本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种复合微生态制剂及其应用，该复合微生态制剂能够显著提高养殖动物免疫水平。
背景技术：
抗生素滥用给水产养殖业带来一系列副作用，国内外正大力禁止抗生素用于水产养殖领域，因此，寻求抗生素的替代品成为国内外学者研究的首要课题。由于复合微生态制剂具有功能多、无毒副作用、不残留、不污染环境等优点，成为较为理想的替代品之一。复合微生态制剂作为一种多功能的微生态添加剂，已被普遍的应用于水产养殖领域。其主要由活的微生物和益生元组成，兼有益生菌与益生元的双重功效。
约氏乳杆菌(lactobacillusjohnsonii)属于厚壁菌门(firmicutes)芽孢杆菌纲(bacilli)乳杆菌目(lactobacillales)乳杆菌科(lactobacillaceae)乳杆菌属(lactobacillus)。综合目前关于约氏乳杆菌的文献报道，其对动物的益生功能主要体现在以下几方面：1.约氏乳杆菌对动物天然防御系统及免疫机能具有调节作用，其具体调控位点，如tgfβ，tlr9，nf-κb，iga，往往是动物机体免疫应答反应的起始受体，因此其预防动物疾病的作用机理可能是在特定时期刺激动物免疫系统，早期激活下游免疫应答进而防止疾病发生；2.约氏乳杆菌表现出对动物皮炎的特异性预防作用。3.约氏乳杆菌对病原菌的排他性竞争作用。约氏乳杆菌对一些病原菌如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌在肠道上皮细胞上的定殖产生空间位阻，可防止病原菌对肠道上皮细胞的侵染，减少疾病发生。
此外，人参是我国特产珍贵药材，具有多种药效。人参提取物含多种活性成分，其主要有抗氧化、免疫调节、保护细胞等多种功效。当归提取物在肝损伤修复与提高机体免疫方面具有明显作用。
目前，在国内尚未见有将约氏乳杆菌作为饲料添加剂的产品，其在水产养殖上的应用也鲜见报道。将约氏乳杆菌与人参提取物、当归提取物进行复合，用其制备提高养殖动物免疫水平的饲料，来增强养殖动物抵抗力，对提高我国养殖动物养殖水平意义重大。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了养殖动物复合微生态制剂。
为了实现本发明的技术目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种复合微生态制剂，所述复合微生态制剂由约氏乳杆菌制剂、人参提取物和当归提取物组成；
其中，所述约氏乳杆菌制剂是将约氏乳杆菌发酵培养后，加入壁材，制备而成的；
所述人参提取物为人参的醇提物；
所述当归提取物为当归的水提物。
人参提取物的具体制备方法为：将人参破碎后，用65％乙醇回流提取2次，合并回流提取液后，减压回收乙醇并浓缩得稠浸膏，将稠浸膏干燥并粉碎过筛。
当归提取物的具体制备方法为：将当归破碎后，用水煎煮提取2次，合并两次提取液，将提取液减压浓缩得稠浸膏，将稠浸膏干燥并粉碎过筛。
作为优选，所述约氏乳杆菌制剂、人参提取物和当归提取物的重量比为10-100∶1-10∶1-10；
作为优选，所述约氏乳杆菌制剂、人参提取物和当归提取物的重量比为10∶1∶1。
作为优选，所述约氏乳杆菌制剂中，约氏乳杆菌的活菌数达1.0×1010cfu/g。
作为优选，所述壁材为质量比为1:10的海藻糖和多孔淀粉。
本发明提供一种养殖动物饲料，所述养殖动物饲料包括上述的复合微生态制剂。
在本发明中，并不对养殖动物饲料中的其余成分进行限制，只要在养殖动物饲料中添加本发明的复合微生态制剂就能够提高养殖动物免疫水平。比如养殖动物饲料中的基础饲料可以为：
