本发明涉及生物工程
技术领域：
，尤其涉及一种具有抗衰老作用的胶原三肽复合物及其制备方法。
背景技术：
：胶原三肽是由胶原或明胶水解得到的含有三个氨基酸的小肽。水解位点通常位于y-gly的胶原酶和某些特殊蛋白酶，如蛋白酶n和蛋白酶r可水解胶原得到以gly-x-y及其寡聚体为主的胶原肽混合物。胶原水解物通过不同程度的分离纯化可以得到富含胶原三肽的混合物或者某一单体三肽。因此胶原三肽不仅可以指这种三肽混合物，也可以指某个单一的来自于胶原的三肽。胶原三肽具有易吸收的特性。人体肠道存在肽转运体pept1，能特异性转运二肽和三肽。因此胶原三肽可直接被肠道吸收或者经不完全消化后再被人体吸收。目前关于胶原三肽的吸收形式有两种理论。一种是胶原三肽只能先被水解为二肽和氨基酸后再被吸收，另一种是胶原三肽除了以次生的二肽和氨基酸被吸收外，还可以被直接吸收。如aito-inoue的研究表明gly-pro-hyp不能完整地穿透小肠上皮细胞，它通常被氨肽酶n水解为甘氨酸和pro-hyp运输进入体内。而yamamoto通过比较人体对胶原三肽和胶原多肽的吸收和尿排泄发现，胶原三肽gly-pro-hyp、gly-pro-ala、gly-ala-hyp和它们的次生二肽可以被转运进血浆并在人体稳定运输。无论何种方式吸收，胶原三肽作为小分子肽都可被人体肠道快速吸收。相比于胶原及其分子量较大的水解物，胶原三肽因为分子量小吸收更快。胶原三肽具有多种生物活性，如促进皮肤再生、促进ca2+、骨骼生长、抗氧化、抑制光老化、抗动脉粥样硬化，决定了胶原三肽可作为功能食品的原料或添加剂，提升食品的营养保健功效。胶原三肽可应用于营养补充剂、美容性食品、老年食品添加剂、青少年食品添加剂等。但现有胶原三肽进入机体中往往会被水解，难以保持生物活性，而且胶原三肽具有较强的抗氧化性能，保质时间较短，故现在需要针对胶原三肽进行保护，使其顺利进入人体被吸收利用。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种具有抗衰老作用的胶原三肽复合物及其制备方法。一种具有抗衰老作用的胶原三肽复合物制备方法，包括如下步骤：s1、将壳寡糖溶于有机酸溶液中，接着加入胶原蛋白，再加入白藜芦醇和转谷氨酰胺酶制剂，水浴振荡，冷却，调节至中性，再加入中性蛋白酶进行酶解，灭酶，干燥得到包覆壁材；s2、将有机酸锌加入水中溶解，调节ph至4-5，再加入胶原三肽，调节温度，保温，透析浓缩，干燥得到胶原三肽螯合锌；s3、将胶原三肽螯合锌加入包覆壁材中混合均匀，喷雾干燥得到具有抗衰老作用的胶原三肽复合物。壳寡糖(chito-oligosaccharid)，又名葡萄糖胺寡糖(glucosamineoligosaccharide)，是由壳聚糖水解而生成的一类低聚物，寡糖通常由2-12个单糖通过β-1,4-糖苷键连接而形成的直链或支链的低度聚合物。本发明s1中，采用壳寡糖与胶原蛋白，在转谷氨酰胺酶作用下，进行糖基化反应，胶原蛋白的分子结构部分展开，结构中的ε-氨基逐步暴露，接枝度逐渐提高，同时加入白藜芦醇进行改性，使白藜芦醇接枝在胶原蛋白-壳寡糖上，一方面提高抗氧化能力，另一方面通过白藜芦醇和壳寡糖将胶原蛋白相关酶作用点进行遮盖，避免壁材在胃部酸性条件下受到胃蛋白酶作用导致芯材被释放，接着采用中性蛋白酶进行部分酶解，产生许多可溶性小分子多肽，暴露出解离基团，使溶液中静电荷数量增加，从而减少蛋白沉淀聚集的发生，同时壳寡糖和白藜芦醇中含有丰富的羟基，提高包覆壁材的亲水性，而适度酶解将包埋于胶原蛋白内部的疏水基团暴露出来，从而达到亲/疏水平衡，一方面蛋白质疏水侧链伸展于油相中，另一方面通过羟基伸展处于水相一侧，从而降低界面张力，增强包覆壁材的两亲能力，提高其乳化能力。锌在机体中具有重要作用，可以保护皮肤健康，避免皮肤粗糙、干燥，促进伤口愈合，而且作为人体中100多种酶的组成部分，有效保障机体抗氧化的能力，防止衰老。