基于红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-D-葡聚糖诱抗活性的果实病害控制方法与流程

本发明涉及果实采后病害防治技术领域，尤其是一种通过红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖诱导果实抗性的生物保鲜技术。

背景技术：

水果是维生素、矿物质和膳食纤维的重要来源，是人们维持身体健康，增进营养必不可少的主要食品，是世界上仅次于粮食的农产品。但是水果采后病害造成的损失巨大，根据一般保守的估计，我国水果采后损失为20％～25％左右，严重的影响了其市场供应和农民的经济收益。导致水果采后损失的因素很多，由于病原菌侵染造成的腐烂是造成水果采后损失的主要原因，其中霉菌是水果采后主要病原菌。引起水果贮藏期间腐烂的霉菌种类很多,但每种水果占优势的致病菌一般有一种。例如，苹果采后腐烂主要为扩展青霉(penicilliumexpansum)引起的青霉病及由灰葡萄(botrytiscinerea)引起的灰霉病；柑桔采后腐烂主要为意大利青霉(penicilliumitalicum)引起的青霉病和指状青霉(penicilliumdigitatum)引起的绿霉病；草莓采后腐烂主要为匍枝根霉(rhizopusstolonifer)引起的根霉病及灰葡萄孢(botrytiscinerea)引起的灰霉病等。这些病原菌主要依赖果实伤口或气孔、皮孔等天然开口而侵染。而且，病原真菌对采后水果的危害不仅在于其将导致水果在数量上造成的严重损失，而且由于许多病原真菌能分泌产生许多次生代谢产物从而引起严重的食品安全问题，如曲霉菌产生的黄曲霉毒素，扩展青霉产生的棒曲霉素，灰葡萄孢产生的葡双醛霉素等。

目前控制果实采后病害的主要方法有低温储藏和使用化学杀菌剂。低温储藏技术虽能在一定程度上延长果蔬货架期，但我国运输中的冷链技术非常不完善，且果实在冷藏过程中易发生冷害现象，严重影响果蔬的保鲜效果。长期以来，国内外对采后病害的控制主要依赖于化学杀菌剂。化学杀菌剂具有作用机理明确、效价高且效果稳定，并能控制采前潜伏感染等优点，所以直到现在仍然是控制采后病害的主要方法。但是，化学杀菌剂的长期和大量使用，严重污染环境，有损于人类健康。另一方面，长期使用单一的化学杀菌剂，病原菌可能进化形成抗药性，直接导致目前允许使用的一些杀菌剂对病害的防治效果越来越差，如thiabendazole和imazalil类杀菌剂。因此，寻找毒性低，防效高，低残留和环保的杀菌剂的替代品非常迫切。

植物在与病原菌长期共同进化的过程中，形成了一套复杂而又行之有效的防御机制，当遇到有害生物侵袭时,这种防御机制能够被诱导，进而启动一系列精细复杂的防卫反应，减轻或消除危害的发生,表现为抗性。植物抗病性不仅能够被生物因子诱导，而且能够被一些化学因子和物理因子所诱导。其中，化学激发子生产、运输、储藏方便，成本低，诱导操作简单，效果稳定，应用较为广泛。中国发明专利《一种吡啶基嘧啶醇类化合物在植物诱导抗性中的应用》申请号：201310535851.1，提供了一种吡啶基嘧啶醇类化合物在植物诱导抗性中的应用，该化合物可以明显的迅速提高植物抵抗病原菌侵染的能力。中国发明专利《一种激发水稻诱导抗虫性的方法》，申请公布号：cn105145572a，公开了一种通过氟苯氧乙酸提高水稻对稻飞風的抗性从而减轻稻飞風对水稻的危害的方法。中国发明专利《一种用于诱导烟草产生对白粉病抗性的植物提取物》，申请号：201610544509.1，公开了一种用于诱导烟草产生对白粉病抗性的植物提取物(生姜提取物、无患子提取物、海椰子提取物、地枇杷提取物)的制备方法。

