酶解豆粕的制备方法及酶解豆粕在大口黑鲈饲料中的应用与流程

本发明属于水产动物营养与饲料
技术领域：
，具体涉及一种酶解豆粕的制备方法及酶解豆粕在大口黑鲈饲料中的应用。
背景技术：
：肉食性鱼类对饲料蛋白质的需求较高，鱼粉因蛋白质含量高、氨基酸平衡、适口性好且富含未知营养因子等特点是其饲料中最为主要的蛋白源。然而，鱼粉资源的短缺以及其价格的攀升制约着其在水产饲料中的应用。因此，不断寻求其他的蛋白质原料以替代饲料中的鱼粉成为国内外学术研究的热点。豆粕等植物性蛋白源来源广泛且价格相对低廉，同时因其蛋白质含量较高，氨基酸相对均衡等特点已在饲料中广泛应用。然而，豆粕中因含有大量的抗营养因子(如抗原蛋白、植酸、胰蛋白酶抑制因子、大豆皂甙、凝集素和非淀粉多糖)不能高比例的替代饲料中的鱼粉。尽管在饲料的加工过程中可以有效地去除热敏性的抗营养因子如胰蛋白酶抑制因子以及凝集素等，而非热敏性的抗营养因子则对营养成分的消化、吸收、代谢以及鱼类的生长健康造成不良影响。发酵法可以在一定程度上去除豆粕中的抗营养因子，但这无疑提高了豆粕的使用成本。技术实现要素：针对现有技术中的豆粕富含抗营养因子及适口性差等问题，本发明的首要目的是提供一种酶解豆粕的制备方法。本发明即针对饲料中高含量的豆粕严重影响大口黑鲈生长健康这一关键问题，通过酶解反应极大地降低豆粕中的抗营养因子含量并提高其适口性及消化吸收性，以此提高豆粕的饲用价值。本发明的第二个目的是提供一种酶解豆粕在大口黑鲈饲料中的应用。为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：一种酶解豆粕的制备方法，其包括如下步骤：(1)、将酶制剂溶解在醋酸-醋酸钠缓冲液中，得到混合物，将混合物添加到去皮豆粕中并在45-55℃下反应40-50min，之后升温至90-100℃以终止酶解反应；(2)、向步骤(1)的反应体系中加入蒸馏水，使得去皮豆粕的含量为15-20wt％，反应体系的ph值为7.5；(3)、在步骤(2)的反应体系内加入中性蛋白酶并在45-55℃下酶解6-8h，之后升温至90-100℃以终止酶解反应，冷冻干燥。优选地，步骤(1)中，酶制剂选自植酸酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶和α-半乳糖苷酶中的一种以上。优选地，步骤(1)中，醋酸-醋酸钠缓冲液的ph值为4.5-5.0。一种酶解豆粕，其由上述的制备方法得到。为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：一种豆粕复合物在大口黑鲈饲料中的应用。优选地，豆粕复合物包括酶解豆粕和基础饲料。优选地，酶解豆粕为上述的酶解豆粕，酶解豆粕的含量为15-20wt％。优选地，基础饲料包括鱼粉、虾粉、谷朊粉、血粉、玉米蛋白粉、鱿鱼膏、淀粉、啤酒酵母、鱼油、大豆磷脂油、维生素混合物、矿物质混合物、磷酸二氢钙、豆油和沸石粉。由于采用上述方案，本发明的有益效果是：第一、与现有技术生产饲料加工过程中，多是直接添加酶制剂，但配合饲料加工过程中的高温(120℃)调质流程会导致酶制剂活性的降低，同时动物消化道分泌的蛋白酶亦会降解酶制剂，而本发明利用复合酶制剂进行原料预处理，可在饲料加工前发挥酶制剂的功效，即外源复合酶制剂(植酸酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶、α-半乳糖苷酶及中性蛋白酶)的预处理可以特异性去除豆粕中所富含的植酸、非淀粉性多糖(果胶、纤维素、木聚糖)、水苏糖、棉子糖及抗原蛋白，从而避免因酶失活造成功能的无法发挥。