但无机锌会与胃酸结合，产生氯化锌，对胃肠道有刺激作用，而有机酸锌还是具有一定的副作用，同时因含锌量较高，能拮抗钙铁等营养素的吸收。本发明s2中，采用胶原三肽对有机酸锌进行螯合，虽然锌含量较低，但螯合锌活性高，对人体无任何副作用，可有效促进人体对各种营养素的吸收和利用，不会拮抗钙铁等营养素的吸收，同时能进一步提高胶原三肽的抗氧化能力。本发明s3中，采用包覆壁材对胶原三肽螯合锌进行包覆，包覆壁材乳化能力强，有助降低胶原三肽复合物的粒径，可在胶原三肽螯合锌表面形成致密的阻氧隔氧屏障，有效提高所得胶原三肽复合物的抗氧化能力，延长保存时间；而且包覆壁材采用壳寡糖，提高其抗菌性能，从而进一步延长包覆壁材的寿命，延长保存时间。优选地，s1中，壳寡糖和胶原蛋白的质量比为6-10：1-1.5。优选地，s1中，壳寡糖的分子量小于等于10000。壳寡糖作为一类新的生理活性物质，由于其结构中含有丰富的游离氨基，因而溶解性得以大大提高，容易被吸收利用，且具有更强的生物活性，特别是分子量低于10000的壳寡糖更展现出独特的生理活性和功能性质。优选地，s1中，白藜芦醇与胶原蛋白的质量比为1-3：1。优选地，s1中，水浴振荡温度为30-35℃，水浴振荡时间为4-8h。优选地，s1中，再加入白藜芦醇和转谷氨酰胺酶制剂，转谷氨酰胺酶制剂的比活力为10-20u/mg，转谷氨酰胺酶制剂的活性与胶原蛋白的质量之比为30-50u/g。优选地，s1中，中性蛋白酶的比活力为3-4u/mg，中性蛋白酶的活性与胶原蛋白的质量之比为0.4-0.9u/g，酶解温度为35-40℃，酶解时间为30-50min，酶解过程中维持ph值为7.0。优选地，s1中，有机酸为乙酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸中的至少一种。优选地，s2中，有机酸锌为乙酸锌、柠檬酸锌、苹果酸锌、酒石酸锌中的至少一种。优选地，s2中，胶原三肽与锌离子的摩尔比为3-5：1。优选地，s2中，调节温度至65-85℃，保温180-300min。优选地，s2中，透析浓缩过程中采用纳滤膜进行纳滤，纳滤膜优选为截留分子量为200-300da的纳滤膜。优选地，s3中，胶原三肽螯合锌与包覆壁材的质量比为1：4-6。优选地，s3中，采用冷冻喷雾干燥；可有效避免在热环境中导致抗氧化能力的降低。一种具有抗衰老作用的胶原三肽复合物，采用上述具有抗衰老作用的胶原三肽复合物制备方法制得。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。实施例1一种具有抗衰老作用的胶原三肽复合物制备方法，包括如下步骤：s1、将60g壳寡糖溶于醋酸溶液中，接着加入15g胶原蛋白，再加入15g白藜芦醇和75mg比活力为10u/mg的转谷氨酰胺酶制剂，35℃水浴振荡4h，冷却，调节至中性，再加入1.5mg比活力为4u/mg的中性蛋白酶酶解30min，酶解温度为40℃，酶解过程中维持ph值为7.0，灭酶，干燥得到包覆壁材；s2、将1.83g醋酸锌加入水中溶解，调节ph至4-5，再加入14g胶原三肽，调节温度至65℃，保温300min，采用截留分子量为200da的纳滤膜进行透析浓缩，干燥得到胶原三肽螯合锌；经检测，胶原三肽螯合锌中锌含量为10.26％；s3、将10g胶原三肽螯合锌加入60g包覆壁材中混合均匀，50℃喷雾干燥得到具有抗衰老作用的胶原三肽复合物。实施例2一种具有抗衰老作用的胶原三肽复合物制备方法，包括如下步骤：s1、将100g壳寡糖溶于柠檬酸溶液中，接着加入10g胶原蛋白，再加入30g白藜芦醇和15mg比活力为20u/mg的转谷氨酰胺酶制剂，30℃水浴振荡8h，冷却，调节至中性，再加入3mg比活力为3u/mg的中性蛋白酶酶解50min，酶解温度为35℃，酶解过程中维持ph值为7.0，灭酶，干燥得到包覆壁材；s2、将61.04g二水合柠檬酸锌加入水中溶解，调节ph至4-5，再加入252g胶原三肽，调节温度至85℃，保温180min，采用截留分子量为280da的纳滤膜进行透析浓缩，干燥得到胶原三肽螯合锌；经检测，胶原三肽螯合锌中锌含量为17.41％；s3、将100g胶原三肽螯合锌加入400g包覆壁材中混合均匀，40℃喷雾干燥得到具有抗衰老作用的胶原三肽复合物。