鱼粉10-20份、豆粕15-25份、膨化大豆2-8份、花生粕20-30份、玉米蛋白粉2-5份、血球蛋白粉2-5份、面粉15-25份、虾壳粉1-3份、啤酒酵母3-6份、鱿鱼膏1-3份、鱼油0.5-1.5份、磷脂油1.5-3份、氯化胆碱0.1-0.5份、磷酸二氢钙0.5-1.5份、防霉剂0.02-0.08份、抗氧化剂0.01-0.05份、脱壳素0.01-0.02份，预混料4-6份，共计100份。
作为优选，所述复合微生态制剂在饲料中的重量比为0.1‰-10‰。
作为进一步优选，所述复合微生态制剂在饲料中的重量比为0.1‰-1‰。
本发明提供上述的复合微生态制剂在制备提高养殖动物免疫水平的饲料中的应用。
作为优选，所述养殖动物为虾。
作为优选，所述提高养殖动物免疫水平为提高养殖动物血清和肝胰腺中碱性磷酸酶(akp酶)、超氧化物歧化酶(sod酶)、酚氧化酶(po酶)活力。
本发明的复合微生态制剂能够提高养殖动物免疫水平，提高养殖动物血清和肝胰腺中碱性磷酸酶(akp酶)、超氧化物歧化酶(sod酶)、酚氧化酶(po酶)活力，对提高我国养殖动物养殖水平意义重大。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
复合微生态制剂的制备方法如下：
一、约氏乳杆菌微胶囊的制备
1)将冷冻保存的约氏乳杆菌在mrs琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10ml深层mrs液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于250mlmrs液体培养基，培养8～10小时后作为种子液；
2)以5％～10％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5l的发酵罐中培养；发酵培养基为mrs液体培养基；
3)发酵过程中维持发酵液ph值为6.0～6.5，当ph超过设定值时，补加料液；当ph低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水、koh、naoh中的任一种；在温度37～39℃、转速100rpm条件下发酵10～14小时，发酵过程不通气或通入n2，维持溶氧小于1％；
4)当补加料液ph不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值(即od600)不再增加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌发酵液；
5)壁材的溶液配制：称取壁材，将其加入蒸馏水中，壁材在水溶液中的质量体积百分比浓度为30-40％，质量的单位为g，体积的单位为ml。蒸馏水加热到93-95℃后，将壁材在其中充分搅拌，混合均匀，待冷却到室温得到壁材溶液。
所述壁材为质量比为1:10的海藻糖和多孔淀粉。
6)微胶囊制备：将4)中的约氏乳杆菌发酵液与5)中的壁材溶液按体积比为1:1-1:2的比例混合，得到混合悬浮液，将悬浮液通过低温喷雾干燥设备进行喷雾干燥，即得约氏乳杆菌微胶囊，其中，约氏乳杆菌的活菌数可达1.0×1010cfu/g。
二、人参提取物的制备
1)将人参原料破碎，过40目筛。
2)将过筛后的人参原料用65％乙醇回流提取2次，第1次用8倍重量提取2h，第2次用8倍重量提取2h，过滤。
3)减压回收乙醇(优级食用级)并继续浓缩至相对密度1.10～1.15(60℃测定)，得到稠浸膏。
4)将稠浸膏进行喷雾干燥，得干浸膏粉。将干浸膏粉粉碎，过80目筛，即得人参提取物。
三、当归提取物的制备
1)将当归破碎，过40目筛；
2)将过筛后的当归用净化水煎煮提取2次，第一次用10倍重量水煎煮提取2小时；第二次用8倍重量水煎煮提取2小时，过滤。
3)合并两次提取液，滤液减压浓缩(真空度0.08mpa，温度80℃)至相对密度为1.10-1.15(60℃测定)，得稠浸膏。
