本发明涉及食品生物技术领域，尤其涉及一种用于酸菜腌制的直投式复合乳酸菌发酵剂的制备方法。
背景技术：
我国是蔬菜生产大国，腌渍酸菜就起源于我国，最早可追溯到北魏贾思勰所著的《齐民要术》，“收菜时，即择取好者，菅、蒲束之。作盐水，令极咸，于盐水中洗菜，即内翁中。”
几千年来，我国一直沿用古人的蔬菜腌渍方法，用高浓度盐水将新鲜白菜浸没，于坛中密封发酵一月以上即可食用，得到的酸菜产品香气醇正，酸爽可口，开胃解腻，广受全国人民尤其是东北地区人民的欢迎，但是随着社会的现代化工业化发展，传统的酸菜腌制方法的缺点也随之日益凸显，例如发酵周期长，产品质量不稳定，发酵易腐败变质，产品亚硝酸盐含量高，不易于工业化、标准化、规模化生产等，都在制约着酸菜企业的发展。
国外对发酵剂的研究从上世纪八十年代就已经开始，而我国在这个领域研究还比较少，也没有真正应用于工业化生产，利用乳酸菌发酵剂来发酵酸菜可以有效的控制产品质量，受季节影响较小。
技术实现要素：
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种用于酸菜腌制的直投式复合乳酸菌发酵剂的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种用于酸菜腌制的直投式复合乳酸菌发酵剂的制备方法，包括以下步骤：
分别将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌及鼠李糖乳杆菌分别扩大培养，离心弃掉上清，菌泥加入保护剂经真空冷冻干燥制得粉末，按照一定比例混合均匀，即可用于酸菜发酵。
优选的，所述的保护剂的配方为：10％～15％脱脂乳，2～5％海藻糖，0.5～2％麦芽糊精，0.8％～1.2％甘油(以加入到菌泥后的重量百分比计)。
优选的，所述的复合乳酸菌发酵剂中，植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌：鼠李糖乳杆菌的比例为1～1.2:1:0.8～1。
优选的，所述的植物乳杆菌为发明人培育的一株植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，效果更佳。该株植物乳杆菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.16478，保藏日期：2018年9月17日。
一种用于酸菜腌制的直投式复合乳酸菌发酵剂的制备方法，包括以下具体步骤：
a、发酵菌株的选择及培养基的制备
本发明所述复合乳酸菌发酵剂所选菌种为：植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，鼠李糖乳杆菌；
选用mrs液体培养基：蛋白胨8～15g，酵母膏3～8g，柠檬酸二铵1～3g，牛肉膏8～12g，葡萄糖15～25g，吐温800.5～2ml，乙酸钠3～6g，磷酸氢二钾1～3g，硫酸镁0.1～0.3g，硫酸锰0.03～0.08g，溶于1000ml蒸馏水，固体培养基则另加12～18g琼脂粉，120～125℃灭菌15～25分钟；
b、直投式用于酸菜腌制的直投式复合乳酸菌发酵剂的制备
b.1菌种的活化
将三种乳酸菌菌粉分别于35～38℃水浴中复水8～12min，接种到mrs液体培养基中，35～38℃厌氧培养18～30h，接种到mrs固体平板上，35～38℃培养2～3天，用接种环挑取单菌落于mrs液体培养基中，35～38℃厌氧培养18～22h，以1.2～1.8％的接种量接种于mrs液体培养基中，重复转接两次即完成活化；
b.2菌种的扩大培养
将活化好的菌种以1.2～1.8％的接种量接种于40mlmrs液体培养基中，35～38℃厌氧培养18～22h，继续以1.2～1.8％的接种量接种于400mlmrs液体培养基中，35～38℃厌氧培养18～22h，检测乳酸菌数量≥109个/ml，若未达到数量要求则需继续培养；
b.3菌种冻干粉末的制备
收集三种乳酸菌发酵液，4℃条件下5000～7000r/min离心8～12分钟，弃上清，收集菌体沉淀，用冻干保护剂洗脱沉淀，保护剂：沉淀＝2～3:1；收集保护剂和菌泥混合物，铺到平板中，厚度在1.5～2cm，-85～-75℃冷冻过夜，用真空冷冻干燥机进行真空冷冻干燥，冷阱温度-55～-45℃，真空度1pa，冷冻干燥18～30h，得到乳酸菌粉末；
b.4直投式发酵剂的复配
将三种乳酸菌粉末按照重量称取，按照比例分别称取三种乳酸菌粉末，并混合均匀，得到复合乳酸菌发酵剂；
c、直投式发酵剂的使用方法