β-葡聚糖是在微生物，蘑菇和植物中广泛存在的一种多糖，它是组成高等植物，酵母菌和真菌细胞壁的结构大分子之一。具较强生物活性的β-葡聚糖的重要来源之一是酵母，占细胞壁干重的35-60％。酵母葡聚糖具有广泛的生理功能，包括增强免疫力、抗感染、抗辐射和降低血脂等。中国发明专利《一种从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法》公开了一种从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法，为废酵母的综合利用开辟了一条新的途径，实现啤酒废酵母的增值增效。中国发明专利《一种抗缺血与再灌注损伤药物》，申请号01114983.3，提供了一种以(1→3)-β-d-葡聚糖为有效成分的抗缺血与再灌注损伤药物及其用途。中国发明专利《一种提高免疫力、降血脂的保健食品及其制备方法》，申请号201210516557.1，公开了一种含有酵母β-葡聚糖的具有提高免疫力、降血脂作用的保健食品。中国发明专利《高酸饮料产品和延长益生菌稳定性的方法》，申请号201080053351.9，公开了包含至少一种果汁、至少一种甜味剂、益生菌和β-葡聚糖的饮料产品，其中β-葡聚糖可以增加该产品的贮存期限。中国发明授权专利《一种降低胆固醇抗病毒饲料添加剂及其生产工艺和应用》，公开号cn101637220，公开了一种含β-葡聚糖的降低胆固醇抗病毒饲料添加剂及其生产工艺和应用。中国发明专利《含有酵母细胞提取物的植物抗病诱导剂》，申请号200410020099.8，公开了一种含有酵母细胞提取物的植物抗病诱导剂，其主要成分为(1→3)-β-d-葡聚糖，是一种抗病谱广、持效期长、安全无污染，颇具应用潜力的植物抗病诱导剂。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种不使用化学杀菌剂的条件下，采用化学激发子抑制果实采后病害的保鲜技术。

为了解决上述技术问题，本发明提出一种基于红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖诱抗活性的果实病害控制制剂：

每升制剂中含有1～5g红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖，余量为水。

注：本发明的制剂为悬浮液。

作为本发明基于红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖诱抗活性的果实病害控制制剂的改进：

每升制剂中含有2g红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖，余量为水。

作为本发明基于红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖诱抗活性的果实病害控制制剂的进一步改进：

所述红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖的制备方法如下：

s1、制备红冬孢酵母细胞壁：将红冬孢酵母细胞进行机械破碎，得红冬孢酵母细胞壁；

s2、制备红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖，包括以下步骤：

2.1、将步骤s1所得红冬孢酵母细胞壁酵母细胞壁按照1g:48～52ml的比例加入至浓度为3％(g/ml)的naoh溶液中，于70～80℃反应4～8h，反应期间每隔30±5min摇匀一次，获得反应物；

2.2、将步骤2.1所得反应物经7500～8000g条件下离心40～50min，获取沉淀物；

2.3、清洗步骤2.2所得沉淀物按照1g:48～52ml的料液比将清洗后的沉淀物加入0.5mol/l的ch3cooh溶液中，于85～95℃的水浴中水解2～4h，离心过滤；重复进行上述步骤1～2次，将最终离心过滤所得产物清洗后进行冷冻干燥(真空度0.2pa，温度-40℃，时间为36h)，获得(1→3)-β-d-葡聚糖粉末。

注：上述红冬孢酵母(rhodosporidiumpaludigenum&felltallman)保藏于英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心(internationalmycologicalinstitute,cabigeneticresourcecollection)，保藏编号：imi394084，已于专利号为200610155209.0的发明专利《一种水果蔬菜的生物保鲜剂及其制备方法》中提交保藏证明。

作为本发明基于红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖诱抗活性的果实病害控制制剂的进一步改进：