4)将稠浸膏进行喷雾干燥(泵压为0.01mpa，75℃)，得干浸膏粉。将干浸膏粉粉碎，过80目筛，即得当归提取物。
四、含约氏乳杆菌的复合微生态制剂的制备
将步骤一到步骤三中制备的约氏乳杆菌微胶囊、人参提取物、当归提取物按照质量比10-100∶1-10∶1-10的比例进行混合。
实施例1
复合微生态制剂的制备方法如下：
一、约氏乳杆菌微胶囊的制备
1)将冷冻保存的约氏乳杆菌在mrs琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10ml深层mrs液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于250mlmrs液体培养基，培养10小时后作为种子液；
2)以5％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5l的发酵罐中培养；发酵培养基为mrs液体培养基；
3)发酵过程中维持发酵液ph值为6.0，当ph超过设定值时，补加料液；当ph低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度37℃、转速100rpm条件下发酵14小时，发酵过程通入n2，维持溶氧小于1％；
4)当补加料液ph不再降低时，终止发酵，即得约氏乳杆菌发酵液；
5)壁材的溶液配制：称取壁材，将其加入蒸馏水中，壁材在水溶液中的质量体积百分比浓度为35％，质量的单位为g，体积的单位为为ml。蒸馏水加热到95℃后，将壁材在其中充分搅拌，混合均匀，待冷却到室温得到壁材溶液。
所述壁材为质量比为1:10的海藻糖和多孔淀粉。
6)微胶囊制备：将4)中的约氏乳杆菌发酵液与5)中的壁材溶液按体积1:1.5的比例混合，得到混合悬浮液，将混合悬浮液通过低温喷雾干燥设备进行喷雾干燥，即得约氏乳杆菌微胶囊，其中，约氏乳杆菌的活菌数可达1.0×1010cfu/g。
二、人参提取物的制备
1)将人参原料破碎，过40目筛。
2)将过筛后的人参原料用65％乙醇回流提取2次，第1次用8倍重量提取2h，第2次用8倍重量提取2h，过滤。
3)减压回收乙醇(优级食用级)并继续浓缩至相对密度1.15(60℃测定)，得到稠浸膏。
4)将稠浸膏进行喷雾干燥，得干浸膏粉。将干浸膏粉粉碎，过80目筛，即得人参提取物。
三、当归提取物的制备
1)将当归破碎，过40目筛；
2)将过筛后的当归用净化水煎煮提取2次，第一次用10倍重量水煎煮提取2小时；第二次用8倍重量水煎煮提取2小时，过滤。
3)合并两次提取液，滤液减压浓缩(真空度0.08mpa，温度80℃)至相对密度为1.15(60℃测定)，得稠浸膏。
4)将稠浸膏进行喷雾干燥(泵压为0.01mpa，75℃)，得干浸膏粉。将干浸膏粉粉碎，过80目筛，即得当归提取物。
四、含约氏乳杆菌的复合微生态制剂的制备
将步骤一到步骤三中制备的约氏乳杆菌微胶囊、人参提取物、当归提取物按照质量比10∶1∶1的比例进行混合。
实施例2
复合微生态制剂的制备方法如下：
一、约氏乳杆菌微胶囊的制备
1)将冷冻保存的约氏乳杆菌在mrs琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10ml深层mrs液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于250mlmrs液体培养基，培养8小时后作为种子液；
2)以8％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5l的发酵罐中培养；发酵培养基为mrs液体培养基；