实施例3一种具有抗衰老作用的胶原三肽复合物制备方法，包括如下步骤：s1、将100g壳寡糖溶于苹果酸溶液中，接着加入20g胶原蛋白，再加入30g白藜芦醇和75mg比活力为12u/mg的转谷氨酰胺酶制剂，34℃水浴振荡5h，冷却，调节至中性，再加入2.70g比活力为3.7u/mg的中性蛋白酶酶解35min，酶解温度为38℃，酶解过程中维持ph值为7.0，灭酶，干燥得到包覆壁材；s2、将233.47g三水合苹果酸锌加入水中溶解，调节ph至4-5，再加入1260g胶原三肽，调节温度至70℃，保温260min，采用截留分子量为250da的纳滤膜进行透析浓缩，干燥得到胶原三肽螯合锌；经检测，胶原三肽螯合锌中锌含量为12.38％；s3、将100g胶原三肽螯合锌加入ph为7.4的磷酸盐缓冲液中，调节胶原三肽螯合锌浓度至4.5mol/l，再加入450g包覆壁材混合均匀，冷冻喷雾干燥得到具有抗衰老作用的胶原三肽复合物。实施例4一种具有抗衰老作用的胶原三肽复合物制备方法，包括如下步骤：s1、将9000g壳寡糖溶于酒石酸溶液中，接着加入1200g胶原蛋白，再加入3000g白藜芦醇和2.625g比活力为16u/mg的转谷氨酰胺酶制剂，32℃水浴振荡7h，冷却，调节至中性，再加入0.255g比活力为3.3u/mg的中性蛋白酶酶解45min，酶解温度为36℃，酶解过程中维持ph值为7.0，灭酶，干燥得到包覆壁材；s2、将2494.8g酒石酸锌加入水中溶解，调节ph至4-5，再加入9800g胶原三肽，调节温度至80℃，保温220min，采用截留分子量为250da的纳滤膜进行透析浓缩，干燥得到胶原三肽螯合锌；经检测，胶原三肽螯合锌中锌含量为15.63％；s3、将1000g胶原三肽螯合锌加入ph为7.4的磷酸盐缓冲液中，调节胶原三肽螯合锌浓度至3.5mol/l，再加入5500g包覆壁材混合均匀，冷冻喷雾干燥得到具有抗衰老作用的胶原三肽复合物。实施例5一种具有抗衰老作用的胶原三肽复合物制备方法，包括如下步骤：s1、将8kg壳寡糖溶于柠檬酸溶液中，接着加入1.3kg胶原蛋白，再加入2.6kg白藜芦醇和3.47g比活力为15u/mg的转谷氨酰胺酶制剂，33℃水浴振荡6h，冷却，调节至中性，再加入0.22g比活力为3.5u/mg的中性蛋白酶酶解40min，酶解温度为37℃，酶解过程中维持ph值为7.0，采用氯化铵进行灭酶，再用切向流超滤膜进行分离，冷冻干燥得到包覆壁材；s2、将6.1kg二水合柠檬酸锌加入水中溶解，调节ph至4-5，再加入33.6kg胶原三肽，调节温度至75℃，保温240min，采用截留分子量为350da的纳滤膜进行透析浓缩，30℃热风干燥得到胶原三肽螯合锌；经检测，胶原三肽螯合锌中锌含量为14.01％；s3、将10kg胶原三肽螯合锌加入ph为7.4的磷酸盐缓冲液中，调节胶原三肽螯合锌浓度至5mol/l，再加入50kg包覆壁材中混合均匀，冷冻喷雾干燥得到具有抗衰老作用的胶原三肽复合物。对比例1一种胶原三肽复合物制备方法，包括如下步骤：s1、将8kg壳寡糖溶于柠檬酸溶液中，接着加入1.3kg胶原蛋白，再加入3.47g比活力为15u/mg的转谷氨酰胺酶制剂，33℃水浴振荡6h，冷却，调节至中性，再加入0.22g比活力为3.5u/mg的中性蛋白酶酶解40min，酶解温度为37℃，酶解过程中维持ph值为7.0，采用氯化铵进行灭酶，再用切向流超滤膜进行分离，冷冻干燥得到包覆壁材；s2、将6.1kg二水合柠檬酸锌加入水中溶解，调节ph至4-5，再加入33.6kg胶原三肽，调节温度至75℃，保温240min，采用截留分子量为350da的纳滤膜进行透析浓缩，30℃热风干燥得到胶原三肽螯合锌；s3、将10kg胶原三肽螯合锌加入ph为7.4的磷酸盐缓冲液中，调节胶原三肽螯合锌浓度至5mol/l，再加入50kg包覆壁材中混合均匀，冷冻喷雾干燥得到胶原三肽复合物。