所述步骤s2制备红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖，包括以下步骤：

2.1、将红冬孢酵母细胞壁酵母细胞壁按照1g:50ml的比例加入至浓度为3％(g/ml)的naoh溶液中，于75℃反应6h，反应期间每隔30min摇匀一次；

2.2、将步骤2.1所得反应物经7800g条件下离心45min，获取沉淀物；

2.3、将步骤2.2所得沉淀物用蒸馏水清洗3遍；按照1g:50ml的料液比将清洗后的沉淀物加入0.5mol/l的ch3cooh溶液中，于90℃的水浴中水解3h，离心过滤；重复进行上述步骤1次，将最终离心过滤所得产物用蒸馏水清洗至ph为中性后进行冷冻干燥(真空度0.2pa，温度-40℃，时间为36h)，获得(1→3)-β-d-葡聚糖粉末。

注：将过滤所得沉淀代替步骤2.2所得沉淀物，重复进行上述步骤一次，即，将过滤所得沉淀再次加入等体积的0.5mol/l的ch3cooh溶液中，于90℃的水浴中水解3h，离心过滤；

为了解决上述技术问题，本发明利用上述制剂，提出一种基于红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖诱抗活性的果实病害控制方法，包括以下步骤：

将制剂接种于果实的伤口处，使其完全覆盖果实伤口，待果实伤口处制剂自然风干后，将该果实放入容器中于密封状态下保存。

注：一般病原菌侵染果实是从果实伤口的边缘处开始，故上述接种的原则是制剂可完全覆盖果实伤口处，即，当果实伤口直径为5mm，深度2mm时接种量为30μl。当果实伤口直径为3mm，深度2mm时接种量为20μl。

上述将该果实于密封保存状态下就是对其进行诱导抗性响应，本发明具体实施方式中于25℃，相对湿度90％下诱导24h，是为了说明本发明在24h时具有最佳的诱导时间。

作为本发明基于红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖诱抗活性的果实病害控制方法的改进：

待果实伤口处制剂自然风干后，将该果实放入容器中利用保鲜膜密封后，于室温(15～35℃)下保存。

作为本发明基于红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖诱抗活性的果实病害控制方法的进一步改进：

所述果实为梨果实。

本发明与现有技术相比，具有如下技术优势：

(1)本发明中所采用的红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖资源丰富、成本低廉、性价比高，容易生产、运输，具有生物可降解性；

(2)诱导抗性是植物受病虫害侵染后产生的一种自然反应，可以对病虫害产生持久和系统的广谱抗性；

(3)本发明能显著降低果实的采后病害，对环境和人体健康无任何毒害作用，具有经济实用、安全高效、环境友好等特点，具有良好的社会效益和生态效益。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为不同浓度红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖对梨果实抗青霉病诱导抗性的影响示意图；结果为接入病原菌后第3天检测而得。其中图(a)为发病率，图(b)为病斑直径；不同字母代表差异显著性(p＝0.05)。

图2为不同浓度燕麦(1→3)-β-d-葡聚糖对梨果实抗青霉病诱导抗性的影响示意图；结果为接入病原菌后第3天检测而得。其中图(a)为发病率，图(b)为病斑直径；不同字母代表差异显著性(p＝0.05)。

图3为不同浓度酿酒酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖对梨果实抗青霉病诱导抗性的影响示意图；结果为接入病原菌后第3天检测而得。其中图(a)为发病率，图(b)为病斑直径；不同字母代表差异显著性(p＝0.05)。

图4为不同浓度红冬孢酵母细胞(1→3)-β-d-葡聚糖对梨果实抗青霉病诱导抗性的影响示意图；结果为接入病原菌后第3天检测而得。其中图(a)为发病率，图(b)为病斑直径；不同字母代表差异显著性(p＝0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、基于红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖诱抗活性的果实病害控制制剂(下文中简称为制剂)，制备方法如下：

1)、红冬孢酵母细胞制备(属于现有技术)：

保藏号为imi394084的红冬孢酵母在低温(4℃)下保存在nyda培养基(牛肉浸膏8g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，琼脂20g，用水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌(0.1mpa下121℃灭菌20min)中，活化时取出；将该红冬孢酵母在nyda培养基中培养48h(25℃)，重复传代培养2次后，用接种环将活化好的红冬孢酵母接种到nydb中，在200rpm、28℃条件下培养24h后，收集培养液；