第二、与去皮豆粕相比，本发明的酶解豆粕中通过外源酶制剂的添加从而降低豆粕中抗营养因子的含量，并提高了其蛋白质和小肽的含量，提升了豆粕的营养价值；另外，本发明的酶解豆粕具有制备简单、使用方便和成本低廉等特点。第三、与普通去皮豆粕及商品发酵豆粕相比，本发明在大口黑鲈饲料中添加酶解豆粕可以明显提高大口黑鲈的生长性能以及饲料利用率，从而极大地提高了豆粕在大口黑鲈饲料中的饲用价值。同时，酶解豆粕的应用可以明显改善大口黑鲈的免疫机能以及肠道健康，对于高性能大口黑鲈配合饲料的制备具有重要意义。附图说明图1为本发明的实施例1中去皮豆粕、复合菌种发酵豆粕、酵母菌发酵豆粕和酶解豆粕的后肠组织学结构分析示意图。具体实施方式本发明提供了一种酶解豆粕的制备方法及酶解豆粕在在大口黑鲈饲料中的应用。<酶解豆粕的制备方法>酶解豆粕的制备：去皮豆粕先经非淀粉性多糖酶和植酸酶等酶制剂进行酶解再经中性蛋白酶酶解制得。具体地，本发明的酶解豆粕的制备方法包括如下步骤：(1)、将酶制剂溶解在醋酸-醋酸钠缓冲液中并混合均匀，得到混合物，将混合物添加到去皮豆粕中使去皮豆粕的含量为50wt％并在45-55℃下反应40-50min，反应完毕升温至90-100℃使酶失活以终止酶解反应；(2)、向步骤(1)的反应体系中继续加入蒸馏水，使得去皮豆粕的含量为15-20wt％，调整反应体系的ph值为7.5；(3)、在步骤(2)的反应体系内加入中性蛋白酶并在45-55℃下酶解6-8h，中性蛋白酶的添加量为3000u/g，反应结束升温至90-100℃灭活以终止酶解反应，冷冻干燥即可。其中，在步骤(1)中，所述酶制剂选自植酸酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶和α-半乳糖苷酶中的一种以上。植酸酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶和α-半乳糖苷酶的添加量分别为10.5u/g、16.0u/g、50.0u/g、80.0u/g和0.7u/g。在步骤(1)中，醋酸-醋酸钠缓冲液的ph值为4.5-5.0。<豆粕复合物的应用>本发明的豆粕复合物可以在在大口黑鲈饲料中得以应用。其中，豆粕复合物包括酶解豆粕和基础饲料。(酶解豆粕)酶解豆粕为上述的酶解豆粕，其含量可以为15-20wt％，优选为15wt％。(基础饲料)基础饲料可以包括40wt％鱼粉、5wt％虾粉、2wt％谷朊粉、3wt％血粉、8wt％玉米蛋白粉、2wt％鱿鱼膏、5wt％淀粉、2wt％啤酒酵母、1wt％鱼油、2.5wt％大豆磷脂油、1wt％维生素混合物、1wt％矿物质混合物、1wt％磷酸二氢钙、3.5wt％豆油和8wt％沸石粉。以下结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1：酶解豆粕的制备：(1)、将植酸酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶和α-半乳糖苷酶溶解在ph为5.0的0.2mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液中混合均匀，得到混合物，植酸酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶和α-半乳糖苷酶的添加量分别为10.5u/g、16.0u/g、50.0u/g、80.0u/g和0.7u/g，称取一定质量的去皮豆粕，将混合物添加到去皮豆粕中，使去皮豆粕的含量为50wt％并在50℃下反应45min，反应完毕立即升温至90℃使酶失活以终止酶解反应。