦芽糖2g/kg)，糖质负荷后0分、30分、60分、以及120分钟后从尾部静脉采血。将得到的血液马上进行血糖测定(葡萄糖测试pro、三和化学研究所)。而对照组则用水代替蜂巢蜡胶溶液。抑制血糖升高的效果是根据不同时段测定血中葡萄糖量，比较血糖升高面积(auc)判断的。血糖升高面积根据下式算出：auc(h*mg/dl)＝(a+2b+3c+4d)/4-2a上式中a、b、c以及d，分别意味着0分、30分、60分、以及120分钟后的血糖值。数值用平均值±标准偏差表示，2组间有效差的测定，根据student的t检验进行。结果如表3所示。表中的n表示样品数。表及图中的**表示以不足1％的危险率与对照组比较的有效差。表3与糖质负荷中仅用水的对照组相比，蜂巢蜡胶的50％甲醇溶离组分的确具备有效的抑制血糖升高的效果，该效果可有效地持续到糖质负荷60分钟后，而对于auc，对照组为130.7±8.3h*mg/dl、50％甲醇溶离组分为80.7±4.2h*mg/dl。根据该auc比较，血糖升高抑制率为38.3％。7.活性肽同时具有肾素抑制活性和ace抑制活性从而具有降血压功能的验证ace抑制活性检测方法如下:在比色杯中加入1ml0.5mmfapgg(全称n-[3-(2-furyl)acryloyl]-l-phenylalanyl-glycyl-glycine)(溶解在50mmtris-hcl缓冲液，含0.3mnacl,ph7.5)，20μlace(1u/ml,最终活力20mu)，200μl降血压黑木耳活性肽溶液(蛋白浓度为1mg/ml；溶剂为50mmtris-hcl缓冲液，含0.3mnacl,ph7.5)，混匀室温下，2min内测定345nm下吸光值的降低速率.空白以tris–hcl缓冲液代替样品.根据以下公式计算ace抑制活性：ace抑制活性(％)＝1-[△a.min-1(样品)/△a.min-1(空白)]×100％，其中，△a.min-1(样品)和△a.min-1(空白)分别是表示样品和空白的ace活性抑制速率。肾素抑制活性的检测方法如下:降血压菜籽黑木耳活性肽抑制血管紧张素活性的体外测定根据肾素活性试剂盒(购买于caymanchemical，编号10006270)提供方法，按以下步骤测定：96-孔板中依次加入(1)空白：20μl底物,160μl测试用缓冲液,10μl纯水；(2)空白对照：20μl底物,150μl测试用缓冲液,和10μl纯水；(3)样品：20μl底物,150μl测试用缓冲液,和10μl样品。之后分别在每个孔(除空白外)中加入10μl肾素启动反应。96-孔板室温下震荡10s，在37℃下预热15min，在10min内测定样品的荧光强度，激发波长340nm,发射波长490nm，根据以下公式计算样品的肾素抑制活性：其中，100％抑制速率(空白对照)和抑制速率(样品)分别是表示空白对照和样品在10min内的肾素活性抑制速率。其中测试用缓冲液的制备：(1)配制缓冲液：50mmtris-hcl缓冲液，含0.1mnacl,ph8.0；(2)将降血压菜籽活性肽溶解于该缓冲液中，制成蛋白浓度为1mg/ml的溶液，即为测试用缓冲液。采用上述方法制备的降血压菜籽黑木耳活性肽的ace抑制活性50.84％、肾素抑制活性75.31％，在降血压方面具有很好的应用前景。8.抗氧化延缓衰老的功能验证抗氧化实验：为了验证本发明的产品是否具有抗氧化的功能性，本发明样品选择实施例1样品进行临床试验，测试过程如下。受试对象100例年龄40～60岁、身体健康志愿者进行测试。检测方法：实验组：50位志愿者按推荐服用方法(每日2粒，一日2次)、服用量每日服用受试产品；对照组：另外50位志愿者作为对照组服用安慰剂(维生素e)。连续服用30天。所有受试者在试验期间，坚持原生活，饮食不变。测试结束后测试将受试者服用前后血液中丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的含量进行对比。表1：血清中mda、sod和gsh-px水平的检测结果表注：与试食前比较，ap＜0.05；与对照组比较，bp＜0.05。从表1的结果可知：50位服用安慰剂的志愿者血清丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的含量水平无明显变化；试验后试食组血清中sod活力明显升高，与同期对照组及自身试验前比较，差异有统计学意义(p＜0.05)。此外，所有志愿者在试验过程中及试验结束后6个月内，均未出现影响机体健康的反应。综合判定本实施例1的组合物具有抗氧化功能。延缓衰老试验：为了验证本发明的产品是否具有延缓衰老的功能性，本发明样品进行人体临床测试，测试过程如下：选取皮肤暗淡、粗糙的30～50岁女性70人，随机等分为发明组和对照组，对照组采用市售普通天然维生素e软胶囊，发明组采用实施例1的产品组合物。使用方法为：取压缩面膜纸浸入清水中浸泡，将软胶囊刺破，将软胶囊内液体滴入清水中，然后将面膜纸在清水与软胶囊芯液的混合液中浸泡5分钟，取出面膜纸，打开敷在脸上，15分钟后取下面膜纸，用温水将脸洗净即可，每晚一次。每组试验者所用其他脸部护肤品相同，坚持原生活、饮食不变。使用30天后，对照组有18人的脸部皮肤较使用前细腻、变白并有光泽，发明组有26人的脸部皮肤较使用前细腻、变白并有光泽。由此可知，本发明所得组合物可改良皮肤品质，延缓衰老，且效果明显好于现有市售普通天然维生素e软胶囊。此外，所有志愿者在试验过程中及试验结束后6个月内，均未出现影响机体健康的反应，可应用与制备用于抗氧化、延缓衰老的保健品。9.加速乙醇分解的功能验证——针对呼气酒精浓度改善以6名平均年龄28岁的男性人分2次进行实验，每次实验间隔大于72小时。实验4:空腹，饮42度白酒90ml，酒前饮纯净水300ml。实验5:空腹，饮42度白酒90ml，酒前饮该配方醒酒饮300ml。实验6:空腹，饮42度白酒90ml，酒前饮以实施例的黑木耳活性肽功能一和你聊为主的解酒饮300ml。结论：该配方对酒精呼气浓度具有改善作用，即对乙醇脱氢酶活性具有促进作用，可有效提升乙醇分解效率。该配方最终可通过溶水饮用后具有激发乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶活性，同时调理体质，从而醒酒护肝的功能。10.提高注意力的功能验证本发明组合物干预注意力的临床观察征集20位自述注意力难以集中的成年人，年龄在19-50岁之间。采用舒尔特方格量表评估志愿者注意力，并按注意力随即均分为2组，1组为治疗组，2组为对照组。治疗组患者每天食用营养糊30g，其中按实施例3制备的本发明组合物在营养糊中比例为16％。对照组给予不含本发明组合物的营养糊30g。营养糊由红豆、玉米等组成。志愿者食用1个月后再次采用量表进行注意力评估。结果如表2。表2本发明组合物对干预注意力的临床观察注：与对照组比较：*p＜0.05；**p＜0.01实验结果：食用含有16％本发明组合物的营养糊，可显著提高注意力不集中人群的注意力量表评分，证明本发明组合物具有较好的提高注意力作用。当前第1页12