将所得培养液于3000g(离心力)离心10min收集红冬孢酵母菌体，并用无菌蒸馏水清洗3次红冬孢酵母菌体以除去残留的培养介质，获得红冬孢酵母细胞。

2)、制备红冬孢酵母细胞壁：制备红冬孢酵母细胞壁，具体步骤如下：

将步骤1)所得红冬孢酵母细胞重悬于0.2mol/l的磷酸缓冲液中(pbs，ph8.0)配制成1×10⁸cell/ml的菌悬液。向0.5ml的菌悬液中加入0.5g酸洗玻璃珠(sigma公司，粒径425-600μm)，于自动样品研磨机上(频率为70hz)研磨破碎细胞，3min/循环，处理5个循环，破碎后在冷冻离心机(4℃)中4000rpm离心10min，用无菌水洗涤8次，收集沉淀，并于121℃灭菌20min，冷冻干燥(真空度0.2pa，温度-40℃，时间为36h)后即得红冬孢酵母细胞壁。

3)、制备红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖：

3.1、将步骤2)所得红冬孢酵母细胞壁按照1:50(g/ml)的比例加入至浓度为3％(g/ml)的naoh溶液中，于75℃反应6h，反应期间每隔30min摇匀一次，获得反应物。

3.2、将步骤3.1所得反应物经7800g条件下离心45min，获取沉淀物；

3.3、将步骤3.2所得沉淀物用蒸馏水清洗3遍；按照1:50(g/ml)的料液比将清洗后的沉淀物加入至0.5mol/l的ch3cooh溶液中，于90℃的水浴中处理3h，离心过滤；

将离心过滤所得沉淀重复进行上述步骤一次，即，将该沉淀再用对应体积的0.5mol/l的ch3cooh溶液重提一次，离心过滤；

将最终离心过滤后所得产物用蒸馏水清洗至ph为中性后进行冷冻干燥(真空度0.2pa，温度-40℃，时间为36h)，获得(1→3)-β-d-葡聚糖粉末，于-20℃保存备用。

4)、利用步骤3.3所得(1→3)-β-d-葡聚糖粉末与无菌水配制获得制剂，即配置对应浓度的(1→3)-β-d-葡聚糖的菌悬液作为制剂。

本实施例中取5g(1→3)-β-d-葡聚糖粉末，加无菌蒸馏水稀释至1l，配制成浓度为0.5％的(1→3)-β-d-葡聚糖溶液。

实验1、(1→3)-β-d-葡聚糖不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响：

1、实验材料：

果实为梨，品种为水晶梨。

病原菌：扩展青霉(penicilliumexpansum)，25℃活化7天备用。

2、处理：

(1)水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％的次氯酸钠溶液中消毒2min，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

(2)用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小(5mm)和尽可能相同的深度(2mm)的伤口6个。每个伤口处分别加入等量(30μl)水(control)、以及浓度为0.01％、0.1％、0.2％、0.5％、1％浓度的(1→3)-β-d-葡聚糖溶液，在室温放置2h，使水分蒸发后，于25℃恒温、恒湿(相对湿度90％)条件下诱导24h。

本实验中以水作为对照组的制剂，分别以0.01％、0.1％、0.2％、0.5％、1％浓度的(1→3)-β-d-葡聚糖溶液作为各浓度处理组的制剂。

上述0.5％浓度的(1→3)-β-d-葡聚糖溶液为实施例1制备所得的(1→3)-β-d-葡聚糖溶液，即，表示每升(1→3)-β-d-葡聚糖溶液中含有5g(1→3)-β-d-葡聚糖，余量为水。其余处理组以此类推。

(3)在伤口处接入1×10⁴spores/ml扩展青霉penicilliumexpansum孢子悬液30μl，处理完毕后在常温下(25℃)贮藏，并用pe塑料膜密封作保湿处理，定时后观察并记录结果，对不同浓度(1→3)-β-d-葡聚糖的效力进行比较，结果以平均发病率(％)和平均病斑直径(mm)表示。选取9个果实为一组重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。