3)发酵过程中维持发酵液ph值为6.5，当ph超过设定值时，补加料液；当ph低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度38℃、转速100rpm条件下发酵12小时，发酵过程通入n2，维持溶氧小于1％；
4)当发酵液在600nm波长下的吸光值(即od600)不再增加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌发酵液；
5)壁材的溶液配制：称取壁材，将其加入蒸馏水中，壁材在水溶液中的质量体积百分比浓度为30％，质量的单位为g，体积的单位为ml。蒸馏水加热到93℃后，将壁材在其中充分搅拌，混合均匀，待冷却到室温得到壁材溶液。
所述壁材为质量比为1:10的海藻糖和多孔淀粉。
6)微胶囊制备：将4)中的约氏乳杆菌发酵液与5)中的壁材溶液按体积比为1:1的比例混合，得到混合悬浮液，将混合悬浮液通过低温喷雾干燥设备进行喷雾干燥，即得约氏乳杆菌微胶囊，其中，约氏乳杆菌的活菌数可达1.0×1010cfu/g。
二、人参提取物的制备
1)将人参原料破碎，过40目筛。
2)将过筛后的人参原料用65％乙醇回流提取2次，第1次用8倍重量提取2h，第2次用8倍重量提取2h，过滤。
3)减压回收乙醇(优级食用级)并继续浓缩至相对密度1.10(60℃测定)，得到稠浸膏。
4)将稠浸膏进行喷雾干燥，得干浸膏粉。将干浸膏粉粉碎，过80目筛，即得人参提取物。
三、当归提取物的制备
1)将当归破碎，过40目筛；
2)将过筛后的当归用净化水煎煮提取2次，第一次用10倍重量水煎煮提取2小时；第二次用8倍重量水煎煮提取2小时，过滤。
3)合并两次提取液，滤液减压浓缩(真空度0.08mpa，温度80℃)至相对密度为1.10(60℃测定)，得稠浸膏。
4)将稠浸膏进行喷雾干燥(泵压为0.01mpa，75℃)，得干浸膏粉。将干浸膏粉粉碎，过80目筛，即得当归提取物。
四、含约氏乳杆菌的复合微生态制剂的制备
将步骤一到步骤三中制备的约氏乳杆菌微胶囊、人参提取物、当归提取物按照质量比100∶8∶9的比例进行混合。
实施例3
复合微生态制剂的制备方法如下：
一、约氏乳杆菌微胶囊的制备
1)将冷冻保存的约氏乳杆菌在mrs琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10ml深层mrs液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于250mlmrs液体培养基，培养9小时后作为种子液；
2)以10％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5l的发酵罐中培养；发酵培养基为mrs液体培养基；
3)发酵过程中维持发酵液ph值为6.2，当ph超过设定值时，补加料液；当ph低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度39℃、转速100rpm条件下发酵14小时，发酵过程通入n2，维持溶氧小于1％；
4)当补加料液ph不再降低时，终止发酵，即得约氏乳杆菌发酵液；
5)壁材的溶液配制：称取壁材，将其加入蒸馏水中，壁材在水溶液中的质量体积百分比浓度为40％，质量的单位为g，体积的单位为ml。蒸馏水加热到94℃后，将壁材在其中充分搅拌，混合均匀，待冷却到室温得到壁材溶液。
所述壁材为质量比为1:10的海藻糖和多孔淀粉。
6)微胶囊制备：将4)中的约氏乳杆菌发酵液与5)中的壁材溶液按体积比为1:2的比例混合，得到混合悬浮液，将混合悬浮液通过低温喷雾干燥设备进行喷雾干燥，即得约氏乳杆菌微胶囊，其中，约氏乳杆菌的活菌数可达1.0×1010cfu/g。
二、人参提取物的制备
1)将人参原料破碎，过40目筛。
2)将过筛后的人参原料用65％乙醇回流提取2次，第1次用8倍重量提取2h，第2次用8倍重量提取2h，过滤。
