本发明涉及肽的制备，尤其是一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法。
背景技术：
：鳕鱼，是鳕科（gadidae）鱼类及鳕形目（gadiformes）其他科部分鱼类的统称，有50多种，是主要食用鱼类之一。鳕鱼原产于从北欧至加拿大及美国东部的北大西洋寒冷水域。21世纪初，鳕鱼主要出产国是加拿大、冰岛、挪威及俄罗斯，日本产地主要在北海道。鳕鱼是经济价值较高的高档鱼类，常将其鱼肉用于煎制等用途。然而其鱼鳞和鱼皮往往得不到良好的利用，往往只能作为下脚料加工成肥料或者饲料，其经济附加值较低。目前，可以将其鱼鳞和鱼皮制备成胶原蛋白肽，然而该胶原蛋白肽在水中的分散性较差，难以作为高档的口服液等用途来进行使用。技术实现要素：为了克服现有鳕鱼胶原蛋白肽在水中的分散性差的不足，本发明的目的在于提供了一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法。在本发明的一个方面，提供了一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：（1）将鳕鱼鳞片依次在清水、1-5%的碳酸氢钠溶液、1-3%的柠檬酸溶液、1-5%的edta溶液中清洗；（2）将步骤1中得到的清洗后的鳕鱼鳞片中加入蛋白酶，并且在40-50摄氏度下，ph为6-8下水解3-5小时并且随后灭活，离心并且取得上清液；（3）将步骤2得到的上清液脱盐，分离弃去1000da以下的组分，冻干并且得到鳕鱼胶原蛋白肽干粉，取用100重量份，并且溶解到10000-20000重量份的水中；（4）将步骤3的溶液加热到30-40摄氏度，ph调节到7.5-8.5，随后加入三聚磷酸钠1-5重量份，并且搅拌反应2-5小时；（5）收集步骤4的反应液，脱盐并且冻干得到磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽。在本发明优选的方面，在步骤1中，将鳕鱼鳞片依次在清水、2%的碳酸氢钠溶液、2%的柠檬酸溶液、3%的edta溶液中清洗，每次清洗15分钟。在本发明优选的方面，在步骤2中，在42摄氏度下，ph为7.2下水解4.5小时并且随后灭活，离心并且取得上清液。在本发明优选的方面，在步骤2中，所述的蛋白酶是中性蛋白酶和碱性蛋白酶按照1:1-3重量比配置成的。在本发明优选的方面，在步骤2中，所述的蛋白酶是中性蛋白酶或者碱性蛋白酶。在本发明优选的方面，在步骤3中，所述的分离采取凝胶排阻色谱或者透析方法来进行。在本发明优选的方面，将步骤3的溶液加热到35摄氏度，ph调节到8.0，加入三聚磷酸钠3.5重量份，并且搅拌反应4小时。本发明的方法通过对胶原蛋白进行预处理，实现了磷酸化加工的更高效进行，具有广阔的应用前景。具体实施方式除非另外地说明，本发明所使用的鳕鱼鳞片采购自本地水产加工厂的下脚料区域，其始终在0-4摄氏度下保存并且保持新鲜。实施例1在本实施例中，一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法，其包括以下步骤：（1）将10千克鳕鱼鳞片依次在清水、2%的碳酸氢钠溶液、2%的柠檬酸溶液、3%的edta溶液中清洗，每次清洗15分钟；（2）将步骤1中得到的清洗后的鳕鱼鳞片中加入蛋白酶，并且，在42摄氏度下，ph为7.2下水解4.5小时并且随后灭活，离心并且取得上清液，所述的蛋白酶是中性蛋白酶和碱性蛋白酶按照1:1-3重量比配置成的；（3）将步骤2得到的上清液脱盐，并且使用1000da的半透膜中对去离子水渗透10小时，冻干并且得到鳕鱼胶原蛋白肽干粉544克，取用100克，并且溶解到15升的水中；（4）将步骤3的溶液加热到35摄氏度，ph调节到8.0，随后加入三聚磷酸钠3.5克，并且搅拌反应4小时；（5）收集步骤4的反应液，脱盐并且冻干得到磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽。实施例2在本实施例中，一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法，其包括以下步骤：（1）将10千克鳕鱼鳞片依次在清水、5%的碳酸氢钠溶液、3%的柠檬酸溶液、1%的edta溶液中清洗，每次清洗15分钟；（2）将步骤1中得到的清洗后的鳕鱼鳞片中加入蛋白酶，并且在50摄氏度下，ph为8下水解3小时并且随后灭活，离心并且取得上清液，所述的蛋白酶是碱性蛋白酶；（3）将步骤2得到的上清液脱盐，并且使用1000da的半透膜中对去离子水渗透12小时，冻干并且得到鳕鱼胶原蛋白肽干粉459克，取用100克，并且溶解到20升的水中；（4）将步骤3的溶液加热到40摄氏度，ph调节到8.5，随后加入三聚磷酸钠5克，并且搅拌反应2小时；（5）收集步骤4的反应液，脱盐并且冻干得到磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽。实施例3在本实施例中，一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法，其包括以下步骤：（1）将10千克鳕鱼鳞片依次在清水、1%的碳酸氢钠溶液、1%的柠檬酸溶液、5%的edta溶液中清洗，每次清洗15分钟；（2）将步骤1中得到的清洗后的鳕鱼鳞片中加入蛋白酶，并且在40摄氏度下，ph为6下水解5小时并且随后灭活，离心并且取得上清液，所述的蛋白酶是中性蛋白酶；（3）将步骤2得到的上清液脱盐，并且使用凝胶排阻色谱方法除去1000da以下的成分，冻干并且得到鳕鱼胶原蛋白肽干粉551克，取用100克，并且溶解到10升的水中；（4）将步骤3的溶液加热到30摄氏度，ph调节到7.5，随后加入三聚磷酸钠1克，并且搅拌反应5小时；（5）收集步骤4的反应液，脱盐并且冻干得到磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽。对比例1在本对比例中，和实施例1的区别在于，在步骤3中不对胶原蛋白肽进行分离。得到鳕鱼胶原蛋白肽干粉605克，并且取用其中的100克进行了此后的试验。对比例2在本对比例中，和实施例1的区别在于，在步骤3中使用凝胶排阻色谱方法除去了100da以下的成分。得到鳕鱼胶原蛋白肽干粉588克，并且取用其中的100克进行了此后的试验。对比例3本对比例和实施例1的差别在于：（1）在步骤3中不对胶原蛋白肽进行分离；（2）在步骤4中，加入三聚磷酸钠7克；得到鳕鱼胶原蛋白肽干粉621克，并且取用其中的100克进行了此后的试验。对比例4本对比例和实施例1的差别在于：（1）在步骤3中不对胶原蛋白肽进行分离；（2）在步骤4中，加入三聚磷酸钠15克。得到鳕鱼胶原蛋白肽干粉597克，并且取用其中的100克进行了此后的试验。一、稳定性试验在本试验中，测定了各实施例和对比例中的胶原蛋白肽在调配口服液过程中的稳定性。取实施例1-3和对比例1-2的磷酸化改性胶原蛋白肽，以及实施例1的未经磷酸化改性的胶原蛋白肽，按照表1的配料比来进行了口服液的调配。表1：各试验组口服液的配方表试验组胶原蛋白肽选择胶原蛋白肽用量/g透明质酸/g水附加条件a01实施例1-磷酸化后7.0g1.0g93.0ml无b01实施例2-磷酸化后7.0g1.0g93.0ml无c01实施例3-磷酸化后7.0g1.0g93.0ml无d01对比例1-磷酸化后7.0g1.0g93.0ml无e01对比例2-磷酸化后7.0g1.0g93.0ml无f01实施例1-磷酸化前7.0g1.0g93.0ml无试验组a01-e01在搅拌2小时之后均得到澄清透彻的口服液，f01仍然有一定的凝絮状固体并且在搅拌12小时之后完全溶解。本领域技术人员知道，一般胶原蛋白肽的每日口服量为7克左右，而消费群体以女性为主，因此希望在尽可能少的体积内完成胶原蛋白肽的摄入。