上述制备的直投式复合乳酸菌酸菜发酵剂的使用方法如下：挑选新鲜、完整、无腐烂变质的白菜8～12kg，晾晒两天除去水分，去除外层叶片，去除根部，清洗整理码入坛中，压实，将自来水煮沸冷却，配制质量分数为1～3％的食盐水10kg，称取1～3g复合菌粉发酵剂，倒入盐水中，充分混匀，将盐水注入坛中，没过白菜15cm为宜，密封坛口，坛口周围水封以隔绝氧气，于20～23℃下发酵发酵22～25天。
优选的，加入的菌粉量为白菜重量的0.01～0.03％。
本发明的有益之处在于：本发明提供了一种用于酸菜腌制的直投式复合乳酸菌发酵剂的制备方法，包括以下步骤：分别将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌及鼠李糖乳杆菌分别扩大培养，离心弃掉上清，菌泥加入保护剂经真空冷冻干燥制得粉末，按照一定比例混合均匀，即可用于酸菜发酵。本发明的直投式复合乳酸菌发酵剂，与传统的酸菜发酵剂的主要区别在于：一是采用植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，鼠李糖乳杆菌复合使用，二是可以以直投的方式应用于酸菜发酵中，效果方面：三种菌种具有协同作用，使用后，酸菜中的乳酸、维生素c、甘露醇和乙酸含量均为显著提高。采用发明人培育的植物乳杆菌，得到的酸菜样品中的乳酸、维生素c、甘露醇和乙酸含量均有明显提高。
具体实施方式
实施例1：
1、发酵菌株的选择及培养基的制备
发酵菌株：植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，鼠李糖乳杆菌。
所述的植物乳杆菌菌粉为保藏号为cgmccno.16478的植物乳杆菌菌粉，嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌为市场采购。
选用mrs液体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，柠檬酸二铵2g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，吐温801ml，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，溶于1000ml蒸馏水，固体培养基则另加15g琼脂粉，121℃灭菌20分钟。
2、用于酸菜腌制的直投式复合乳酸菌发酵剂的制备
2.1菌种的活化
将三种乳酸菌菌粉分别于37℃水浴中复水10min，接种到mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h，接种到mrs固体平板上，37℃培养3天，用接种环挑取单菌落于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养20h，以1.5％的接种量接种于5mlmrs液体培养基中，重复转接两次即活化完成。
2.2菌种的扩大培养
将活化好的菌种以1.5％的接种量接种于40mlmrs液体培养基中，37℃厌氧培养20h，继续以1.5％的接种量接种于400mlmrs液体培养基中，37℃厌氧培养20h，检测乳酸菌数量≥109个/ml。
2.3菌种冻干粉末的制备
收集三种乳酸菌发酵液，4℃条件下6000r/min离心10分钟，弃上清，收集菌体沉淀，用冻干保护剂洗脱沉淀，保护剂：沉淀＝3:1，保护剂的配方为：10％脱脂乳，4％海藻糖，1％麦芽糊精，0.8％～1.2％甘油，收集保护剂和菌泥混合物，铺到平板中，厚度在2cm，-80℃冷冻过夜，用真空冷冻干燥机进行真空冷冻干燥，冷阱温度-50℃，真空度1pa，冷冻干燥24h，得到乳酸菌粉末。
2.4直投式发酵剂的复配
将三种乳酸菌粉末按照重量称取，按照植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌：鼠李糖乳杆菌＝1.2:1:0.8的比例分别称取三种乳酸菌粉末，并混合均匀，得到复合乳酸菌发酵剂。
3、乳酸菌发酵剂的应用
挑选新鲜、完整、无腐烂变质的白菜10kg，晾晒两天除去水分，去除外层叶片，去除根部，清洗整理码入坛中，压实，将自来水煮沸冷却，配制质量分数为2％的食盐水10kg，称取2g上述复合菌粉发酵剂，倒入盐水中，充分混匀，将盐水注入坛中，没过白菜15cm为宜，密封坛口，坛口周围水封以隔绝氧气，于20～23℃下发酵24天。
实施例2：
1、发酵菌株的选择及培养基的制备
发酵菌株：植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，鼠李糖乳杆菌。
选用mrs液体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，柠檬酸二铵2g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，吐温801ml，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，溶于1000ml蒸馏水，固体培养基则另加15g琼脂粉，121℃灭菌20分钟。