3)减压回收乙醇(优级食用级)并继续浓缩至相对密度1.12(60℃测定)，得到稠浸膏。
4)将稠浸膏进行喷雾干燥，得干浸膏粉。将干浸膏粉粉碎，过80目筛，即得人参提取物。
三、当归提取物的制备
1)将当归破碎，过40目筛；
2)将过筛后的当归用净化水煎煮提取2次，第一次用10倍重量水煎煮提取2小时；第二次用8倍重量水煎煮提取2小时，过滤。
3)合并两次提取液，滤液减压浓缩(真空度0.08mpa，温度80℃)至相对密度为1.12(60℃测定)，得稠浸膏。
4)将稠浸膏进行喷雾干燥(泵压为0.01mpa，75℃)，得干浸膏粉。将干浸膏粉粉碎，过80目筛，即得当归提取物。
四、含约氏乳杆菌的复合微生态制剂的制备
将步骤一到步骤三中制备的约氏乳杆菌微胶囊、人参提取物、当归提取物按照质量比50∶7∶4的比例进行混合。
对比例1
本对比例与实施例1的不同之处在于：复合微生态制剂中仅含有约氏乳杆菌微胶囊，而不含人参提取物和当归提取物。其余均与实施例1相同。
对比例2
本对比例与实施例1的不同之处在于：复合微生态制剂中仅含有人参提取物和当归提取物，而不含约氏乳杆菌微胶囊。其余均与实施例1相同。
实施例4含约氏乳杆菌的复合微生态制剂在制备提高南美白养殖动物免疫水平饲料中的应用
1、试验材料
基础饲料配方：鱼粉15％、豆粕18.7％、膨化大豆4％、花生粕20.05％、玉米蛋白粉3％、血球蛋白粉3％、面粉18.46％、虾壳粉2％、啤酒酵母5％、鱿鱼膏1.5％、鱼油0.8％、磷脂油2.1％、氯化胆碱0.3％、磷酸二氢钙1％、防霉剂0.05％、抗氧化剂0.03％、脱壳素0.01％，预混料5％。
其中，防霉剂、抗氧化剂、脱壳素、预混料均为市售，预混料为多种微量元素混合料。
按上述配方配制基础饲料，并作为对照饲料，在1kg基础饲料中分别添加实施例1中制得的复合微生态制剂1mg、10mg、100mg、1000mg、10000mg制备5种试验饲料，在1kg基础饲料中添加100mg对比例中的复合微生态制剂制备对比饲料，各种饲料原料全部粉碎过60目筛，均匀混合，挤压制粒成直径为1.0mm的颗粒，于-20℃的冰箱中保存，备用。
2、试验虾及饲养管理
6个玻璃水族箱(1.0m×0.5m×0.5m)并排放置，相互之间以暗色隔板相隔，使其相互没有干扰。每个箱中放大约100l水，水温保持在25℃，nh3-n<0.5mg/l，do>5mg/l，12小时光照，每个水族箱的光度一致。取体质量(1.00±0.01)g的健康活泼的凡纳滨养殖虾1280尾随机分为8组，每组4个重复，每个重复40尾，驯养1周，使其能够完全适应周围的环境，操作时没有惊跳反应。在实验期间，每天喂料3次，喂料时间分别为8∶30、14∶30和20∶30，日投喂率为凡纳滨养殖虾质量的10％～25％(根据虾的摄食情况来调节投喂率)。饲养周期为8周。
3、免疫指标检测
饲养结束时，随机从每个重复取10尾虾，采集虾血和剥离肝胰腺并制备血清和肝胰腺匀浆液。用相关试剂盒检测碱性磷酸酶(akp酶)、超氧化物歧化酶(sod酶)、酚氧化酶(po酶)活力。
4、结果分析
表1复合微生态制剂对南美白养殖动物血清中akp酶、sod酶、po酶活力影响
从表1可以看出随着添加量增加，血清中的akp酶、po酶活力均有增加。当饲料中添加100mg/kg时，较对照组分别增加123％和113％。当继续增大添加量时，酶活增加不明显。血清中sod酶活力随着添加量增大，酶活力有小幅增加。
表2复合微生态制剂对南美白养殖动物肝胰腺中akp酶、sod酶活力影响
从表2可以看出饲料中添加复合微生态制剂可提高肝胰腺中sod酶活力，当添加量为1000mg/kg时酶活力可达到对照2倍左右。而肝胰腺中akp酶活力受此影响较少。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。