(2)、向步骤(1)的反应体系中继续加入蒸馏水，使得去皮豆粕的含量为15wt％，调整反应体系的ph值为7.5。(3)、在步骤(2)的反应体系加入中性蛋白酶并在50℃下酶解6h，中性蛋白酶的添加量为3000u/g，反应结束立即升温至90℃灭活以终止酶解反应，冷冻干燥即可。据检测，酶解豆粕中大豆球蛋白、β-伴球蛋白、水苏糖、棉子糖以及植酸等抗营养因子含量显著下降，相对小肽含量以及粗蛋白质含量明显提升(表1)。表1不同豆粕营养成分及抗营养因子含量比较实施例2：酶解豆粕在大口黑鲈配合饲料中的应用。在大口黑鲈饲料中分别等蛋白的添加去皮豆粕(15wt％)、商品复合菌种发酵豆粕(乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌复合发酵)、商品用酵母菌发酵豆粕以及上述自制酶解豆粕，配置四种等蛋白等脂肪的饲料。饲料配方如表2所示。所有低脂质原料在粉碎通过80目筛后根据饲料配方按照逐级混匀的方法进行均匀混合。此后，将已混合的饲料脂肪源(即基础饲料)与上述混合物再均匀混合并过40目筛。之后，加水揉搓均匀并过40目筛，用制粒机的2.5mm模孔进行制粒。随后，将上述饲料置于105℃烘箱中糊化15min，并在55℃烘箱中鼓风干燥。待烘干，将饲料储存于-20℃冰箱待用。选择初始体重为32.38±0.10g的大口黑鲈为研究对象，进行为期67天的养殖实验，每个处理3个重复，每个重复30尾鱼。实验数据采用平均值±标准误差表示，采用spss19.0分析软件进行单因素方差分析，以p<0.05为显著水平。表2实验饲料配方维生素复合物(iu或mg/kg干饲料)：维生素a，16000iu；维生素d3，8000iu；维生素k3，14.72；维生素b1，17.80；维生素b2，48.00；维生素b6，29.52；维生素b12，0.24；维生素e，160.00；维生素c(35％)，800.00；烟酸胺，79.20；泛酸钙，73.60；叶酸，6.40；生物素，0.64；肌醇，320.00；氯化胆碱，1500.00；l-肉碱，100.00。矿物质复合物(mg/kg干饲料)：铜(cuso4)，2.0；锌(znso4)，34.4；锰(mnso4)，6.2；铁(feso4)，21.1；碘(ca(io3)2)，1.63；硒(na2seo3)，0.18；钴(coc12)，0.24；镁(mgso4·h2o)，52.7。采用上述物质配合制成的配合饲料，选择初始体重为32.38±0.10g的大口黑鲈为实验对象，在循环水养殖系统中开展为期67天的养殖实验，每个处理3个重复，每个重复30尾鱼。测定其对大口黑鲈生长、饲料利用、非特异性免疫、血液学组织及肠组织学的影响。表3各组实验养殖结果注：表格中数据含义为平均值±标准误差，单因素方差分析中相同的字母上标表示差异不显著，即a、b、c字母表示数据在统计学中差异显著(p<0.05)。由上表可见，不同豆粕种类对大口黑鲈的成活率没有显著性影响。然而，商品用发酵豆粕以及本发明自制酶解豆粕与去皮豆粕相比显著提高了大口黑鲈的末体重和特定生长率。且酶解豆粕的促生长性能明显高于发酵豆粕。表4各组肝糖原含量及形体指标注：表格中数据含义为平均值±标准误差，单因素方差分析中相同的字母上标表示差异不显著，即a、b、c字母表示数据在统计学中差异显著(p<0.05)。由上表可见，本发明自制酶解豆粕与去皮豆粕及商品用发酵豆粕相比显著提高了大口黑鲈的饲料效率。酶解豆粕组的摄食率以及蛋白质效率最高，显著高于去皮豆粕组及酵母菌发酵豆粕组。与此同时，酶解豆粕组以及商品发酵豆粕，尤其是酶解豆粕，显著提高了饲料粗蛋白以及粗脂肪的消化率。