(1→3)-β-d-葡聚糖不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响如图1所示。

3、结果：

如图1所示，(1→3)-β-d-葡聚糖各浓度处理组与对照组相比，梨果实青霉病的发病情况均明显减弱，其中以(1→3)-β-d-葡聚糖浓度为0.2％的处理组效果最为明显。在接入病原菌后第3天，与对照组相比，梨果实伤口处的发病率和病斑直径分别降低70.37％和8.22mm，说明(1→3)-β-d-葡聚糖有效地减缓了青霉病的发生和发展。尽管随着(1→3)-β-d-葡聚糖浓度的增加，青霉病的抑制效果有所下降，但是与对照组相比，(1→3)-β-d-葡聚糖浓度为1％的处理组发病率和病斑直径仍下降显著。

因此，本发明0.2％的(1→3)-β-d-葡聚糖是诱导梨果实抗性的最适处理浓度。

对比实验1、将实验1中(1→3)-β-d-葡聚糖由“红冬孢酵母细胞壁制备所得(1→3)-β-d-葡聚糖”更改为“购置于杭州众芝康菇生物技术有限公司的燕麦(1→3)-β-d-葡聚糖”，其余等同于实验1。

结果如图2所示。

图2显示，来源于燕麦的(1→3)-β-d-葡聚糖不能使梨果实的青霉病腐烂得到缓解，与对照组相比，无论发病率还是病斑直径均无显著性变化。说明来源于燕麦的(1→3)-β-d-葡聚糖不能诱导梨果实的抗性。

对比实验2、将实验1中(1→3)-β-d-葡聚糖由“红冬孢酵母细胞”更改为“酿酒酵母细胞”，按照实施例1培养酿酒酵母细胞并提取酿酒酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖，其余等同于实验1。

结果如图3所示。

图3显示，酿酒酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖浓度在0.2～1.0％范围时，可以显著地抑制梨果实青霉病腐烂。当酿酒酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖浓度为0.2％时，与对照组相比，其发病率和病斑直径分别下降了44.44％和6.03mm，有效地减缓了青霉病的发生和发展。当浓度增加至1.0％时，发病率和病斑直径分别降低74.07％和8.22mm，达到其最佳抑制浓度。

对比实验3、将实验1中(1→3)-β-d-葡聚糖由“红冬孢酵母细胞壁制备所得(1→3)-β-d-葡聚糖”更改为由“红冬孢酵母细胞制备所得(1→3)-β-d-葡聚糖”，其余等同实验1。

注：红冬孢酵母细胞制备所得(1→3)-β-d-葡聚糖的方法为专利号为200410020099.8的发明专利《含有酵母细胞提取物的植物抗病诱导剂》中所提出的酵母细胞提取物(1→3)-β-d-葡聚糖的制备方法，即，将红冬孢酵母细胞代替啤酒酵母细胞进行提取。

结果如图4所示。

当红冬孢酵母细胞(1→3)-β-d-葡聚糖诱导处理24h后，梨果实伤口处的发病率发生显著性地降低，当(1→3)-β-d-葡聚糖浓度为0.2％时，与对照组相比，其发病率和病斑直径分别降低22.22％和4.44mm。(1→3)-β-d-葡聚糖浓度增加至1％时，效果达到最佳，发病率和病斑直径分别降低44.44％和7.26mm，有效地抑制了梨果实采后青霉病腐烂。

综上所述，红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖、酿酒酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖、红冬孢酵母(1→3)-β-d-葡聚糖均能够有效地抑制采后梨果实的青霉病腐烂，来源于燕麦的(1→3)-β-d-葡聚糖不能降低果实伤口处的腐烂现象。但是，酿酒酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖和红冬孢酵母(1→3)-β-d-葡聚糖浓度为0.2％时的生防效果均不如红冬孢酵母细胞壁(1→3)-β-d-葡聚糖。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。