一般而言，胶原蛋白肽以100ml左右的含有透明质酸的小瓶来进行给予。由此可见，各个实施例和对比例，以及未经磷酸化处理的胶原蛋白肽都可以配置成为外观良好的饮品。考虑到女士服用对于口味的需求，还尝试了在不同ph下的饮料样品试验。在以上的a-f的基础上，对各组的胶原蛋白肽溶液各取其半，进行了充二氧化碳操作。各组的配方记录在表2中。表2：各试验组充气口服液的配方试验组胶原蛋白肽选择胶原蛋白肽用量/g透明质酸/g水附加条件a02实施例1-磷酸化后3.5g0.5g46.5ml二氧化碳饱和充气b02实施例2-磷酸化后3.5g0.5g46.5ml二氧化碳饱和充气c02实施例3-磷酸化后3.5g0.5g46.5ml二氧化碳饱和充气d02对比例1-磷酸化后3.5g0.5g46.5ml二氧化碳饱和充气e02对比例2-磷酸化后3.5g0.5g46.5ml二氧化碳饱和充气f02实施例1-磷酸化前3.5g0.5g46.5ml二氧化碳饱和充气在二氧化碳饱和充气的情况下，发现a02、b02、c02、d02、e02都保持澄清，但是f02开始出现絮状沉淀，d02出现轻微絮状沉淀。这表明在不进行磷酸化处理的情况下，在远离等电点的时候（此时ph为5.6左右）胶原蛋白肽的溶解度明显下降。除此之外，还使用柠檬酸将各组的口服液剩余的一半调节到ph为6.0，用来模拟酸味饮料的配方，并且观察了各组胶原蛋白肽溶液的状态，各组的配方参见表3：表3：各试验组酸化口服液的配方试验组胶原蛋白肽选择胶原蛋白肽用量/g透明质酸/g水附加条件a03实施例1-磷酸化后3.5g0.5g46.5ml柠檬酸调节ph到6.0b03实施例2-磷酸化后3.5g0.5g46.5ml柠檬酸调节ph到6.0c03实施例3-磷酸化后3.5g0.5g46.5ml柠檬酸调节ph到6.0d03对比例1-磷酸化后3.5g0.5g46.5ml柠檬酸调节ph到6.0e03对比例2-磷酸化后3.5g0.5g46.5ml柠檬酸调节ph到6.0f03实施例1-磷酸化前3.5g0.5g46.5ml柠檬酸调节ph到6.0观察到f03的口服液出现了明显絮状沉淀，d03出现了轻微的凝絮，c03和e03的溶液虽然没有出现凝絮，但是成为轻度半透明乳白状。其余各组仍然保持澄清。以上的试验表明，尽管胶原蛋白口服液的溶解性一般较好，但是在希望制备具有特殊口味的口服液时，就面临一定的凝絮风险。采用磷酸化处理方式有助于避免该凝絮风险的发生。并且还惊奇地发现，在同样的磷酸化水平下，不进行低分子量去除的情况下，磷酸化处理带来的抗凝絮效应就有所下降。随后将对比例3-4按照以上的方法制备成普通饮品、二氧化碳饱和充气饮品和柠檬酸调节ph到6.0的饮品，分别记录为g01、g02、g03、h01、h02和h03。其中g01和h01清澈透明，g02和g03呈现轻度半透明乳白状，而h02和h03保持清澈。这表明在不进行胶原蛋白分离的前提下，需要大大提高三聚磷酸钠的用量，也可以实现充分磷酸化的效果。二、溶解速度试验除此之外，还对各个实施例和对比例的磷酸化改性后的胶原蛋白肽，实施例1的未经磷酸化改性的胶原蛋白肽进行了溶解速度的试验。具体试验方法如下：取500ml烧杯8个，并且按照稳定性试验中的对应试验组的配方来进行投料，以相同大小的磁子在每分钟200转的速度下进行搅拌。每隔15分钟观察一次，并且记录各个时间点的胶原蛋白肽的溶解情况。其中仍有絮状固体记录为“2”，半透明乳白状记录为“1”，完全清澈记录为“0”。试验数据记录在表4中。在记录到数值“0”之后，停止对该样品的观测。表4：各试验组样品溶解速度记录从以上的溶解速度可以看出，实施例1-3的样品都可以在搅拌1小时之内完成溶解，具有很好的溶解性能。在不进行胶原蛋白分离的情况下，对比例1具有较差的溶解性能。该溶解性能随着胶原蛋白低分子量成分的除去而好转，并且也随着提高磷酸化试剂的用量而好转。不进行磷酸化的产品始终没有完全溶解。当前第1页12