表5各组非特异性免疫与血液学指标注：表格中数据含义为平均值±标准误差，单因素方差分析中相同的字母上标表示差异不显著，即a、b、c字母表示数据在统计学中差异显著(p<0.05)。上表中可以看出，酶解豆粕组血清溶菌酶活力最高，显著高于去皮豆粕组及酵母菌发酵豆粕组。同时，大口黑鲈血清蛋白质含量和补体活性在酶解豆粕组最高，酶解豆粕组血清蛋白质含量明显高于去皮豆粕及复合菌种发酵豆粕，且酶解豆粕组补体活性显著高于去皮豆粕组。酶解豆粕与发酵豆粕红细胞数及红细胞压积明显高于去皮豆粕组。同时，酶解豆粕及酵母菌发酵组血红蛋白含量明显高于去皮豆粕组。由图1可知，去皮豆粕组后肠(dsm-1)皱襞排列极不整齐，皱襞间质明显变宽，并有大量结缔组织，同时黏膜下层高度增加，有大量组织增生，高倍镜(dsm-2，400×)下显示，其肠黏膜皱襞呈现上皮细胞核排列不整齐，部分上皮细胞结构损坏，皱襞间质变宽并出现缝隙及杯状细胞大量增多等症状。然而发酵豆粕(fsmi、fsmii)及酶解豆粕(edsm)皱襞排列整齐，皱襞间隙较小，高倍镜下均显示上皮细胞的细胞核排列整齐，皱襞间质较窄，杯状细胞均匀分布在肠上皮细胞中。这意味着，本发明的发酵豆粕(fsmi、fsmii)及酶解豆粕(edsm)均可以显著改善去皮豆粕造成的大口黑鲈肠道损伤。因此，本发明自制酶解豆粕及商业发酵豆粕降低豆粕中抗营养因子的含量，提高大口黑鲈的生长、饲料效率、非特异性免疫及肠道健康。然而，酶解豆粕对大口黑鲈生长性能及饲料利用率的提高作用明显高于商品发酵豆粕。实施例3：为进一步验证本发明的效果，采用上述配方，用15wt％酶解豆粕的添加量制成配合饲料，对照组采用含相同含量复合菌种发酵豆粕的饲料(配方如表6)，选取60g左右的大口黑鲈，在生产性养殖池塘中用网箱开展为期16周的养殖实验，每个处理设置4个重复。实验结束后每个网箱取样20尾，测定终末体重，数据采用平均值±标准误差表示，采用spss19.0分析软件进行单因素方差分析，用t检验比较两组间的差异性，以p<0.05为显著水平。结果发现酶解豆粕处理组的生长性能明显高于含发酵豆粕的商品饲料组(表7)。由此可见，本发明的酶解豆粕可以有效地提高大口黑鲈生长性能，有效地提高大口黑鲈对豆粕的饲用价值。表6中试实验饲料配方1多维(iu或mg/kg干饲料)：维生素a，16000iu；维生素d3，8000iu；维生素k3，14.72；维生素b1，17.80；维生素b2，48.00；维生素b6，29.52；维生素b12，0.24；维生素e，160.00；维生素c(35％)，800.00；烟酸胺，79.20；泛酸钙，73.60；叶酸，6.40；生物素，0.64；肌醇，320.00；氯化胆碱，1500.00；l-肉碱，100.00。2多矿(mg/kg干饲料)：铜(cuso4)，2.0；锌(znso4)，34.4；锰(mnso4)，6.2；铁(feso4)，21.1；碘(ca(io3)2)，1.63；硒(na2seo3)，0.18；钴(coc12)，0.24；镁(mgso4·h2o)，52.7。表7中试实验大口黑鲈指标指标复合发酵豆粕组酶解豆粕组初始体重(g)65.28±1.1464.19±1.21终末体重(g)251.4±1.9268.5±1.4*特定生长率(％/d)1.20±0.021.28±0.01*肝体比(％)2.51±0.042.57±0.02脏体比(％)8.12±0.038.10±0.06肥满度2.26±0.022.21±0.03注：表中*表示组间差异显著。上述对实施例的描述是为了便于该
技术领域：
的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。当前第1页12