2、用于酸菜腌制的直投式复合乳酸菌发酵剂的制备
2.1菌种的活化
将三种乳酸菌菌粉分别于37℃水浴中复水10min，接种到mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h，接种到mrs固体平板上，37℃培养3天，用接种环挑取单菌落于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养20h，以1.5％的接种量接种于5mlmrs液体培养基中，重复转接两次即活化完成。
2.2菌种的扩大培养
将活化好的菌种以1.5％的接种量接种于40mlmrs液体培养基中，37℃厌氧培养20h，继续以1.5％的接种量接种于400mlmrs液体培养基中，37℃厌氧培养20h，检测乳酸菌数量≥109个/ml。
2.3菌种冻干粉末的制备
收集三种乳酸菌发酵液，4℃条件下6000r/min离心10分钟，弃上清，收集菌体沉淀，用冻干保护剂洗脱沉淀，保护剂：沉淀＝3:1，保护剂的配方为：10％脱脂乳，4％海藻糖，1％麦芽糊精，0.8％～1.2％甘油，收集保护剂和菌泥混合物，铺到平板中，厚度在2cm，-80℃冷冻过夜，用真空冷冻干燥机进行真空冷冻干燥，冷阱温度-50℃，真空度1pa，冷冻干燥24h，得到乳酸菌粉末。
2.4直投式发酵剂的复配
将三种乳酸菌粉末按照重量称取，按照植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌：鼠李糖乳杆菌＝1:1:1的比例分别称取三种乳酸菌粉末，并混合均匀，得到复合乳酸菌发酵剂。
3、乳酸菌发酵剂的应用
挑选新鲜、完整、无腐烂变质的白菜10kg，晾晒两天除去水分，去除外层叶片，去除根部，清洗整理码入坛中，压实，将自来水煮沸冷却，配制质量分数为2％的食盐水10kg，称取3g上述复合菌粉发酵剂，倒入盐水中，充分混匀，将盐水注入坛中，没过白菜15cm为宜，密封坛口，坛口周围水封以隔绝氧气，于20～23℃下发酵22天。
对比例1
将实施例1中的复合乳酸菌发酵剂替换为植物乳杆菌，乳杆菌的总用量与实施例1的用量相同，其余制备方法不变。
对比例2
将实施例1中的复合乳酸菌发酵剂替换为嗜酸乳杆菌，乳杆菌的总用量与实施例1的用量相同，其余制备方法不变。
对比例3
将实施例1中的复合乳酸菌发酵剂替换为鼠李糖乳杆菌，乳杆菌的总用量与实施例1的用量相同，其余制备方法不变。
对比例4
将实施例1中的复合乳酸菌发酵剂替换为同样比例的植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌，乳杆菌的总用量与实施例1的用量相同，其余制备方法不变。
对比例5
将实施例1中的复合乳酸菌发酵剂替换为同样比例的嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，乳杆菌的用量与实施例1的用量相同，其余制备方法不变。
对比例6
将实施例1中的复合乳酸菌发酵剂替换为同样比例的植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，乳杆菌的用量与实施例1的用量相同，其余制备方法不变。
对比例7
中国发明专利：一株用于直投式酸菜发酵的干酪乳杆菌及其液体培养基，专利号201510149247.4实施例中公开的酸菜发酵方法得到的样品。
对比例8
将实施例1中的保藏号为cgmccno.16478的植物乳杆菌菌粉替换为五种市场采购的不同的植物乳杆菌菌粉，其余制备方法不变。检测数据采用五种市场采购的不同的植物乳杆菌菌粉中的最佳值，例如发酵21天时的乳酸含量分别为(8.6，8.6，8.2，8.5，8.8)g/l，取8.8g/l。
五种市场采购的不同的植物乳杆菌菌粉厂家分别为：
山东向日葵生物科技有限公司、江苏绿科生物技术有限公司、苏州北纳创联生物技术有限公司、韶关市颐林泉生物科技有限公司和郑州百益宝生物技术有限公司。
对照例
天然酸菜发酵样品。
以下表1为对实施例1以及对比例1-8和对照例的检测数据。
表1：酸菜样品的检测数据；
由以上检测数据可以知道，本发明的复合乳酸菌发酵剂中，植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌之间有协同作用。而采用发明人培育的植物乳杆菌(保藏号为cgmccno.16478)，得到的酸菜样品中的乳酸、维生素c、甘露醇和乙酸含量均有明显提高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。