对比例2一种胶原三肽复合物制备方法，包括如下步骤：s1、将8kg壳寡糖溶于柠檬酸溶液中，接着加入1.3kg胶原蛋白，再加入2.6kg白藜芦醇和3.47g比活力为15u/mg的转谷氨酰胺酶制剂，33℃水浴振荡6h，冷却，采用氯化铵进行灭酶，再用切向流超滤膜进行分离，冷冻干燥得到包覆壁材；s2、将6.1kg二水合柠檬酸锌加入水中溶解，调节ph至4-5，再加入33.6kg胶原三肽，调节温度至75℃，保温240min，采用截留分子量为350da的纳滤膜进行透析浓缩，30℃热风干燥得到胶原三肽螯合锌；s3、将10kg胶原三肽螯合锌加入ph为7.4的磷酸盐缓冲液中，调节胶原三肽螯合锌浓度至5mol/l，再加入50kg包覆壁材中混合均匀，冷冻喷雾干燥得到胶原三肽复合物。对比例3一种胶原三肽复合物制备方法，包括如下步骤：s1、将8kg壳寡糖溶于柠檬酸溶液中，接着加入1.3kg胶原蛋白，再加入2.6kg白藜芦醇和3.47g比活力为15u/mg的转谷氨酰胺酶制剂，33℃水浴振荡6h，冷却，采用氯化铵进行灭酶，再用切向流超滤膜进行分离，冷冻干燥得到包覆壁材；s2、将10kg胶原三肽加入ph为7.4的磷酸盐缓冲液中，调节胶原三肽螯合锌浓度至5mol/l，再加入50kg包覆壁材中混合均匀，冷冻喷雾干燥得到胶原三肽复合物。对比例4一种胶原三肽复合物制备方法，包括如下步骤：将6.1kg二水合柠檬酸锌加入水中溶解，调节ph至4-5，再加入33.6kg胶原三肽，调节温度至75℃，保温240min，采用截留分子量为350da的纳滤膜进行透析浓缩，30℃热风干燥得到胶原三肽复合物。对比例5采用胶原三肽。上述胶原三肽采用武汉天天好生物制品有限公司所售；上述胶原蛋白采用无锡贝迪生物工程有限公司所售；上述壳寡糖采用浙江金壳药业有限公司所售。由于本发明所得胶原三肽复合物具有抗衰老(主要是抗氧化)的作用，本发明采用体外抗氧化能力测试和动物体内抗氧化能力测试进行证明。采用实施例5和对比例1-4所得胶原三肽复合物、对比例5所用胶原三肽溶于去离子水中使其质量分数均为6mg/ml，接着进行体外抗氧化能力测试，具体如下：1、二苯代苦味肼基自由基(dpph·)清除率的测定：称取一定量的dpph·，用三氯甲烷配制成2mol/l的dpph·母液，使用时用无水乙醇稀释20倍，配制成0.1mmol/l。各组样品与dpph·溶液按1：1的比例混合均匀，作为样品组；各组样品与无水乙醇按1:1的比例混合均匀，作为对照组；蒸馏水与dpph·按1：1的比例混合均匀，作为空白组，室温避光反应30min，8000rpm离心10min。取上清液于517nm处测吸光值，并计算其清除率。dpph·清除率的计算公式：dpph·清除率＝1-(a样品-a对照)/a空白×100％。2、羟基自由基(·oh)清除率的测定：0.4ml各组样品加入0.4ml9mmol/l的feso4溶液、0.4ml9mmol/l的水杨酸-乙醇溶液、以及2.4ml0.1mol/lph6.6的pbs缓冲盐溶液。以等量的蒸馏水代替样品作为对照组。最后加入0.4ml8.8mmol/lh2o2启动反应，于37℃下水浴30min，8000rpm离心10min。取上清液于510nm波长下测吸光度，并计算其清除率。·oh清除率的计算公式：·oh清除率＝(a对照-a样品)/a对照×100％。3、fe2+还原能力的测定分别取0.5ml各组样品，加入0.5ml1％铁氰化钾溶液，于50℃下水浴加热20min，加入0.5ml的10％三氯乙酸溶液终止反应。8000rpm离心10min后取上清1ml，加入1ml蒸馏水，混合均匀后加入150μl0.1％的氯化铁溶液，在室温反应10min后，于700nm波长处测吸光值，a700值越大，说明样品还原能力越强。实验结果如下所示：dpph·清除率，％·oh清除率，％a700实施例582.0759.740.75对比例180.6355.310.71对比例278.3154.250.68对比例376.1452.390.66对比例473.3647.280.62对比例580.3677.360.74由上表可知：对比例5所用胶原三肽具有优异的体外抗氧化性能，对比例4所得胶原三肽复合物为胶原三肽螯合锌，与对比例5相比，胶原三肽所占质量百分比下降，而且由于锌在体外不参与酶的合成，导致对比例4所得胶原三肽复合物的抗氧化性能弱于对比例5所用胶原三肽。对比例2和对比例3相对于对比例4，所得胶原三肽复合物为微胶囊化胶原三肽，胶囊壁材为白藜芦醇和壳寡糖改性胶原蛋白，通过白藜芦醇和壳寡糖提高抗氧化性能，而且通过壁材对胶原三肽或胶原三肽螯合锌进行包覆，可在芯材表面形成致密的阻氧隔氧屏障，有效提高所得胶原三肽复合物的抗氧化能力，但与对比例4相比，其抗氧化能力仍然不足。对比例1未采用白藜芦醇改性胶原蛋白，但通过对壁材中胶原蛋白进行部分水解，将胶原蛋白中部分抗氧化基团暴露，从而提高抗氧化能力；而实施例5既采用白藜芦醇和壳寡糖改性胶原蛋白，又通过对胶原蛋白进行酶解，双管齐下使实施例5所得胶原三肽复合物的抗氧化性能与对比例5所用胶原三肽相近。采用实施例5和对比例1-4所得胶原三肽复合物、对比例5所用胶原三肽进行体内抗氧化能力测试，具体如下：实验动物共分为9组，依次正常对照组、模型组、阳性对照组、实施例5组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组、对比例5组；每组10只清洁级大鼠(雄性，体重110-130g)。其中正常对照组喂基础饲料，其它组均喂高脂饲料；高脂饲料配方：基础饲料79％(基础饲料按照gb14924.3-2010配制)、猪油10％、蛋黄粉10％、胆固醇1％。各组每天上午灌胃，正常对照组与模型组以蒸馏水灌胃，阳性对照组以荷丹片灌胃，实施例5组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组分别采用实施例5和对比例1-4所得胶原三肽复合物水溶液(300mg/kgbw)灌胃，对比例5组采用对比例5所用胶原三肽的水溶液(300mg/kgbw)灌胃。实验期间各组大鼠均自由进食和饮水。持续喂养6周后，禁食12h，取血，4℃4000rpm离心10min，制备血清。采用南京建成生物工程研究所的试剂盒对大鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)、丙二醛(mda)、超氧化物歧化酶(sod)进行测定，其结果如下：gsh-px，u/mlmda，nmol/mlsod，u/ml正常对照组197.877.91157.80模型组137.079.33123.91阳性对照组239.815.07157.11实施例5组247.285.51172.54对比例1组240.116.24167.28对比例2组236.826.77165.13对比例3组230.077.21162.04对比例4组225.437.84157.39对比例5组229.567.19161.19由上表可知：本发明以胶原三肽螯合锌为芯材，以白藜芦醇和壳寡糖改性胶原蛋白的酶解物为壁材，使胶原三肽、锌、白藜芦醇、壳寡糖和胶原蛋白酶解物共同作用，提高其在机体内的抗氧化性能，从而达到抗衰老的作用；同时以白藜芦醇和壳寡糖改性胶原蛋白的酶解物为壁材，既保证其保存时间，防止其腐败或者氧化失效，又保证其在体内仍具有生物活性，使其抗氧化能力不衰退。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12